Un estudio de toxicidad subcrónica de 13-semanas de 2-(l-mentoxi)etanol en ratas F344

Resumen: El 2-(l-mentoxi)etanol se ha empleado con frecuencia como agente aromatizante; sin embargo, los datos sobre la toxicidad del 2-(l-mentoxi)etanol siguen siendo limitados. Realizamos una 13-semanatoxicidad subcrónicaestudio de {{0}}(l-mentoxi)etanol en ratas F344 machos y hembras, con dosis de 0, 15, 60 o 250 mg/kg de peso corporal (PC)/día administradas por vía oral mediante sonda aceite de maíz como vehículo. No se observaron cambios toxicológicos significativos en el estado general, el peso corporal o la ingesta de alimentos en ningún grupo. La evaluación hematológica mostródisminución de la hemoglobina,hematocrito, volumen corpuscular medio y hemoglobina corpuscular media y aumento del recuento de plaquetas en el grupo masculino de 250 mg/kg.Bioquímica séricarevelócolesterol total elevadoen el grupo de 250 mg/kg de ratas macho y hembra, redujo los triglicéridos en el grupo de hembras de 250 mg/kg y aumentó la proteína total en el grupo de machos de 250 mg/kg, lo que indica efectos sobremetabolismo de los lípidosysíntesis de proteínas. Para el peso de los órganos, los pesos absoluto y relativo del hígado y las glándulas suprarrenales aumentaron en el grupo de 250 mg/kg de ambos sexos y en el grupo masculino de 250 mg/kg, respectivamente. El análisis histopatológico mostrónefropatía crónicaen los grupos masculinos de 15 mg/kg o más, con aumento del peso absoluto y relativo de los riñones, así como creatinina sérica elevada, en los grupos masculinos de 60 y 250 mg/kg. Sin embargo, se identificaron gránulos eosinófilos que contenían 2u-globulina en los túbulos proximales, lo que sugiere una nefropatía por 2u-globulina específica de ratas macho y sin importancia toxicológica. Estos resultados indicaron que el nivel sin efectos adversos observados de 2-(l-metoxi)etanol fue de 60 mg/kg de peso corporal/día para ambos sexos. (DOI: 10,1293/tox.2020-0091; J Toxicol Pathol 2021; 34: 309–317)

Palabras clave: 2-(l-mentoxi)etanol, 2-l-mentoxietanol, aditivo alimentario, agente aromatizante, rata Fischer, mentol

Suplemento Cistanche Suplemento de apoyo a la función renal PhGs75% Ech 30% Act 12%

Introducción

El {{0}}(l-mentoxi)etanol (Nº CAS 38618-23-4) es un líquido transparente e incoloro con un olor característico y se utiliza ampliamente como agente aromatizante. El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) ha evaluado el 2-(l-mentoxi)etanol como agente aromatizante, categorizado como sustancias estructuralmente relacionadas con el mentol1. Según la clase estructural de agentes aromatizantes, el 2-(l-mentoxi)etanol se asignó a la Clase I. En los Estados Unidos y Europa, los niveles de ingesta de 2-(l-mentoxi)etanol por parte de los seres humanos se estimaron en 12 ug/persona/día y 0,01 ug/persona/día, respectivamente, ambos por debajo del umbral de Clase I de 1.800 ug/persona/día. Con base en estas estimaciones, se considera que el 2-(l-mentoxi)etanol puede no presentar problemas de seguridad durante el uso rutinario como agente aromatizante.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg de peso corporal [PC])1. A pesar del uso de 2-(1-mentoxi)etanol como agente aromatizante, se dispone de datos limitados sobre la toxicidad de dosis repetidas de este compuesto. Nuestro laboratorio ha investigado la toxicidad de varios aditivos alimentarios, incluidos agentes aromatizantes representativos de cada categoría, en modelos de roedores2–7. Para aclarar el perfil toxicológico y establecer un nivel sin efectos adversos observados (NOAEL), realizamos un estudio de toxicidad subcrónica de 13-semanas de 2-(l-mentoxi)etanol, que se administró por vía oral a F344 ratas mediante alimentación forzada.

Materiales y métodos

Producto de prueba

2-(1-Mentoxi)etanol (Lote nº 5I0002, pureza 99,9%) producido por Takasago Int. Corp. (Tokio, Japón) fue proporcionado por la División de Normas y Evaluación, Departamento de Seguridad Alimentaria, Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón, con el apoyo de la Asociación Japonesa de Materiales de Sabor y Fragancia (Tokio, Japón). Aunque la sustancia de prueba se proporcionó como una mezcla de isómeros ópticos (N° CAS 38618-23-4), el fabricante confirmó que era el enantiómero L (N° CAS 75443-64-0). Se seleccionó como vía de administración la sonda oral con aceite de maíz (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) como vehículo debido a la insolubilidad acuosa y la volatilidad del 2-(l-mentoxi)etanol. Se prepararon diariamente soluciones de 2-(1-mentoxi)etanol, inmediatamente antes de la administración. Después de almacenamiento durante 2 h a temperatura ambiente, se confirmó que las proporciones residuales de 2-(l-mentoxi)etanol en solución de 4, 40 y 400 mg/ml eran 96,8 %, 99,8 % y 96,5 %, respectivamente. mediante cromatografía de gases (Asociación Japonesa de Inspección de Alimentos y Medio Ambiente de la Industria Alimentaria, Tokio, Japón).

Animales de experimentación

En total, se compraron 40 ratas machos y 40 hembras libres de patógenos específicos (F344/DuCrlCrlj, 5-semanas de edad) de Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japón) y se utilizaron después de la aclimatación durante una semana. Durante el estudio, los animales se alojaron en jaulas de policarbonato con lecho de virutas blandas, se mantuvieron en una habitación con un sistema de barrera para controlar el ciclo de luz/oscuridad (12 h), ventilación (tasa de intercambio de aire de 18 veces/h), temperatura ( 24 ± 1 grado), y humedad relativa (55 ± 5%). Las jaulas y el lecho de virutas se reemplazaron dos veces por semana. Cada animal tuvo libre acceso a agua del grifo y a una dieta basal (CRF-1; Oriental Yeast, Tokio, Japón). Al comienzo del experimento, los animales se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos de 10 ratas machos y hembras cada uno, basándose en los pesos corporales medidos inmediatamente antes de comenzar el tratamiento con la sustancia problema.

Diseño del estudio

En un estudio preliminar de {{0}}días que evaluó el 2-(l-mentoxi)etanol administrado en dosis de 0, 200, 400 y 800 mg/kg de peso corporal/día, absoluto y los pesos relativos del hígado aumentaron significativamente en todos los grupos tratados de ambos sexos (datos no mostrados). Con base en estos resultados, seleccionamos dosis de 2-(l-mentoxi)etanol de 0, 15, 60 y 250 mg/kg de peso corporal/día para su administración a ratas macho y hembra en el presente 13- estudio de toxicidad semanal

Diariamente se evaluaron las condiciones generales y la mortalidad. Los pesos corporales, así como las cantidades de dieta suministrada y residual, se midieron una vez por semana durante el período experimental. Todas las ratas permanecieron en ayunas durante la noche al completar el tratamiento, y se recogieron muestras de sangre para hematología y bioquímica sérica de la aorta abdominal bajo anestesia por inhalación profunda utilizando isoflurano. El diseño del estudio estuvo de acuerdo con las Directrices para la designación de aditivos alimentarios y la revisión de las normas para el uso de aditivos alimentarios de Japón (1996) y fue aprobado por el Comité de utilización y cuidado de animales del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud de Japón.

Hematología y bioquímica sérica.

Los siguientes parámetros hematológicos se analizaron utilizando analizadores de hematología automáticos ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, EE. UU.): recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de glóbulos rojos (RBC), concentración de hemoglobina (HGB), hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), recuento de plaquetas (PLT) y células leucocitarias diferenciales, incluidos neutrófilos (Neut), linfocitos (Lymph), monocitos (Mono), eosinófilos (Eosino) y basófilos (Baso). Oriental Yeast realizó el análisis bioquímico del suero para los siguientes parámetros: proteína total (TP), albúmina (Alb), relación albúmina/globulina (A/G), bilirrubina total (Bil), glucosa, colesterol total (T-Chol), triglicéridos (TG), nitrógeno ureico (BUN), creatinina (Cre), calcio (Ca), fósforo inorgánico (IP), sodio (Na), potasio (K), cloro (Cl), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (ALP) y -glutamil transpeptidasa (-GTP).

Pesos de órganos y evaluación histopatológica.

Se realizó una necropsia completa a todos los animales y se pesó el cerebro, timo, pulmones, corazón, bazo, hígado, glándulas suprarrenales, riñones, testículos y ovarios. Estos órganos, así como los tejidos de la médula espinal, el nervio trigémino, la glándula pituitaria, la cavidad nasal, las glándulas salivales, la lengua, el esófago, la tráquea, la aorta, la glándula tiroides, la glándula paratiroides, el páncreas, el estómago, los intestinos delgado y grueso, submandibular y mesentérico. los ganglios linfáticos, la vagina, el útero, la vejiga urinaria, la próstata, las vesículas seminales, el epidídimo, el fémur y el esternón con la médula ósea, las vértebras, los músculos esqueléticos, el nervio ciático, la piel y la glándula mamaria se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%; luego, se prepararon secciones incluidas en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina para su examen histopatológico. Los testículos y los ojos con glándulas de Harder se fijaron en fijador de Bouin y solución de Davidson, respectivamente. Los tejidos óseos, incluida la cavidad nasal, las vértebras, el esternón y el fémur, se descalcificaron utilizando una mezcla de ácido fórmico al 10 % y formalina tamponada al 10 % durante un máximo de 2 semanas. Se realizó una evaluación histopatológica de todos los tejidos obtenidos de animales en el grupo de control y al grupo se le administró la dosis más alta a menos que se observara alguna lesión relacionada con el tratamiento.

Inmunohistoquímica para 2u-globulina

En ratas macho, se examinó la acumulación de 2u-globulina en el riñón mediante análisis inmunohistoquímico de secciones incluidas en parafina. Para la recuperación de antígenos, las secciones obtenidas de 5 ratas en cada grupo se incubaron con proteinasa K (DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 1 min a temperatura ambiente. Todas las secciones se sumergieron en una solución de H2O2/metanol al 3% durante 10 minutos a temperatura ambiente para la inactivación de la actividad de la peroxidasa endógena. Después de bloquear reacciones inespecíficas con suero de conejo normal al 10%, las secciones se incubaron con un anticuerpo primario para 2u-globulina (diluido 1:400; anticuerpo anti-2u-globulina de rata; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) durante la noche a 4 grados. 8. La visualización de la unión del anticuerpo se realizó utilizando un kit Vecta Stain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y 3,3′-diaminobencidina. Todas las secciones fueron sobreentintadas con hematoxilina.

análisis estadístico

Se evaluó la homogeneidad de las variaciones en los valores de los datos de peso corporal durante el período experimental, así como de hematología, bioquímica sérica y peso de órganos, mediante la prueba de Bartlett. Se empleó un análisis de varianza unidireccional y la prueba de Kruskal-Wallis, respectivamente, para datos homogéneos y heterogéneos. Para determinar las diferencias estadísticamente significativas, se utilizó la prueba de comparación múltiple de Dunnett para comparar los grupos de control y de tratamiento. Las comparaciones de incidencias y grados histopatológicos se analizaron utilizando la prueba de probabilidad exacta de Fisher y la prueba U de Mann-Whitney, respectivamente. valores p de<0.05 were considered statistically significant.