Un estudio de toxicidad subcrónica de 13-semanas de 2-(l-mentoxi)etanol en ratas F344

Introducción

2-(1-mentoxi)etanol (CAS No. 38618-23-4) es un líquido transparente e incoloro con un olor característico y se usa ampliamente como agente aromatizante. El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) ha evaluado 2-(l-metoxi)etanol como agente aromatizante, clasificado como sustancias estructuralmente relacionadas con el mentol1. Según la clase estructural de agentes aromatizantes, 2-(l-metoxi)etanol fue asignado a la Clase I. En Estados Unidos y Europa, los niveles de ingesta de 2-(l-metoxi)etanol por humanos se estimó en 12 ug/persona/día y 0.01 ug/persona/día, respectivamente, ambos por debajo del umbral de Clase I de 1.800 ug/persona/día. Con base en estas estimaciones, se considera que 2-(1-mentoxi)El etanol puede no presentar problemas de seguridad durante el uso rutinario como agente aromatizante.

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As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg de peso corporal [PC])1. A pesar del uso de 2-(1-mentoxi)etanol como agente aromatizante, se dispone de datos limitados sobre la toxicidad de dosis repetidas de este compuesto. Nuestro laboratorio ha investigado la toxicidad de varios aditivos alimentarios, incluidos agentes aromatizantes representativos de cada categoría, en modelos de roedores2–7. Para aclarar el perfil toxicológico y establecer un nivel sin efectos adversos observados (NOAEL), realizamos un estudio de toxicidad subcrónica de 13-semanas de 2-(1-mentoxi)etanol, que fue administrado por vía oral a ratas F344 mediante alimentación forzada.

Materiales y métodos

Producto de prueba

2-(1-mentoxi)etanol (Lote nº 5I0002, pureza 99,9%) producido por Takasago Int. Corp. (Tokio, Japón) fue proporcionado por la División de Normas y Evaluación, Departamento de Seguridad Alimentaria, Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón, con el apoyo de la Asociación Japonesa de Materiales de Sabor y Fragancia (Tokio, Japón). Aunque la sustancia de prueba se proporcionó como una mezcla de isómeros ópticos (N° CAS 38618-23-4), el fabricante confirmó que era el enantiómero L (N° CAS 75443-64-0). Se seleccionó la sonda oral con aceite de maíz (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) como vehículo como vía de administración debido a la insolubilidad acuosa y la volatilidad del 2-(1-mentoxi)etanol. Se prepararon diariamente soluciones de 2-(1-mentoxi)etanol, inmediatamente antes de la administración. Después de almacenamiento durante 2 h a temperatura ambiente, se confirmó que las proporciones residuales de 2-(1-mentoxi)etanol en solución de 4, 40 y 400 mg/ml eran 96,8 %, 99,8 % y 96,5 %. , respectivamente, mediante cromatografía de gases (Asociación Japonesa de Inspección de Alimentos y Medio Ambiente de la Industria Alimentaria, Tokio, Japón).

Animales de experimentación

En total, se compraron 40 ratas macho y 40 hembras libres de patógenos específicos (F344/DuCrlCrlj, 5 semanas) de Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japón) y se utilizaron después de la aclimatación durante una semana. Durante el estudio, los animales se alojaron en jaulas de policarbonato con lecho de virutas blandas, se mantuvieron en una habitación con un sistema de barrera para controlar el ciclo de luz/oscuridad (12 h), ventilación (tasa de intercambio de aire de 18 veces/h), temperatura ( 24 ± 1 grado), y humedad relativa (55 ± 5%). Las jaulas y el lecho de virutas se reemplazaron dos veces por semana. Cada animal tuvo libre acceso a agua del grifo y a una dieta basal (CRF-1; Oriental Yeast, Tokio, Japón). Al comienzo del experimento, los animales se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos de 10 ratas machos y hembras cada uno, basándose en los pesos corporales medidos inmediatamente antes de comenzar el tratamiento con la sustancia problema.

Diseño del estudio

En un estudio preliminar de {{0}}días que evaluó el 2-(1-mentoxi)etanol administrado en dosis de 0, 200, 400 y 800 mg/ kg de peso corporal/ El día, el peso absoluto y relativo del hígado aumentó significativamente en todos los grupos tratados de ambos sexos (datos no mostrados). Con base en estos resultados, seleccionamos dosis de 2-(1-mentoxi)etanol de 0, 15, 60 y 250 mg/kg de peso corporal/día para su administración a ratas macho y hembra en el presente {{ Estudio de toxicidad de 13}}semanas.

Diariamente se evaluaron las condiciones generales y la mortalidad. Los pesos corporales, así como las cantidades de dieta suministrada y residual, se midieron una vez por semana durante el período experimental. Todas las ratas permanecieron en ayunas durante la noche al completar el tratamiento, y se recogieron muestras de sangre para hematología y bioquímica sérica de la aorta abdominal bajo anestesia por inhalación profunda utilizando isoflurano. El diseño del estudio se basó en las Directrices para la designación de aditivos alimentarios y la revisión de las normas para el uso de aditivos alimentarios de Japón (1996) y fue aprobado por el Comité de utilización y cuidado de animales del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud de Japón.

Hematología y bioquímica sérica.

Los siguientes parámetros hematológicos se analizaron utilizando analizadores de hematología automáticos ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, EE. UU.): recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de glóbulos rojos (RBC), concentración de hemoglobina (HGB), hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), recuento de plaquetas (PLT) y células leucocitarias diferenciales, incluidos neutrófilos (Neut), linfocitos (Lymph), monocitos (Mono), eosinófilos (Eosino) y basófilos (Baso). Oriental Yeast realizó el análisis bioquímico del suero para los siguientes parámetros: proteína total (TP), albúmina (Alb), relación albúmina/globulina (A/G), bilirrubina total (Bil), glucosa, colesterol total (T-Chol), triglicéridos (TG), nitrógeno ureico (BUN), creatinina (Cre), calcio (Ca), fósforo inorgánico (IP), sodio (Na), potasio (K), cloro (Cl), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (ALP) y -glutamil transpeptidasa (-GTP).

Pesos de órganos y evaluación histopatológica.

Se realizó una necropsia completa a todos los animales y se pesó el cerebro, timo, pulmones, corazón, bazo, hígado, glándulas suprarrenales, riñones, testículos y ovarios. Estos órganos, así como los tejidos de la médula espinal, el nervio trigémino, la glándula pituitaria, la cavidad nasal, las glándulas salivales, la lengua, el esófago, la tráquea, la aorta, la glándula tiroides, la glándula paratiroides, el páncreas, el estómago, los intestinos delgado y grueso, submandibular y mesentérico. los ganglios linfáticos, la vagina, el útero, la vejiga urinaria, la próstata, las vesículas seminales, el epidídimo, el fémur y el esternón con la médula ósea, las vértebras, los músculos esqueléticos, el nervio ciático, la piel y la glándula mamaria se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%; luego, se prepararon secciones incluidas en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina para su examen histopatológico. Los testículos y los ojos con glándulas de Harder se fijaron en fijador de Bouin y solución de Davidson, respectivamente. Los tejidos óseos, incluida la cavidad nasal, las vértebras, el esternón y el fémur, se descalcificaron utilizando una mezcla de ácido fórmico al 10 % y formalina tamponada al 10 % durante un máximo de 2 semanas. Se realizó una evaluación histopatológica de todos los tejidos obtenidos de animales en el grupo de control y al grupo se le administró la dosis más alta a menos que se observara alguna lesión relacionada con el tratamiento.

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Inmunohistoquímica para 2u-globulina

En ratas macho, se examinó la acumulación de 2u-globulina en el riñón mediante análisis inmunohistoquímico de secciones incluidas en parafina. Para la recuperación de antígenos, las secciones obtenidas de 5 ratas en cada grupo se incubaron con proteinasa K (DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 1 min a temperatura ambiente. Todas las secciones se sumergieron en una solución de H2O2/metanol al 3% durante 10 minutos a temperatura ambiente para la inactivación de la actividad de la peroxidasa endógena. Después de bloquear las reacciones inespecíficas con suero de conejo normal al 10%, las secciones se incubaron con un anticuerpo primario para 2uglobulina (diluido 1:400; anticuerpo anti-2u-globulina de rata; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) durante la noche a 4 grados 8. La visualización de la unión del anticuerpo se realizó utilizando un kit VectaStain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y 3,3′-diaminobencidina. Todas las secciones fueron sobreentintadas con hematoxilina.

análisis estadístico

Se evaluó la homogeneidad de las variaciones en los valores de los datos de peso corporal durante el período experimental, así como de hematología, bioquímica sérica y peso de órganos, mediante la prueba de Bartlett. Se empleó un análisis de varianza unidireccional y la prueba de Kruskal-Wallis, respectivamente, para datos homogéneos y heterogéneos. Para determinar las diferencias estadísticamente significativas, se utilizó la prueba de comparación múltiple de Dunnett para comparar los grupos de control y de tratamiento. Las comparaciones de incidencias y grados histopatológicos se analizaron utilizando la prueba de probabilidad exacta de Fisher y la prueba U de Mann-Whitney, respectivamente. valores p de<0.05 were considered statistically significant.

Resultados

Parámetros en vida, hematología y bioquímica sérica.

No se observaron signos clínicos significativos durante todo el período experimental y todos los animales sobrevivieron hasta la necropsia programada. Además, no se observaron diferencias significativas en el peso corporal y la ingesta diaria de alimentos en ratas macho y hembra (Fig. 1A y B).

Los datos de hematología y bioquímica sérica se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente. Los análisis hematológicos revelaron una disminución significativa de HGB, HCT, MCV y MCH y un aumento de PLT en ratas macho a las que se les administraron 250 mg/kg BW/día de 2-(1-mentoxi)etanol (Tabla 1). En la bioquímica sérica, se observaron aumentos significativos en TP, T-Chol y Ca y disminuciones en Bil y ALP en los machos del grupo de 250 mg/kg (Tabla 2). Se observó un aumento significativo de Cre y una disminución de A/G en los machos de los grupos de 60 y 250 mg/kg. En las mujeres, se registró un aumento significativo de Ca y una disminución de ALP en los grupos de 60 y 250 mg/kg, mientras que se detectaron niveles elevados de T-Col y reducción de A/G, Bil, TG, AST y ALT en el grupo de 250 mg. /kg grupo. Aunque se observó un aumento significativo de TG y una disminución de Cl en los hombres a los que se les administraron 60 mg/kg, la falta de una relación de dosis sugirió que estas diferencias no estaban asociadas con la exposición a la sustancia de prueba.

Pesos de órganos

Los datos sobre el peso de los órganos se resumen en la Tabla 3. Los pesos absolutos y relativos del hígado aumentaron significativamente en ambos sexos del grupo de 250 mg/kg (Tabla 3). Se observó un aumento significativo en el peso relativo del hígado en los machos del grupo de 60 mg/kg. En los hombres, el peso absoluto y relativo de los riñones aumentó significativamente en los grupos de 60 y 250 mg/kg. En el grupo masculino de 250 mg/kg, se observaron aumentos significativos en los pesos absolutos y relativos de las glándulas suprarrenales y en los pesos relativos del bazo y los testículos.

Histopatología e inmunohistoquímica.

Los datos de los hallazgos histopatológicos e inmunohistoquímicos se resumen en las Tablas 4 y 5, respectivamente. Los hallazgos histopatológicos revelaron que la frecuencia de acumulación de gránulos eosinófilos (Fig. 2A-D), túbulos basófilos y cilindros hialinos, así como inflamación intersticial focal en el riñón, aumentaron significativamente en los grupos de tratamiento exclusivamente masculinos en comparación con el grupo control. grupo (Tabla 4). Según los análisis inmunohistoquímicos, las ratas macho tratadas con la sustancia de prueba presentaron un aumento en la inmunorreactividad de la 2u-globulina en las células epiteliales de los túbulos proximales, lo que demuestra una clara dependencia de la dosis (Fig. 2E-H) (Tabla 5).

En la necropsia, una rata macho del grupo de 250 mg/kg mostró un agrandamiento severo del riñón derecho debido a un nefroblastoma histológicamente característico. Aunque el nefroblastoma es poco común en la mayoría de las estirpes de ratas9, este caso se consideró incidental, ya que ningún otro animal presentó lesiones similares. Además, en estudios de carcinogenicidad oral, la incidencia de nefroblastoma espontáneo en ratas macho F344/DuCrlCrlj osciló entre 0-2,0%10. Aunque se detectaron esporádicamente varias lesiones en otros órganos, no se observaron alteraciones significativas dependientes del tratamiento en la incidencia de estas lesiones.

Discusión

Hasta la fecha, el JECFA ha evaluado 24 agentes aromatizantes, incluido el 2-(1-mentoxi)etanol, como sustancias estructuralmente relacionadas con el mentol, y todos figuran como "sin riesgo de seguridad" en los niveles estimados actuales. de ingesta1, 11. El 2-(1-mentoxi)etanol se clasifica en un subgrupo de alcoholes o éteres alicíclicos y se considera que está conjugado principalmente con ácido glucurónico, seguido de la excreción urinaria1. Aunque los valores de DL50 oral de estas sustancias en roedores son relativamente altos, los datos de estudios de toxicidad de dosis repetidas siguen siendo limitados. Un estudio de toxicidad de dosis repetidas de 13-semanas ha revelado que el carboxilato de pirrolidona de mentilo (n.º CAS 68127-22-0), un compuesto estructuralmente relacionado con el mentol, puede estar asociado con un aumento del peso relativo del hígado y los riñones en hombres y mujeres. Ratas Wistar. También se observó acumulación de 2u-globulina en los túbulos proximales de ratas macho a una dosis de 1.111 mg/kg de peso corporal/día, y el NOAEL se determinó en 109 mg/kg de peso corporal/día1.

En el presente estudio de toxicidad subcrónica de 13-semanas de 2-(1-mentoxi)etanol, no se observaron cambios toxicológicos en el estado general, el peso corporal ni la ingesta de alimentos. Tras la evaluación hematológica, observamos una disminución de HGB (96,6 % con respecto a los valores medios de control), HCT (96,3 %), MCV (98,4 %) y MCH (98,2 %) y un aumento de PLT (111 %) en el sexo masculino. grupo de 250 mg/kg, que se consideraron influencias toxicológicas del tratamiento con 2-(1-mentoxi)etanol. Tanto el peso absoluto (115% en ambos sexos) como el relativo (119% en hombres y 111% en mujeres) aumentaron significativamente en ambos sexos en los grupos de 250 mg/kg. Aunque no hubo cambios histopatológicos en el hígado, se observaron aumentos en los niveles séricos de T-Chol (110% en hombres y 121% en mujeres) y TP (105% en hombres) y reducción de TG (60,1% en mujeres) en los 250 Los grupos mg/kg indican cambios tóxicos asociados con el metabolismo de los lípidos y la síntesis de proteínas en el hígado. También se detectaron niveles reducidos de HGB y MCH y niveles elevados de PLT, T-Chol y TP en los hombres, y una disminución de los TG y un aumento del peso absoluto y relativo del hígado en ambos sexos, con significación estadística en el estudio preliminar de 28- días (datos no mostrados). ), corroborando que estos parámetros hematológicos y bioquímicos séricos alterados, así como el peso del hígado, no fueron efectos incidentales sino relacionados con las sustancias de prueba. Por el contrario, el aumento significativo en el peso relativo del hígado detectado en el grupo masculino de 60 mg/kg en el presente estudio no estuvo acompañado por un aumento en el peso absoluto o cambios en los parámetros bioquímicos relacionados, lo que sugiere que este aumento fue un cambio adaptativo.

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Se consideró que un aumento significativo del peso absoluto (120 %) y relativo (118 %) de las glándulas suprarrenales en el grupo masculino de 250 mg/kg estaba asociado con la sustancia problema. Además, el aumento del peso absoluto y relativo de las glándulas suprarrenales en ambos sexos mostró una clara dependencia de la dosis en el estudio preliminar de 28-días (datos no mostrados), lo que indica la asociación con el tratamiento con la sustancia problema. Aunque la hipertrofia suprarrenal podría deberse al estrés, no hubo hallazgos que sugirieran estrés, como reducción del aumento de peso corporal o atrofia del timo y otros órganos linfoides, ni en el estudio actual ni en el preliminar. Dado que puede no haber cambios histopatológicos en la glándula suprarrenal incluso con una producción alterada de glucocorticoides en casos de inhibición de las enzimas relacionadas con la esteroidogénesis12, no se puede excluir la posibilidad de que el aumento de peso de la glándula suprarrenal sea un hallazgo tóxico. Por el contrario, el aumento del peso relativo del bazo y los testículos en el grupo masculino de 250 mg/kg, que no se observó en el estudio preliminar, se consideró toxicológicamente insignificante debido a la ausencia de lesiones histopatológicas o al aumento significativo del peso absoluto. Asimismo, la bioquímica sérica reveló una disminución de A/G y un aumento de Ca en ambos sexos, lo que se consideró que no tenía importancia toxicológica, ya que no se detectaron anomalías en los parámetros relacionados. Además, la disminución de los niveles de Bil y ALP en ambos sexos y la disminución de AST y ALT en las mujeres contrastaron con los efectos tóxicos esperados y no se consideraron significativos.

Se observó nefropatía crónica caracterizada por túbulos basófilos, cilindros hialinos e inflamación intersticial focal con significación estadística en los hombres de todos los grupos tratados. Además, se detectó un aumento de la Cre sérica y del peso absoluto y relativo de los riñones en los grupos masculinos de 60 y 250 mg/kg; Estos cambios no se observaron en los grupos de tratamiento femeninos. En estos casos, el grado de acumulación de gránulos eosinófilos en las células epiteliales del túbulo proximal aumentó de una manera aparentemente dependiente de la dosis. Estos gránulos se confirmaron como 2u-globulina mediante inmunohistoquímica, lo que indica la aparición de nefropatía por 2u-globulina. Las 2u-globulinas unidas a ciertas sustancias químicas, como el d-limoneno, se acumulan en los lisosomas y se observan en los túbulos proximales como gránulos eosinofílicos o hialinos9. Esta acumulación puede dañar las células epiteliales, provocando una nefropatía crónica progresiva y la consiguiente formación de tumores9. Por lo tanto, aunque no se identificó el NOAEL para 2-(1-mentoxi)etanol asociado con la nefropatía por 2u-globulina en riñones de ratas macho, se informa que este tipo de nefropatía es específica de ratas macho y, por lo tanto, no es relevante para humanos. evaluación de riesgos13. Un mayor riesgo de insuficiencia renal mediado por mecanismos relacionados con la acumulación de 2u-globulina es altamente improbable, ya que esta proteína está ausente en los humanos14. Por lo tanto, se consideró razonable excluir de la determinación del NOAEL los cambios asociados con la nefropatía crónica observados en los hombres.

En conclusión, el presente estudio de toxicidad subcrónica de 13-semanas demostró que el tratamiento con 250 mg/kg de peso corporal/día de 2-(1-mentoxi)etanol provocó cambios tóxicos en la hematología, la bioquímica sérica y el peso de los órganos. en ratas F344 machos y hembras. Según los resultados observados, el NOAEL de 2-(1-mentoxi)etanolse evaluó como 60 mg/kg PC/día para ambos sexos.

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