Un ARN no codificante largo conservado, GAPLINC, modula la respuesta inmune durante el shock endotóxico

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Significado

La inflamación se ha estudiado en gran medida en el contexto de los genes que codifican proteínas. Estudios recientes han descubierto que los ARNc son importantes reguladores de la inmunidad. La caracterización funcional de estos genes sigue siendo un área activa de investigación. En este estudio, identificamos GAPLINC como un funcionalmente conservadoIncARNentre humanos y ratones. El agotamiento de GAPLINC da como resultado una expresión mejorada de genes de respuesta inmune que son directosNF-kBobjetivos Sorprendentemente, observamos que los ratones knockout para Gaplinc muestran resistencia al shock endotóxico inducido por LPS y encontramos que la expresión basal de genes inflamatorios previene la formación de puntos para proteger contra la falla multiorgánica y la muerte. Estos hallazgos tienen implicaciones en el tratamiento de la sepsis, en el que las nuevas terapias dirigidas a los ARNc pueden aportar información valiosa para comprender la inflamación y mejorar los resultados de los pacientes.

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FG 1. identificación y caracterización de macrófagos específicosIncARN GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) Análisis de ARN-Seq deGAPLNCexpresión durante la diferenciación de monocitos a macrófagos para los puntos de tiempo indicados. La expresión de GAPLINC se representa como copias por célula (FPKM. (D) El mapa de calor representa la expresión génica de un panel Nanostring personalizado, que muestra los 10 InciNA expresados ​​diferencialmente que comparan monocitos con macrófagos en células humanas primarias y células THP-1. Los datos de Nanotring se realizaron en duplicados biológicos. (E) Un esquema para células progenitoras de granulocitos-monocitos que da lugar a dos poblaciones distintas: 1) MDDC y 2) MDM. La pista del navegador del genoma de UCSC muestra lecturas de RNA-Seq de monocitos, macrófagos y células dendríticas en elGAPLINlugar. () Análisis qPCR de ARN purificados a partir de fracciones nucleares (blancas) y citoplásmicas (grises) en MDM(G Análisis qPCR de Russ aislado de diferentes fracciones de polisomas de sistemas MDM (gradiente de sacarosa del 10 al 50 por ciento, SW41, 40 K rpm, para ~ 1,5 horas).

Estudios recientes han identificado miles de ARN largos no codificantes (ncRNA) en genomas de mamíferos que regulan la expresión génica en diferentes procesos biológicos. Aunque los IncRNA se han identificado en una variedad de células inmunitarias y están implicados en la respuesta inmunitaria, la función biológica y el mecanismo de la mayoría siguen sin explorarse, especialmente en la sepsis. Aquí, identificamos un papel para un hdRNA (ARN no codificante intergénico largo predictivo de adenocarcinoma gástrico (GAPLINC)) previamente caracterizado por su papel en el cáncer, ahora en el contexto de la inmunidad innata, los macrófagos y el shock endotóxico inducido por LPS. El análisis del transcriptoma de macrófagos de humanos y ratones revela que GAPLINC es un IndRNA conservado que se expresa mucho después de la diferenciación de macrófagos. Tras la activación inflamatoria, GAPLINC se regula rápidamente a la baja. Los macrófagos sin GAPLINC muestran una mayor expresión de genes inflamatorios al inicio del estudio, mientras que la sobreexpresión de GAPLINC suprime esta respuesta. De acuerdo con las células agotadas en GAPLINC, los ratones knockout para Gaplinc muestran niveles basales mejorados de genes inflamatorios y muestran resistencia ainducida por LPSchoque endotóxico. Mecánicamente, la supervivencia está relacionada con mayores niveles de NF-xB nuclear en ratones knockout para Gaplinc que impulsan la expresión basal de genes diana que generalmente solo se activan después de la estimulación inflamatoria. Mostramos que esta activación de los genes de la respuesta inmunitaria antes del desafío con LPS conduce a la formación de coágulos sanguíneos en las áreas, lo que protege a los ratones knockout para Gaplinc de la falla multiorgánica y la muerte. Juntos, nuestros resultados identifican una función previamente desconocida para GAPLINC como un regulador negativo de la inflamación. y descubrir un papel clave para este lncRNA en la modulación del shock endotóxico.

Figura 2. GAPLINC es un regulador negativo de la inflamación y dependiente de la señalización de Nf-sB. Los monocitos aislados de PBMC humanas y diferenciados en macrófagos se transfectaron con ARNip de control o GAPLINC. (A)Análisis de ARN-Seqen GAPLINC kd o control siRNA MDM. RNA-Seq se realizó en duplicados biológicos. Los resultados se representan en un diagrama de volcán. Los genes significativamente regulados al alza con un cambio mayor o igual a 2 están enmarcados en rojo. (6) Análisis GO-Term en genes significativamente regulados. (C) El mapa de calor representa la expresión génica de los principales genes relacionados con el sistema inmunitario regulados por incremento en GAPLINC kd. Los datos de RNA-Seq se realizaron en duplicados biológicos. (D) Las isoformas GAPLINC en MDM se determinaron mediante secuenciación R2C2 basada en Nanopore. Los datos de la secuenciación de Nanopore se realizaron en duplicados biológicos (los datos sin procesar están disponibles en SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Una tabla que representa los recuentos de lectura y el porcentaje de cada isoforma GAPLINC. (F) Vector bidireccional que expresa GFP-Zetocin en un lado y GAPLINC en el otro lado. (G y H) Análisis qPCR de la expresión de GAPLINC en células THP-1 que expresan GAPLINC ectópica o control de vector vacío. Los niveles de IL6 se cuantificaron después de la estimulación con LPS (200 ml nales) durante 6 h; los datos se combinaron de tres experimentos independientes.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), análisis U qPCR de GAPLINC en MDM （n=3）pretratados con DMSO o BAY-7082（10 μM）, seguido de estimulación con LPS （200 ngmL） durante 6 ht Los datos se agruparon de tres experimentos independientes. *PAGS<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

La sepsis es una enfermedad potencialmente mortal causada por una reacción exagerada del cuerpo a la presencia de una infección, que puede conducir rápidamente a una falla multiorgánica y a la muerte. El sistema inmunitario es esencial para brindar protección contra las infecciones; sin embargo, la activación descontrolada puede tener graves consecuencias para el huésped. Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, uno de cada tres pacientes que mueren en un hospital tiene sepsis(1). y, sin embargo, todavía no comprendemos los mecanismos moleculares subyacentes que conducen a la fatalidad. Las opciones clínicas para el tratamiento de la sepsis se limitan a la administración de líquidos, antibióticos y atención de apoyo y se han mantenido prácticamente sin cambios durante décadas. Aunque el diagnóstico temprano y el tratamiento rápido han mejorado los resultados de la sepsis(2), existe una necesidad crítica de desarrollar nuevas terapias. Aunque se han realizado estudios de expresión génica para examinar posibles objetivos terapéuticos para la sepsis, estos objetivos siguen sin caracterizarse en gran medida (3). Hemos identificado un ARN largo no codificante (lncRNA) con funciones en el control de la respuesta inmune y el shock endotóxico que proporciona vías para el desarrollo de nuevos fármacos para combatir la sepsis.

Resultado

Fig. 3. GAPLINC se conserva en ratones y regula la respuesta al shock endotóxico. (4) GAPLINC se conserva en sintenia. GAPLINC se encuentra en Chr18 en humanos y en Chr17 en ratones, entre los genes codificadores de proteínas Dlgap1 y Gift. Dlgapil no se expresa enmacrófagos. (B)MCA muestra la distribución de los niveles de Gaplinc en varios tipos de células inmunitarias (BM). (C) análisis qPCR de la expresión de Gaplinc en células B y BMDM; estos datos (media ± SD) son representativos de tres experimentos independientes, (D) análisis qPCR de la expresión Gaping en BMDME estimulado con LPS (200 na/ml) durante 6 horas; estos datos (media ± DE) son representativos de tres experimentos independientes. (E) Esquema del locus de Gaplinc antes y después de la eliminación mediada por CRISPRCas9. Las líneas discontinuas indican la región aproximada de eliminación. El gel representa la amplificación por PCR de los datos genómicos. Las longitudes de amplicón se comparan para ratones WT y Gaping KO, (F) análisis qPCR de la expresión de Gaplinc en BMDM WT y Gaplinc-KO usando una combinación de cebadores para detectar Exon1, Exon2 y regiones que abarcan exones de la transcripción de Gaplinc; estos datos (media ± DE) son representativos de tres experimentos independientes. (G) Análisis de ARN-Seq en BMDM de ratones WT y Gaplinc KO (n =3). Los resultados se representan en un diagrama de volcán. Los genes significativamente regulados al alza con un cambio mayor o igual a 2 se muestran en rojo. (H) Análisis GO-Term en genes significativamente regulados. (I y J) Los datos de supervivencia de los ratones WT y Gaplinc KO se muestran en respuesta al desafío con LPS de E. coli (5 mg/kg/ratones) (n =6 a 10). La prueba estadística de diferencias se contó utilizando la prueba de rangos logarítmicos (Mantel-Cox). "…PAGS< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Dado que la expresión de lncRNA puede regular la respuesta inmunitaria al afectar la diferenciación de las células inmunitarias y su función respectiva (4-7), queríamos investigar el papel de los ncRNA en los macrófagos. Los macrófagos son importantes células inmunitarias innatas que pueden derivarse de los monocitos y son fundamentales para el reconocimiento de patógenos mediante el uso de receptores tipo Toll (TLR). Tras la activación. Los TLR inician vías de señalización complejas que activan factores de transcripción clave como NF-kB, lo que conduce a la transcripción de cientos de genes de respuesta inmunitaria(8).

Para identificar los IncRNA involucrados en la diferenciación y función de los macrófagos, realizamos la secuenciación del ARN (secuencia de ARN) tanto en macrófagos derivados de monocitos primarios humanos (MDM) como en la línea celular monocítica THP-1s (Fig. lA y Apéndice SI. Fig. S1). Identificamos el ARN no codificante intergénico largo predictivo de adenocarcinoma gástrico (GAPLINC) como el ARN Inc más regulado durante la diferenciación de monocitos a macrófagos (Fig. 1B). Los niveles de GAPLINC fueron detectables el día 1 y aumentaron a ~300 copias por célula (Fig. 1C). Utilizando la tecnología de creación de perfiles de ARN (nCounter, Nanostring), validamos GAPLINC como uno de los 10 principales ARNm expresados ​​en MDM primarios diferenciados y THP-1s (Fig1D). También confirmamos que GAPLINC se expresa altamente en MDM pero no se expresa en las células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC) de tipo celular estrechamente relacionadas (Fig. 1E), lo que sugiere que la expresión de GAPLINC es específica del tipo de célula. Al realizar un experimento de fraccionamiento celular y medir los niveles de GAPLINC en los compartimentos citoplasmático y nuclear de los macrófagos usando qPCR, encontramos que GAPLINC se localiza predominantemente en el citosol en comparación con CD14, un ARNm citoplasmático, y NEAT1, un ARN Inc nuclear (Fig. 1F). Esto es consistente con los hallazgos en las células cancerosas, en las que GAPLINC se localiza principalmente en el citoplasma(9). Para garantizar que GAPLINC no codifica, realizamos un perfil de polisomas, un método utilizado para analizar si un gen se traduce activamente en proteína. En contraste con CD14, no se encontraron ni NEATI ni GAPLINC en la fracción con alto contenido de polisomas, lo que sugiere que GAPLINC no se traduce (Fig. 1G),

Figura 4. Gaplnc KO regula al alza los IRG y muestra un mayor nivel de p65 en el desnudo al inicio del estudio. (A) Niveles de citoquinas en suero de ratones WT y Gaplinc KO en basal.n=4 a 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

A continuación, investigamos el efecto del silenciamiento GAPLINC en la diferenciación de macrófagos. A medida que los niveles de GAPLINC aumentaron durante la diferenciación, planteamos la hipótesis de que la caída de GAPLINC (KD) afectaría a los genes implicados en la diferenciación. Usando ARN de interferencia pequeño agrupado (siARN), logramos ~ 55 a 65 por ciento kd de GAPLINC en MDM primarios (SIApéndice, Fig. S2). Realizamos RNA-Seq e identificamos una serie de genes que estaban desregulados con GAPLINC kd (Fig. 24). Confirmamos los principales resultados utilizando Nanostring (Apéndice SI, Fig. S3). El análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) mostró que los genes de respuesta inmune estaban significativamente sobrerrepresentados en genes regulados por GAPLINC kd y no en genes involucrados en la diferenciación de macrófagos, contrariamente a nuestra hipótesis original. (Fig. 2B). En particular, los genes expresados ​​diferencialmente en las células GAPLINC-KD incluyen citocinas y quimiocinas proinflamatorias (IL6, CXCL10 y TNFSF10), genes estimulados por IFN (ISG) (IFIT2 y RSAD2) y proteínas de unión a guanilato (GBP) (GBP3 y GBP5) (Fig. 2C y Anexo SI. Fig. S4). Para verificar que la diferenciación de macrófagos no se vio afectada por GAPLINC kd. los niveles de CD11B.CD16 y CD14 se midieron en macrófagos de control y tratados con señalización y se encontró que eran similares (Apéndice SI. Fig. S5). Luego, usamos un enfoque kd adicional utilizandoCRISPRinhibición (CRISPRi) para apuntar al sitio de inicio de la transcripción mediante GAPLINC utilizando tres ARN guía diferentes (gRNA) en células THP-1 estimuladas con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Logramos más del 80 por ciento kd de GAPLINC y nuevamente observamos una mayor expresión de la citocina proinflamatoria IL6 cuando se desactiva GAPLINC al inicio (Apéndice SI. Fig. S6 A y B). Curiosamente, después de la activación de los lipopolisacáridos (LPS), los niveles de IL6 fueron similares en el control frente a las células GAPLINC kd THP-1 (Apéndice SI, Fig. S6C). Dado que los niveles de referencia difieren, la inducción total de veces de IL6 se reduce cuando se elimina GAPLINC. (Apéndice S7, Fig. S6D).

Como GAPLINC kd dio como resultado la regulación positiva de los genes de la respuesta inmunitaria, generamos una línea celular THP-1 que sobreexpresa GAPLINC para determinar si media el efecto contrario. Uso de datos de secuenciación de lectura larga. identificamos las isoformas dominantes de GAPLINC expresadas en MDM (Fig. 2D). La isoforma más abundante, que coincide con la anotación del gen de la secuencia de referencia (RefSeq), se incorporó a nuestra construcción (Fig. 2E). Utilizamos un vector lentiviral que contenía un promotor bidireccional para impulsar la proteína fluorescente verde (GFP)/Zeocin y GAPLINC en paralelo (Fig. 2F). Mediante qPCR confirmamos que GAPLINC se expresó de forma estable en THP-1s en comparación con el control (Fig. 2G). La sobreexpresión de GAPLINC redujo la IL6 a nivel de ARN en comparación con el control después de la estimulación con LPS, un componente de las bacterias gramnegativas (Fig. 2H). Estas observaciones sugieren que GAPLINC actúa como un regulador negativo de la respuesta inflamatoria.

A continuación, examinamos los niveles de GAPLINC en MDM primarios en respuesta a la inflamación. Tras la estimulación con LPS, encontramos que GAPLINC se reguló rápidamente (Fig. 2I). Además, usando qPCR mostramos que GAPLINC también se regula a la baja después de la activación con una variedad deTLRligandos (Apéndice SI, Fig. S7A). Se confirmó la inducción de genes inflamatorios de control positivo TNF-a, IL6 y CCL5 (Apéndice SI, Fig. S7B). Estos datos sugieren que la expresión de GAPLINC debe reducirse después de la estimulación para que se produzca una inducción óptima del gen inflamatorio. Para evaluar el papel de NF-kB en el control de la expresión de GAPLINC, los MDM se pretrataron con dimetilsulfóxido (DMSO) o BAY11-7082, un inhibidor de NF-B,

seguido de estimulación con LPS durante 6 h. En los MDM tratados con BAY11-7082-, la regulación negativa de GAPLINC se vio afectada en relación con el control (Fig. 2/). lo que sugiere que la regulación de GAPLINC depende de la señalización de NF-KB. Se confirmó la inducción de genes inflamatorios de control positivo TNF- e IL6 tras la estimulación con LPS (SIAppendix, Fig, S7C). evaluar la accesibilidad de la cromatina del locus GAPLINC. Descubrimos que GAPLINC se transcribe activamente en macrófagos en reposo, pero se cierra firmemente después de la estimulación con LPS (Fig. 2K), lo que sugiere que GAPLINC está regulado a nivel de transcripción.

Explorar la conservación de GAPLINC entre humanos y ratones. buscamos identificar loci sinténicos, en los que los genes se conservan posicionalmente entre los mismos dos genes codificadores de proteínas. seguida de una evaluación para la conservación funcional. Aquí, mostramos que Gaplinc se conserva posicionalmente, ubicando una transcripción entre los genes Dlgap1 y TgifI (Fig. 3A). Para confirmar la especificidad del tipo de célula, utilizamos el Atlas de células de ratón (MCA)

(10) para evaluar los niveles de transcripción en las células inmunes en la médula ósea (BM) y encontraron que se expresaba más en los macrófagos, con niveles más bajos de expresión en los progenitores de neutrófilos (Fig. 3B). A continuación, para determinar si los patrones de expresión se conservaron durante la diferenciación de macrófagos tanto en humanos como en ratones, realizamos RNA-Seq comparando células BM con macrófagos derivados de médula ósea (BMDM), completamos el ensamblaje de transcripción de novo y encontramos que los niveles de Gaplinc en ratones aumentaron después de la diferenciación. (Apéndice SI, Fig. S8A). Validamos esto mediante qPCR, comparando los niveles de Gaplinc en células BM con BMDM (Fig. 3C). Comparable al GAPLINC humano. Gaplinc de ratón se regula rápidamente a la baja en BMDM estimulados con LPS (Fig. 3D). Como control, confirmamos la inducción de los genes inflamatorios The-a e I6 (Apéndice SI. Fig. S8B). Mouse Gaplinc también se regula rápidamente a la baja después de la activación con varios ligandos TLR. También se confirmó la inducción de los genes de control positivo ll6 y Ccl5 (Apéndice SI, Fig. S8C).

Usando CRISPR, generamos un ratón knockout (KO) de Gaplinc en el que se eliminaron el exón I y la mayoría del primer intrón (Fig. 3E). Los ratones Chaplin KO se reprodujeron normalmente y no mostraron defectos de desarrollo evidentes. La eliminación de Gapline se confirmó mediante la amplificación por PCR del ADN genómico en ratones de tipo salvaje (WT) y Gaplinc KO, con tamaños de amplicón de ~1300 pb para ratones WT y ~500 pb para ratones Gaplinc KO (Fig. 3E), la estrategia de genotipado completa para confirmar WT y Gaplinc KOs se destaca en el Apéndice SI, Fig. S9. También confirmamos la deficiencia de Gaplinc en BMDM utilizando qPCR (Fig. 3F). Para evaluar si la deficiencia de Gaplinc afectaba la diferenciación, teñimos los BMDM WT y Gaplinc-KO para CD11B y F4/80; los patrones de tinción fueron similares, lo que sugiere una diferenciación normal de macrófagos (Apéndice SI, Fig. S104). Para evaluar si Gaplinc KO interrumpió la función de los macrófagos, comparamos la actividad de fagocitosis en BMDM WT y Gaplinc-KO y no encontramos diferencias (Apéndice SI, Fig. S10B).

Para evaluar el impacto global de la deficiencia de Gaplinc en los macrófagos, realizamos RNA-Seq en BMDM WT y Gaplinc-KO; ambos no recibieron tratamiento y se estimularon con LPS durante 6 h. En los BMDM de Gaplinc-KO, la expresión de 23 genes (mostrado en rojo, Fig. 3G) se reguló significativamente al inicio del estudio. Estos genes incluyen citocinas y quimiocinas proinflamatorias (Il6.l1-a. I1-8 y Cxd10), ISG (Ifitlbl1), miembros de la familia GBP (Gbp5 y Gbp0) y marcadores de superficie celular específicos para macrófagos activados (Cd69). El análisis GO confirmó que los genes involucrados en la respuesta inmune están sobrerrepresentados en los BMDM de Gaplinc-KO al inicio (Fig. 3H). Estos genes generalmente se regulan al alza después de la estimulación con LPS (Apéndice SI. Fig. S11). Similar a los datos obtenidos de nuestros estudios humanos, estos datos sugieren queGAPLINse conserva funcionalmente entre especies para controlar basalmente la expresión de genes de respuesta inflamatoria (IRG). No hubo una diferencia importante en los genes que se regularon al alza después de la estimulación con LPS entre los BMDM WT y Gaplinc-KO (Conjunto de datos S1).

Numerosos estudios han demostrado la capacidad de los IncRNA para regular la transcripción de genes vecinos(11). Como tal, exploramos los posibles roles reguladores de cis para Gaplinc, ya que su gen vecino, Tgif1, se ha implicado previamente en la modulación de la activación de los macrófagos (12). Usando nuestros datos de RNA-Seq, confirmamos que en los BMDM de GaplincKO, la expresión de Tgifl en relación con las células T no se vio afectada (SIAppendir.Fig.S124). Además, confirmamos mediante qPCR que Tgifl no se alteró en los BMDM Gaplinc-KO (Apéndice SI, Fig. S12B). A continuación, exploramos la posibilidad de que la interrupción del locus de Gaplinc pudiera eliminar un elemento regulador importante, como un potenciador. Utilizamos datos ATAC-seq de BMDM WT para evaluar regiones transcripcionalmente activas en el locus Gaplinc (13). No identificamos señales dentro de la región de eliminación de Gaplinc, solo las correspondientes al promotor de Gaplinc (Apéndice SI. Fig. S13). En conjunto, estos datos sugieren que la regulación positiva de los IRG tras la deficiencia de Gaplinc no se debe a los efectos sobre los genes vecinos o la eliminación de un elemento regulador.

Como Gaplinc KO en BMDM regula al alza la expresión de IRG en condiciones basales, a continuación queríamos desafiar a los animales Gaplinc KO in vivo para observar las diferencias en la respuesta del huésped. Empleamos un modelo de "shock endotóxico". en el que se inyectó intraperitonealmente (ip) LPS de Escherichia coli en ratones WT y Gaplinc KO para medir las diferencias en la supervivencia. A una dosis de 5 mg/kg/ratón. Los ratones WT mostraron un 0 por ciento de supervivencia después de 2 días (Fig. 30). Sin embargo, el 100 por ciento de los ratones Gaplinc KO sobrevivieron, lo que indica que los ratones Gaplinc KO tienen resistencia al choque endotóxico inducido por LPS (Fig. 31). , se observan diferencias de temperatura significativas entre los ratones WT y los ratones deficientes en Gaplinc (Fig. 3). Incluso cuando se utiliza una dosis mucho más alta de LPS de 20 mg/kg, los ratones con deficiencia de Gqplinc muestran una ventaja de supervivencia significativa (Fig. 3K). , estos datos muestran que Gaplinc juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune in vivo.

A partir de nuestros estudios en humanos, sabemos que GAPLINC puede regular los genes inmunitarios al inicio del estudio. Si bien no hay diferencia en la expresión de citoquinas después de la activación inflamatoria, hay una diferencia en la magnitud de la respuesta ya que los niveles iniciales difieren. Por lo tanto, para comprender mejor estas diferencias de supervivencia in vivo, evaluamos los cambios en la expresión de citoquinas al inicio. Utilizamos una matriz de citoquinas multiplexadas para medir simultáneamente biomarcadores asociados con la respuesta inmune, la sepsis y el cáncer. Al inicio del estudio, genes inmunitarios clave, incluido MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. y M-CSF estaba significativamente elevado en el suero de ratones Gqplinc KO en comparación con WT (Fig. 44). Estas citoquinas están implicadas en el reclutamiento de células: sin embargo, usando citometría de flujo, confirmamos que el porcentaje de neutrófilos, células T, células B, eosinófilos, monocitos y macrófagos era comparable entre WT y Gaplinc KOmice al inicio (Apéndice SI, Fig. S14) . Curiosamente, estos porcentajes también fueron comparables con los desafíos posteriores a LPS en los puntos de tiempo de 6 h y 18 h (Apéndice SI, Figs. S15 y S16). Además, el suero de ratones WT y Gaplinc KO analizados para las características clínicas de la sepsis, incluido el lactato y la proteína C reactiva (PCR) (Apéndice S7, Fig. S17), no mostró diferencias.

Dado que los niveles elevados de MDC o IL-13(Fig.44) se han caracterizado previamente por desempeñar funciones protectoras contra el shock endotóxico a través de la modulación de las citoquinas proinflamatorias (14,15), a continuación examinamos las diferencias en los niveles de citoquinas proinflamatorias , incluidos l6, Il1- , l1- y Cxcl10, después de la activación inflamatoria. Si bien los niveles de WT y Gaplinc KO son los mismos tanto en la transcripción (Fig. 4B) como en el nivel de proteína (Apéndice SI, Fig. S18A-C), la magnitud del cambio es mucho menor (Fig. 4C), lo que sugiere que este pliegue reducido cambio puede desempeñar un papel en la prevención de la susceptibilidad de los ratones Gaplinc KO a LPS. choque endotóxico inducido.

Junto con la producción desenfrenada de citoquinas. otro aspecto clínico del shock endotóxico que puede conducir a la mortalidad es la formación de coágulos de sangre en los vasos más pequeños, lo que lleva a una falla multiorgánica(16,17). Para abordar esto, analizamos el suero de ratones tratados con LPS ip para evaluar las diferencias en la coagulación. Usando un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activado (a) que mide el tiempo de formación de coágulos, encontramos que los ratones WT muestran un tiempo significativamente prolongado en comparación con los ratones Gaplinc KO en el desafío con LPS (Fig. 4D). Los tiempos prolongados de aPTT sugieren que los ratones WT ya se han coagulado y han agotado los factores de coagulación clave, de modo que en el momento de la prueba, el inicio de la coagulación y la medición, aumenta el tiempo de formación del coágulo. Los datos sugieren que las diferencias en la supervivencia tras el desafío con LPS se deben a que los ratones WT experimentan un aumento de la coagulación, lo que conduce a una eventual falla orgánica y muerte.

A continuación, tratamos de comprender mecánicamente cómo Gaplinc está mediando este efecto. Primero, confirmamos su localización y analizamos los niveles de Gaplinc en los compartimentos citoplasmático y nuclear de BMDM por qPCR. Similar al GAPLINC humano. el Gaplinc de ratón era predominantemente citoplásmico (Apéndice ST, Fig. S19). A continuación, realizamos una identificación completa modificada de proteínas de unión a ARN (ChIRP), junto con espectrometría de masas y secuenciación de ARN pequeño, ya que se ha demostrado previamente que GAPLINC interactúa con micro ARN (18). No observamos interacciones con objetivos previamente identificados (SIAppendix, Fig. S20).

Como no pudimos identificar un socio de unión directa, nos enfocamos en la función conservada entre humanos y ratones, específicamente los genes conservados afectados en nuestros estudios GAPLINC kd humano y Gaplinc KO de ratón, la mayoría de los cuales son reguladores NF-kB (Fig. 4E ). La forma más abundante de NF-KB activado por LPS es el heterodímero p65:p50, y siete de los nueve genes conservados son dianas directas de p65(19). Utilizamos inmunoprecipitación de ARN nativo (RIP) y demostramos que no existe una interacción directa entre Gaplinc y p65 (Apéndice S7, Fig. S21). En la vía de señalización clásica de NF-kB, las subunidades p6:p50 se encuentran en el citosol y se inhibidor I-kB- en células en reposo. Tras la activación, I-KB- se degrada, lo que permite que p65:p50 se traslade al núcleo y active los genes diana (20). En BMDM WT y Gaplinc-KO, medimos la degradación de I-kB- usando transferencia Western y no encontramos diferencias (Fig. 4F). A continuación, comparamos los niveles totales de p65 en BMDM. En nuestros datos de RNA-Seg, los niveles de transcripción de p65 (RelA) en las condiciones basales y estimuladas por LPS para BMDM WT y Gaplinc-KO son comparables (Apéndice SI, Fig. S22). Sin embargo, cuando comparamos los niveles totales de proteína p65 mediante transferencia Western, encontramos niveles de p65 significativamente mayores en Gaplinc-KOcells en comparación con WT (Fig. 4G). Esto sugiere que Gaplinc regula los niveles totales de p65 a nivel de traducción. Además, evaluamos los niveles de p65 en los compartimentos citoplásmico y nuclear y descubrimos que el p65 nuclear es más abundante en las células deficientes en Gaplinc en comparación con las WT (Fig. 4H). Combinados, estos datos sugieren un papel mecánico para GAPLINC en la preparación de la activación de IRG críticos.

Discusión

Aquí, hemos identificado GAPLINC como un IncRNA expresado citosólicamente conservado en humanos y ratones que funciona para controlar la expresión de genes inflamatorios a través de la regulación de NF-xB. En comparación con los IncRNA citosólicos informados que afectan la eficiencia de traducción al modular la expresión de proteínas o el ensamblaje de ribosomas (21-23), encontramos que Gapline contribuye citosólicamente a la capacidad de traducción de p65; sin embargo, queda por determinar el mecanismo de interacción, ya sea directo o indirecto. Nuestros hallazgos brindan información sobre cómo un IncRNA conservado funcionalmente regula la respuesta inmune y brinda vías de investigación para el desarrollo de terapias para el shock endotóxico.