Una distribución distintiva del factor inducible por hipoxia-1 en células tubulares renales cultivadas con hipoperfusión simulada mediante la colocación de cubreobjetos

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tomoko honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Resumen

La hipoxia crónica en el tubulointersticio renal juega un papel clave en la progresión de la enfermedad crónica.riñónenfermedad(ERC). Por lo tanto, es importante investigar la hipoxia tubular y la actividad del factor inducible por hipoxia (HIF)-1 en respuesta a la hipoxia. La rarefacción del capilar peritubular causa hipoperfusión en la CKD; sin embargo, rara vez se ha investigado el efecto de la hipoperfusión en los HIF. Indujimos hipoperfusión causada por la colocación de cubreobjetos en humanosriñón-2 células y observó un gradiente de oxígeno debajo del cubreobjetos. La inmunocitoquímica de HIF-1 mostró una formación en forma de dona en el borde de un área positiva para pimonidazol, que llamamos "anillo HIF". Se estimó que la tensión de oxígeno del anillo HIF estaba entre aproximadamente 4 mmHg y 20 mmHg. Este resultado no era compatible con los de investigaciones anteriores que mostraban acumulación de HIF-1 en el rango anóxico con tensión de oxígeno homogénea. Además, observamos la presencia de un gradiente de pH debajo de un cubreobjetos, así como un cambio del anillo HIF debido a cambios en el pH del medio de cultivo, lo que sugiere que el anillo HIF se formó por la supresión de HIF-1 relacionado a pH bajo. Esta investigación demostró que la activación de HIF-1 imita el estado fisiológico en células cultivadas con hipoperfusión.

PALABRAS CLAVEhipoperfusión, hipoxia, factor inducible por hipoxia, gradiente de oxígeno, pH

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1|INTRODUCCIÓN

La incidencia de enfermedades crónicasriñónenfermedad(ERC) está aumentando en todo el mundo a medida que las sociedades envejecen (Tonelli & Riella, 2014). La progresión de la ERC es irreversible una vez que el daño renal alcanza un cierto grado y finalmente resulta en enfermedad renal terminal (ESRD), independientemente de la enfermedad subyacente. Este resultado indica la existencia de un "camino común final". Según análisis patológicos anteriores, la disminución de la función renal se correlaciona más fuertemente con el daño tubulointersticial que con el daño glomerular. Ha habido varios informes que demuestran que la fibrosis renal induce hipoxia crónica en el tubulointersticio, y esta hipoxia tubulointersticial agrava la ERC y conduce a la ESRD. Esta evidencia indica que la hipoxia tubulointersticial juega un papel en la vía común final de la ERC (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). losriñónes altamente susceptible a la hipoxia debido a su alta demanda de oxígeno y a la existencia de una derivación de oxígeno entre las arterias y venas intrarrenales (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Por lo tanto, consideramos que es fundamental investigar la hipoxia y la respuesta a la hipoxia en el tubulointersticio renal.

La respuesta biológica primaria a la hipoxia en los organismos vivos se produce a través de la vía del factor inducible por hipoxia (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF consta de - y - subunidades. Aunque la subunidad - es constitutivamente activa, la subunidad - se degrada en presencia de oxígeno. En condiciones normóxicas, HIF- es hidroxilado por el dominio prolil hidroxilasa (Ph.D.), lo que lo hace reconocible por el supresor de tumores de von Hippel-Lindau (VHL). Este reconocimiento da como resultado la ubiquitinación y degradación de HIF- hidroxilado en el proteasoma. En condiciones hipóxicas, el HIF- se acumula en el citosol, porque el HIF- no hidroxilado escapa a la degradación. El HIF- acumulado se transloca desde el citosol al núcleo, donde se dimeriza con HIF- y actúa como un factor transcripcional, promoviendo la expresión de genes aguas abajo. De las tres isoformas identificadas de las subunidades HIF: HIF-1, HIF-2 y HIF-3, se sabe que las células epiteliales tubulares renales expresan HIF-1 (Tanaka et al. ., 2016). Estudios previos han mostrado acumulación transitoria o regional de HIF en elriñóncon ERC (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), y este HIF se activa en la tensión de oxígeno reducida en el entorno de la ERC. La mala adaptación a la hipoxia en la ERC podría deberse a la presencia de factores que suprimen las vías HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Se han informado efectos protectores de la activación de HIF en varios modelos animales, incluidas ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina y ratas con nefrectomía 5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Doctor. Los inhibidores han atraído recientemente la atención como enfoques terapéuticos novedosos para la anemia renal en pacientes con ERC (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Sin embargo, los detalles de la progresión de la hipoxia renal y la forma en que se produce la acumulación de HIF en elriñóncon CKD, permanecen oscuros. La hidroxilación de HIF-dependiente de oxígeno ocurre en el citosol y, por lo tanto, es importante medir la tensión de oxígeno intracelular y extracelular. Hay varios métodos que se utilizan para medir la tensión de oxígeno, incluido el uso de microelectrodos o imágenes de resonancia magnética dependientes del nivel de oxígeno en sangre (BOLD-MRI). Utilizamos microscopía de imágenes de por vida de fosforescencia (PLIM) para la medición cuantitativa del estado de oxígeno intracelular (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 es un colorante fosforescente basado en el complejo de iridio (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoato-piridina, aac=acetilacetona) con un grupo catiónico dimetilamino, que es pasivamente distribuidos en lisosomas intracelulares. Se sintetizó como una sonda fosforeciente para medir la presión de oxígeno intracelular (Yoshihara et al., 2015). PLIM con BTPDM1 permitió la adquisición de imágenes de alta resolución de la presión parcial de oxígeno en células tubulares renales en la superficie renal de ratones normales, proporcionando datos que indican la presencia de un gradiente de oxígeno, incluso en riñones normales (Hirakawa et al., 2018). ).

Hay gradientes de oxígeno en los órganos vivos, incluidosriñones, incluso en condiciones normales (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), por lo que estos gradientes también pueden esperarse en la ERC. La hipoperfusión es causada por la rarefacción de la microvasculatura en la ERC, en la que la lesión glomerular progresiva da como resultado una disminución del flujo sanguíneo capilar peritubular, lo que agrava la fibrosis intersticial. La fibrosis intersticial altera la difusión y el suministro de oxígeno a las células tubulares y conduce a la rarefacción de la microvasculatura, lo que agrava aún más la hipoxia tubulointersticial (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Sin embargo, los efectos biológicos de la hipoperfusión siguen siendo oscuros, porque la mayoría de los estudios han investigado los efectos de la hipoxia y el HIF-1 en células cultivadas en condiciones de perfusión homogénea y tensión de oxígeno (Rexius-Hall et al., 2017). Estudios previos han demostrado que las células cultivadas monocapa cubiertas con un cubreobjetos proporcionan un buen modelo de hipoperfusión inducida por una barrera a la difusión en el medio de cultivo. La hipoperfusión modelada se asocia con un gradiente de oxígeno porque un cubreobjetos evita la difusión de oxígeno desde la parte superior del medio hacia las células (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). En una monocapa de células cultivadas cubiertas con un cubreobjetos, la tensión de oxígeno intracelular cae con la distancia desde el borde del cubreobjetos debido a la difusión limitada de oxígeno en las células cultivadas. Como resultado, se forma un gradiente de oxígeno desde el borde hasta el centro del cubreobjetos y la tensión de oxígeno intracelular puede caer a un rango anóxico en el centro del cubreobjetos (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . En el estudio actual, nos centramos en la activación de HIF e investigamos si existe un cambio independiente del oxígeno en la expresión de HIF en presencia de hipoperfusión con un gradiente de oxígeno. Dado que existe hipoperfusión con un gradiente de oxígeno en los túbulos renales in vivo, la observación de los efectos independientes del oxígeno sobre la expresión de HIF en el modelo de cubreobjetos puede proporcionar información sobre el mecanismo subyacente a la insuficiencia de la acumulación de HIF en la ERC.

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2|MATERIALES Y MÉTODOS

2.1|Cultivo de células

Las células cultivadas se incubaron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 por ciento. La incubación hipóxica se realizó en una incubadora personal de CO2/multigas APM-30D (Astec). La anoxia se indujo con una bolsa de anoxia, AnaeroPack y equipos de cultivo anaeróbico #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Células HK-2 (Homo sapiens, humanoriñón, macho, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), una línea de células epiteliales del túbulo proximal inmortalizado de riñón humano adulto normal, se cultivaron en una mezcla de nutrientes/medio Eagle modificado por Dulbecco F{{2} } Jamón (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) que contiene un 10 % de suero bovino fetal (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) y solución de penicilina-estreptomicina (15070063, Thermo Fisher Scientific) en una placa de cultivo de 10 cm. Para el paso, las células HK-2 se disociaron con tripsina (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y se centrifugaron a 300 g durante 5 min.

Células de cáncer de cuello uterino HeLa y células embrionarias humanasriñónlas células 293 (HEK293) se cultivaron en DMEM con glucosa baja (1000 mg/l) (D6046, Sigma Aldrich) que contenía FBS al 5 por ciento en una placa de cultivo de 10 cm. Estas células se pasaron como células HK-2.

Las células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) se mantuvieron utilizando kits RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Para el paso, los RPTEC se disociaron con tripsina, se neutralizaron con solución neutralizante de tripsina (CC-5002, Lonza Ltd.) y se centrifugaron a 200 g durante 5 min.

2.2|Establecimiento de un modelo de hipoperfusión mediante la colocación de un cubreobjetos

Los cubreobjetos de forma redonda de 15 mm de diámetro (C015001, Matsunami) se limpiaron con ultrasonido y se almacenaron en etanol al 99,5 por ciento antes de su uso. Se emplearon dos métodos, basados ​​en la observación de células fuera del cubreobjetos.

Las células cultivadas en monocapa se intercalaron entre un cubreobjetos y el fondo de un plato (Figura S1a, b), o un método alternativo (Figura S1c), como se describe a continuación. Se seleccionó el método tradicional o el alternativo para establecer nuestro modelo de cubreobjetos para imágenes en vivo, ya sea imágenes de oxígeno o imágenes de PH. Para la inmunocitoquímica (ICC), se eligió el método alternativo porque, al utilizar el método tradicional, la mayoría de las células se separaban con frecuencia del fondo de la placa durante la extracción del cubreobjetos para la fijación de las células (Figura S2a).

2.2.1|Método tradicional

El día 1, las células se colocaron en el fondo de una placa de vidrio de 27 mm (3910-035, Iwaki) a una confluencia de 100 por ciento * (aproximadamente 5,0 × 105/placa). Se cultivaron en DMEM/F12 que contenía FBS al 10 por ciento sin solución antibiótica durante la noche. El día 2, se colocó un cubreobjetos sobre las células cultivadas durante el período indicado (Figura S1b).

2.2.2|Método alternativo

Las células se sembraron en un cubreobjetos en una placa de cultivo de 35 mm con una confluencia del 100 por ciento (aproximadamente 5,0 × 105/placa) el día.

1. Se cultivaron en DMEM/F12 que contenía FBS al 10 % sin solución antibiótica durante la noche. El día 2, se invirtió el cubreobjetos para unir la superficie de sus celdas al fondo de un nuevo plato de vidrio de 27 mm durante un período específico (Figura S1c).

También creamos un modelo de cubreobjetos utilizando cubreobjetos de forma redonda con un diámetro de 10 mm (CS01005, Matsunami) (Figura S2b).

2.3|Imágenes de oxígeno en vivo con BTPDM1

Las células cultivadas se prepararon el Día 1, como se describe anteriormente. El día 2, las células se enjuagaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) y se incubaron con BTPDM1 500 nM, un colorante lipofílico catiónico a base de iridio que se usa como sonda fosforescente intracelular (Yoshihara et al., 2015), en DMEM/F12 sin rojo fenol (21041-025, Thermo Fisher Scientific) durante 30 min. Después de lavar las células dos veces con HBSS, se colocaron entre un cubreobjetos y el fondo de una placa, como se describe anteriormente. La intensidad de la fosforescencia de BTPDM1 en células cultivadas cubiertas con un cubreobjetos se observó usando un filtro de excitación y emisión, y la fosforescencia de BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) se detectó usando un microscopio de fluorescencia, BZ-X710 (Keyence Corporation). Las imágenes obtenidas del microscopio fluorescente invertido se ajustaron en cuanto a brillo y contraste utilizando el software de análisis BZ-X.

2.4|inmunocitoquímica

Las células en un cubreobjetos se cultivaron con pimonidazol HCl 200 µM (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) en DMEM/F12 sin rojo fenol durante 1 h, después de lo cual se giró el cubreobjetos y se adjuntó a un cubreobjetos de vidrio, como descrito anteriormente. A continuación, las células se cultivaron en DMEM/F12 sin rojo fenol durante un período específico. Cuando no se utilizó la contratinción con pimonidazol, se omitió el pretratamiento con pimonidazol.

Después de completar el período de cultivo, se recolectó cada cubreobjetos y las células se fijaron inmediatamente con metanol/acetona (1:1) en hielo, donde permanecieron durante 30 min. Después de lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco (D5652, Sigma Aldrich), la membrana celular se permeabilizó durante 30 min, se incubó con albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % (A3059, Sigma Aldrich) durante 30 min y, posteriormente, con bloque de proteínas sin suero (X0909, DAKO) durante 10 min. Las células se tiñeron con un primer anticuerpo y posteriormente con un segundo anticuerpo fluorescente. La lista de los primeros anticuerpos se proporciona en la Tabla S1. Se usó inmunoglobulina anti-conejo policlonal porcina FITC (F0205, dilución 1:20, DAKO) como primer anticuerpo si el huésped era un conejo. El anticuerpo fluorescente Alexa Fluor 594 estreptavidina (S11227, dilución 1:500, Thermo Fisher Scientific) se utilizó como primer anticuerpo si el huésped era un ratón, seguido de IgG anti-ratón biotinilado (H más L) (BA{{23} }, dilución 1:1000, Vector Laboratories), como segundo anticuerpo. La tinción nuclear se realizó utilizando trihidrocloruro de bisBenzimida H 33342 (B2261, Sigma Aldrich) para cada muestra.

Las señales fluorescentes se observaron utilizando un microscopio fluorescente invertido, BZ-X710 (Keyence Corporation) con los siguientes filtros: Texas Red con una longitud de onda de excitación (Ex) de 560/40 nm, longitud de onda de emisión (Em) de 630/75 nm, GFP ( Ej: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) y DAPI (Ej: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Las imágenes se ajustaron en cuanto a brillo y contraste utilizando el software de análisis BZ-X.

2.5|ICC de HIF de células HK-2 tratadas con cloruro de cobalto

El método alternativo se modificó para producir un modelo de cubreobjetos de células HK-2 tratadas con cloruro de cobalto. Se sembraron células HK-2 a densidad semiconfluente (2,5 × 105/placa) en un cubreobjetos el día 1 y se trataron con hexahidrato de cloruro de cobalto 300 µM (C 8661, Sigma Aldrich) durante 16 h en Día 2. El día 3, se invirtió el cubreobjetos para unir las superficies de las células al fondo de un nuevo plato de vidrio de 27 mm durante 3 h, y se realizó el ICC de HIF.

2.6|transferencia occidental

Para investigar la acumulación de HIF{{0}} bajo diferentes tensiones de oxígeno y a diferentes niveles de pH, 1.0 × 106 células HK-2 por placa de cultivo de 10 cm se incubaron en normoxia, oxígeno al 2 por ciento, oxígeno al 1 por ciento o anoxia durante 5 horas, o en DMEM/F12 a pH 7,4, pH 6,0 o pH 5,0 durante 5 horas.

Estas células se lisaron en tampón RIPA que contenía tampón Tris 50 mM (pH 8, 0), NaCl 150 mM, 0, 5% p/v de sodio desoxicolato, 0,1 por ciento p/v de SDS y 1,0 por ciento p/v de NP40.

Para la transferencia Western, tampón de muestra de SDS que contiene {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6.8), 10 por ciento de SDS, 36 por ciento de glicerol, 0.012 por ciento de azul de bromofenol y 0.1 M de ditiotreitol (DTT) se añadió a las proteínas. Las proteínas que contenían tampón de muestra SDS se eluyeron hirviéndolas a 95 grados durante 5 min.

Las proteínas se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS al 10 por ciento. A continuación, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF AmershamTM HybondTM (10600023, GE Healthcare) en tampón de transferencia (tampón Tris-base 48 mM, glicina 39 mM, SDS al 0,04 % y metanol al 20 % v/v) usando un Trans-Blot®. Sistema de transferencia TurboTM (Bio-Rad). Las membranas se incubaron a temperatura ambiente con anticuerpos primarios, anticuerpo anti-HIF1 (NB100-134, dilución 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) y anticuerpo anti-actina (A2066 , dilución 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), y posteriormente en el anticuerpo secundario, inmunoglobulina policlonal de cabra anti-conejo/HRP (P0448, dilución 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26 }}). Para la detección se utilizó el sustrato de transferencia Western PierceTM ECL Plus (32132, ThermoFisher Scientific). La quimioluminiscencia se observó usando un Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). La reproducibilidad se confirmó realizando al menos tres experimentos independientes. La intensidad de las bandas se cuantificó utilizando el software ImageJ de los Institutos Nacionales de Salud (Schneider et al., 2012).

2.7|Ensayo de reportero de luciferasa

Se realizó un ensayo indicador de luciferasa para medir la acumulación de HIF1 en incubación de cultivo hipóxico homogéneo. Previamente, construimos un gen de luciferasa etiquetado impulsado por un elemento sensible a la hipoxia (HRE) y desarrollamos el vector informador sensible a la hipoxia (construcción transgénica). Esto se construyó a partir de copias en tándem del HRE del gen del factor de crecimiento endotelial vascular de rata subclonado en la región 5' de la unidad de transcripción am CMV-promotor-luciferase (pre-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

Se prepararon células HK{{0}} a una concentración de 1,0 × 105 por pocillo en placas de cultivo de 12-pocillos (150628, Thermo Fisher Scientific). Las células se cotransfectaron con 500 ng de vectores pGL3-Basic HRE-luciferase y 30 ng de vectores de control pRL-SV40 Renilla luciferase (Promega), utilizando 2 µl de reactivo de transfección FuGENE® HD (E2311, Promega) por bien. Se usaron células HK-2 cotransfectadas con 500 ng de vectores de luciferasa de luciérnaga básica pGL3- y 30 ng de vectores de control de luciferasa de pRL-SV40 Renilla (Promega) como control negativo.

Las células transfectadas se incubaron en normoxia, hipoxia al 2 por ciento, hipoxia al 1 por ciento o una bolsa de anoxia durante 5 h. A continuación, las células se recogieron usando 100 µl de tampón de lisis pasiva de proteínas, para el ensayo de luciferasa dual. Para las mediciones se utilizó un luminómetro LB9507 (EG y Berthold). Para corregir la eficacia de la transfección, el valor relativo de la unidad de luz de luciferasa de luciérnaga se dividió por el de la luciferasa de Renilla.

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2.8|Análisis de la apoptosis

Las células cultivadas se cubrieron con un cubreobjetos durante 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h y 24 h, y luego se recolectaron usando tripsina. Las células tratadas con peróxido de hidrógeno al 3 por ciento (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) durante 30 minutos se prepararon como control apoptótico. El análisis cuantitativo de la apoptosis se realizó utilizando los kits de células muertas y anexina V de Muse (MCH100105, Millipore) en un analizador de células Muse™ (Millipore), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.9|PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

La extracción de ARN total y la síntesis de ADNc se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para RNAiso Plus (9109, Takara) y PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara), respectivamente. La PCR en tiempo real se realizó con THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX Connect (Bio-Rad). Los niveles de transcripción se normalizaron al nivel de expresión de ARNm de -actina. qRT-PCR se realizó por triplicado utilizando cebadores específicos de genes. HIF-1 se amplificó utilizando cebadores directos 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ e inversos 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′. -actina se amplificó utilizando los cebadores directo, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ e inverso 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′.

2.10|Transfección con siRNA

Para investigar la eliminación de HIF-1 inducida por ARNi en células HK-2, se prepararon 5.0 × 104 células HK-2 por pocillo en placas de seis pocillos. Se usaron dos tipos de ARNi: HIF-1siRNA (siHIF-1 n.º 1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] y siHIF-1 n.º 2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) con Lipofectamine RNAiMAX Reactivo de transfección (Thermo Fisher Scientific). Como control negativo, se utilizó Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Se mezclaron 1,5 µl de cada siRNA y 5 µl de RNAiMAX. Las células transfectadas con ARNsi se incubaron en condiciones normóxicas o hipóxicas (1 por ciento de O2) durante 48 hy se extrajo el ARN. La eficacia de la eliminación de HIF-1 se examinó mediante qRT-PCR.

2.11|Imágenes en vivo de los efectos de un gradiente de PH

Visualizamos el gradiente de pH intracelular de las células vivas bajo un cubreobjetos. Las células se trataron con el indicador de pH intracelular pHrodo Green AM (p35373, ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, antes de implementar el modelo de cubreobjetos. Se usó un microscopio de fluorescencia invertido, BZ-X710 (Keyence Corporation) con un filtro GFP para observar la transición temporal del gradiente de intensidad de fluorescencia bajo un cubreobjetos.

2.12|Análisis cuantitativo del anillo HIF

2.12.1|Sitio del anillo HIF

Medimos la distancia de los anillos HIF y las áreas positivas de pimonidazol desde los bordes del cubreobjetos utilizando ImageJ, de la siguiente manera. Se determinaron las áreas de los círculos exterior e interior del anillo HIF y del círculo positivo para pimonidazol, y se calculó el radio de cada círculo. Cada valor se restó de 7,5 mm, que es el radio de un cubreobjetos de 15 mm, para calcular su distancia desde el borde del cubreobjetos. Se realizaron tres experimentos independientes de ICC de HIF en cada condición.

2.12.2|Definición del anillo HIF

Utilizamos imágenes fluorescentes obtenidas de un modelo de cubreobjetos incubado en normoxia y pH neutro. Definimos el sitio del anillo HIF y su exterior e interior como 2.5–3.0 escala (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.0 escala (1,12– 1,35 mm) y 5.0–5,5 escala (2,24–2,47 mm) desde el borde de un cubreobjetos, respectivamente, utilizando ImageJ. Medimos cinco sitios de señales HIF-1 por muestra y calculamos el promedio. Se realizaron tres experimentos independientes de ICC de HIF.

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2.13|Medición de la presión de oxígeno por imagen PLIM

2.13.1|Construcción de una línea de calibración para medir la presión de oxígeno

Se realizó una curva de calibración de células HK-2, basada en el método descrito en nuestro informe anterior (Yoshihara et al., 2015). Se cultivaron células HK-2 cargadas con BTPDM1 500 nM durante 30 minutos en una incubadora multigás variable en la concentración de oxígeno equipada con un microscopio fluorescente invertido que estaba conectado al sistema de medición de por vida. Se construyó una línea de calibración basada en los análisis de Stern-Volmer usando el tiempo de vida de la fosforescencia (PL) de las células HK-2 bajo varias tensiones de oxígeno diferentes usando

Ecuación (1)

donde τp representa el PL en pO2, τ0 representa el PL en desoxigenación, kq representa la constante de velocidad de extinción y pO2 representa la presión parcial de oxígeno. Usando esta línea de calibración, la presión de oxígeno podría calcularse a partir del PL.

2.13.2|Imagen PLIM de un modelo de cubreobjetos

Se prepararon células HK-2 cargadas con BTPDM1 500 nM durante 30 min. Se construyó un modelo de cubreobjetos y se cultivó en una incubadora multigas de concentración variable de O2 equipada con un microscopio fluorescente invertido, conectado al sistema de medición de por vida.

Las imágenes de microscopía de imágenes de vida útil de fosforescencia (PLIM) se registraron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un sistema de escaneo confocal (Hirakawa et al., 2018). Las imágenes PLIM se obtuvieron después de 30 min de incubación en O2 al 21 por ciento o O2 al 4 por ciento. Se tomaron cuatro imágenes PLIM por muestra, de las regiones superior, inferior, izquierda y derecha cerca del borde del cubreobjetos, para determinar el PL promedio, teniendo en cuenta la variación en los PL en un cubreobjetos.

2.13.3|Identificación del anillo HIF en una imagen PLIM

El pimonidazol fue positivo por debajo de 10 mmHg de presión de oxígeno. El PL equivalente a 10 mmHg de presión de oxígeno fue de 4034,6 ns, según la línea de calibración, por lo que se pudo identificar la línea exterior del círculo de pimonidazol en la imagen PLIM. Posteriormente, los sitios de los anillos HIF externos e internos en la imagen PLIM se pudieron encontrar utilizando un análisis cuantitativo de distancia. Medimos el rango de PL promedio equivalente al anillo HIF en 21 por ciento de O2 y 4 por ciento de O2.

2.13.4|Medición de la presión de oxígeno del anillo HIF

Calculamos el rango de presiones de oxígeno del anillo HIF a partir de los PL, utilizando la línea de calibración. Las imágenes PLIM se analizaron utilizando SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|análisis estadístico

Se utilizó la prueba de Dunnett para comparar los grupos experimentales y de control, y se consideró que los valores < 0,05="" indicaban="" diferencias="" estadísticamente="" significativas.="" se="" utilizaron="" pruebas="" t="" de="" student="" para="" comparar="" tres="" o="" más="" grupos,="" y="" se="" aplicó="" el="" valor="" p="" ajustado="" de="" bonferroni.="" todos="" los="" análisis="" estadísticos="" se="" realizaron="" utilizando="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" se="" supuso="" que="" los="" valores="" se="" derivaban="" de="" una="" población="" normalmente="" distribuida="" y="" se="" muestran="" como="" media="" ±="" desviación="" estándar="">

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3|RESULTADOS

3.1|Formación de gradiente de oxígeno en el modelo de hipoperfusión

Confirmamos la existencia de un gradiente de oxígeno en el modelo de hipoperfusión inducido por la colocación del cubreobjetos mediante la evaluación directa de la tensión de oxígeno mediante fosforescencia. La medición de la intensidad de la fosforescencia puede predecir una tendencia aproximada en la presión de oxígeno (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Observamos la intensidad de la fosforescencia de un modelo de cubreobjetos de células HK-2 tratadas con BTPDM1. Las imágenes de la intensidad de la fosforescencia mostraron hipoxia en la mayor parte del área dentro del cubreobjetos, pero no hipoxia cerca del borde, observación que sugería la existencia de un gradiente de oxígeno alrededor del borde del cubreobjetos en células HK-2 cubiertas con un cubreobjetos (Figura 1a). Dado que la intensidad de la fosforescencia depende de la concentración de la sonda y del tiempo de excitación, la medición de la vida útil de la fosforescencia (PL) es útil para el análisis cuantitativo de la presión de oxígeno (Yoshihara et al., 2015). Así, para la medición cuantitativa de la tensión de oxígeno de las células cultivadas alrededor del borde de un cubreobjetos, obtuvimos imágenes PLIM de células HK-2 cubiertas con un cubreobjetos durante 30 min (Figura 1b). PL se extendió a medida que aumentaba la distancia desde el borde del cubreobjetos. Confirmamos que la tensión de oxígeno, calculada mediante una línea de calibración (Figura S3), disminuyó a medida que aumentaba la distancia desde el borde del cubreobjetos, lo que proporciona evidencia de la existencia de un gradiente de oxígeno alrededor del borde del cubreobjetos (Figura 1c). El examen del perfil temporal de la intensidad de la fosforescencia indicó que el gradiente de oxígeno comenzó a formarse 10 minutos después de la colocación del cubreobjetos.

(Figura 1d).

3.2|Distribución única de HIF-1 en el modelo de hipoperfusión, "anillo HIF"

Examinamos la distribución HIF-1 en el modelo de hipoperfusión con un gradiente de oxígeno. El ICC de HIF-1 en células HK-2 mostró una mejora en forma de dona en el borde del área positiva para pimonidazol, que llamamos "anillo HIF" (Figura 2a). La intensidad de la señal HIF-1 fue significativamente mayor en el anillo HIF que en sus áreas internas o externas (Figura 2b). Este fenómeno se confirmó usando ICC con otro anticuerpo HIF-1 (Figura S4a) u otras líneas de células tubulares (Figura S4b,c). También realizamos un análisis ICC de HIF-1 en otros tipos de células cultivadas, como las células de cáncer de cuello uterino HeLa. Aunque la débil adhesión de estas células a un cubreobjetos dificultó una evaluación detallada de la distribución de HIF-1, observamos una mejora en forma de dona de HIF-1 en las células HeLa (Figura S4d).

El anillo HIF y el área positiva para pimonidazol comenzaron a formarse varias horas después de la colocación del cubreobjetos, y el anillo HIF apareció estático a las 3 h (Figura 2c). La caída de HIF-1 resultó en la desaparición de la señal HIF-1 , incluido el anillo HIF (Figura 2d, Figura S4e), lo que indica que el anillo HIF dependía de HIF-1 .

Para investigar la posibilidad de que la formación del anillo HIF dependa del oxígeno, investigamos la distribución de HIF-1 en el modelo de cubreobjetos bajo incubación con diferentes tensiones de oxígeno. Colocamos un plato en cámaras hipóxicas con diferentes tensiones de oxígeno inmediatamente después de hacer un modelo de cubreobjetos. Durante la incubación hipóxica, observamos que tanto el anillo HIF como el área positiva para pimonidazol parecían expandirse hacia afuera (Figura 3a). Medimos la distancia de cada anillo HIF y área positiva de pimonidazol desde el borde de un cubreobjetos bajo normoxia, 4 por ciento de O2 y 1 por ciento de incubación con O2. Tanto el anillo HIF como el área positiva de pimonidazol se expandieron hacia afuera a medida que disminuía la tensión de oxígeno circundante (Figura 3b). Estos resultados indicaron que el anillo HIF dependía de HIF-1 y de la tensión de oxígeno.

Para confirmar que la acumulación en forma de rosquilla es un fenómeno específico de HIF, realizamos ICC con genes de limpieza en el modelo de cubreobjetos. Las señales de actina y GAPDH se mantuvieron en toda el área de un cubreobjetos y fueron comparables entre la región del anillo HIF y las otras regiones (Figura S5a,b).

3.3|Medición del rango de presión de oxígeno del anillo HIF

Confirmamos la mejora en forma de anillo de la acumulación de HIF-1 en células cultivadas cubiertas con un cubreobjetos, un fenómeno que depende de la tensión de oxígeno. Para determinar el rango de tensión de oxígeno involucrado, analizamos la presión de oxígeno del anillo HIF utilizando una técnica de vida útil de fosforescencia. Obtuvimos imágenes PLIM del modelo de cubreobjetos después de 30 min de incubación en 21 por ciento de O2 o 4 por ciento de O2 (Figura 4a). El anillo HIF se formó en el borde del círculo de pimonidazol en el ICC de HIF (Figura 3b). Identificamos el sitio en la imagen PLIM que era equivalente al área positiva de pimonidazol en el ICC de HIF y posteriormente identificamos el sitio correspondiente al anillo HIF (Figura 4b), utilizando un análisis cuantitativo de los datos de distancia desde el anillo HIF y el área positiva para pimonidazol (Figura 3b). También medimos el rango de PL del anillo HIF y luego usamos una línea de calibración (Figura S3) para calcular la presión de oxígeno del anillo HIF en 21 por ciento de O2 (4.20 [3.46–4.97] ~35.9 [28.5–44.9] mmHg) , y 4 por ciento de O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Figura 4c).

3.4|Acumulación de HIF-1 bajo tensión de oxígeno homogénea

Si bien las señales débiles de HIF-1 fuera del anillo HIF en un modelo de cubreobjetos pueden atribuirse a una hipoxia insuficiente, aquellas dentro del anillo, donde HIF-1 debería haber sido más fuertemente activado por la menor tensión de oxígeno, deben ser controlado por un fenómeno independiente del oxígeno. Para examinar los fenómenos que causan la falta de acumulación máxima de HIF-1 en el área anóxica que ocurre solo en el modelo de hipoperfusión, examinamos si había una relación inversa entre la tensión de oxígeno y la acumulación de HIF-1 durante la incubación. con tensión de oxígeno homogénea. El análisis de transferencia Western de lisados ​​celulares bajo diferentes tensiones de oxígeno homogéneas mostró un aumento en la acumulación de HIF-1 durante la incubación anóxica (Figura 5a). El ensayo informador de luciferasa HRE también indicó que la acumulación de HIF-1 aumentó con una tensión de oxígeno más baja en condiciones de tensión de oxígeno homogénea (Figura 5b). Estos resultados indicaron que la acumulación de HIF-1 dependía de la tensión de oxígeno, observándose la acumulación máxima en el rango anóxico. Las características de HIF-1 deben variar entre un modelo de hipoperfusión y un modelo con tensión de oxígeno homogénea. Especulamos que el fenómeno único de la acumulación de HIF-1 en este modelo de hipoperfusión podría estar determinado por un factor distinto a la tensión de oxígeno.

3.5|La formación del anillo HIF fue independiente de PhD

Examinamos si la degradación de HIF-1, un posible mecanismo de formación del anillo HIF, estaba regulada positivamente dentro del anillo HIF. Esta idea parecía no ser válida, porque la hidroxilación por doctorado, un proceso limitante de la velocidad de degradación del HIF, requiere oxígeno como sustrato. El cloruro de cobalto se usa ampliamente como estabilizador químico de HIF. Construimos un modelo de cubreobjetos de células HK-2 tratadas con cloruro de cobalto y realizamos un análisis ICC de HIF. La señal HIF-1 no aumentó dentro del anillo HIF, lo que no quedó claro debido al aumento de la señal de HIF-1 fuera del anillo (Figura 6c). El ICC de las células HK-2 con eliminación de PHD2, que se cree que es la principal prolil hidroxilasa de HIF en los experimentos de cultivo celular (Strowitzki et al., 2019), produjo resultados similares (Figura S6). Estos resultados indicaron que el eje PHD-VHL de la degradación de HIF no estaba relacionado con la formación de anillos de HIF.

3.6|Impacto del pH en la acumulación de HIF-1

Un informe anterior describió el uso de un modelo de cubreobjetos de miocitos cardíacos que tenían una caída en el pH dentro del cubreobjetos (Pitts & Toombs, 2004). Investigamos el pH bajo un cubreobjetos y su impacto en la formación del anillo HIF. Tratamos las células HK-2 con un indicador de pH intracelular, cuya intensidad de fluorescencia permite la evaluación del pH en las células. Las imágenes en vivo mostraron que el pH disminuyó en la mayor parte del área interior, pero no cerca del borde del cubreobjetos, lo que sugiere la existencia de un gradiente de pH alrededor del borde en el modelo del cubreobjetos (Figura 6a). El análisis cuantitativo de la correlación entre la intensidad de la fluorescencia y la distancia desde el borde del cubreobjetos mostró que la primera aumentaba a medida que aumentaba la distancia, una observación que apoyaba la existencia de gradientes de pH y oxígeno alrededor del borde del cubreobjetos (Figura 6b). El análisis de transferencia Western de lisados ​​celulares bajo concentraciones homogéneas de oxígeno encontró que la incubación con medio de pH 5.0 suprimió la acumulación de HIF-1 bajo condiciones hipóxicas (Figura S7a–d). También confirmamos que la acumulación de HIF-1 bajo hipoxia en diferentes condiciones de pH disminuyó por debajo de pH 6,0 (Figura S8a–c).

Un informe enfatizó la importancia de las condiciones ligeramente ácidas, con un pH de alrededor de 6.0. Según este estudio, la reoxigenación después de la hipoxia acidificó los medios, lo que provocó el secuestro nucleolar de VHL. A su vez, se evitó la degradación de HIF en miotubos C2C12, neuronas PC12 y 786-0 células de cáncer renal (Mekhail et al., 2004). En nuestro estudio, no hubo cambios en la distribución de VHL en células tubulares entre las regiones con acumulación de HIF-1 y aquellas en las que se suprimió, en un modelo de cubreobjetos con valores de pH de 5.0 a 7.4 (Figura S9a–c). Las células tubulares están expuestas a una amplia gama de condiciones de pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), por lo que investigamos la variación del anillo HIF en medios de diferente pH. valores entre 5,0 y 8,5. El anillo HIF se observó claramente en medios con pH 8,5 y 7,4 (Figura 6c). El anillo HIF también existía a pH 6,5 pero estaba oscurecido (Figura 6c). La señal HIF-1 se atenuó en toda el área de un cubreobjetos a pH 5,0. (Figura 6c). Realizamos un análisis cuantitativo adicional de la relación posicional entre el anillo HIF y el borde del área positiva para pimonidazol (Figura 7a) y descubrimos que la posición del anillo variaba según el pH. El círculo interno tendió a expandirse hacia afuera a pH 6,5, en comparación con pH 7,4, mientras que el círculo externo se contrajo significativamente hacia adentro a pH 8,5, según el borde del área positiva para pimonidazol (Figura 7b,c). También confirmamos que las actividades de los genes de limpieza se mantuvieron en un modelo de cubreobjetos bajo incubación ácida (Figura S10). Por lo tanto, el pH parece desempeñar un papel importante en el mecanismo subyacente a la formación del anillo HIF.

4|DISCUSIÓN

En este estudio, identificamos una distribución única de HIF-1 en células tubulares renales, utilizando un modelo de hipoperfusión inducida por la colocación de cubreobjetos. Descubrimos que la formación y el mantenimiento del anillo HIF estaban regulados por la presión de oxígeno y el pH, los cuales existían en un gradiente en el borde del cubreobjetos de un modelo de cubreobjetos. Con base en estos resultados, proponemos un posible mecanismo para la formación del anillo HIF, que involucra la acumulación de HIF-1 con una tensión de oxígeno decreciente, y la acumulación se suprime debido al bajo pH dentro de una cierta distancia desde el borde de un cubreobjetos (Figura 8 ).

La hipoperfusión es inducida por la rarefacción de la microvasculatura en la ERC (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). En nuestro trabajo anterior, utilizamos imágenes in vivo para demostrar la presencia de un gradiente de oxígeno en células tubulares renales de riñones normales de ratón (Hirakawa et al., 2018). También se espera que la tensión de oxígeno sea heterogénea en las células tubulares en la ERC. Sin embargo, no está claro si la existencia de hipoperfusión con gradiente de oxígeno afecta al sistema de defensa frente a la hipoxia, HIF. En este estudio, investigamos la distribución de HIF en células del túbulo proximal cultivadas bajo un modelo de hipoperfusión y descubrimos que el gradiente de oxígeno en células tubulares renales cultivadas se modeló con éxito utilizando un cubreobjetos de vidrio redondo. Las pruebas de los experimentos que utilizan tensión de oxígeno homogénea indicaron que se acumulaba HIF-1, cuya hidroxilación y posterior degradación dependen principalmente del oxígeno. Esa es la cantidad de HIF-1 que aumenta a medida que disminuye la tensión de oxígeno. Sin embargo, en nuestro modelo de cubreobjetos, HIF-1 se suprimió en el área anóxica y tuvo la mayor acumulación a cierta distancia del borde del cubreobjetos. Esta acumulación de HIF en forma de rosquilla nunca se había mostrado antes. Mostramos que la formación de anillos HIF se podía observar independientemente de la tensión de oxígeno de la atmósfera de incubación, pero su ubicación dependía de la tensión de oxígeno. El rango de tensión de oxígeno en el anillo HIF se midió en aproximadamente 4-20 mmHg usando PLIM con BTPDM1. La mayoría de los estudios previos, que se centraron en células cultivadas en una atmósfera con una tensión de oxígeno homogénea, encontraron que la cantidad de proteína HIF-1 aumentaba en los rangos hipóxico o anóxico (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Por lo tanto, en nuestro modelo, la formación del anillo HIF debe haber sido afectada por un factor distinto a la tensión de oxígeno; era independiente del doctorado, un proceso limitante de la tasa de degradación de HIF. Un gran avance en la elucidación del mecanismo de formación del anillo HIF fue nuestro descubrimiento del papel del gradiente de pH, así como el gradiente de oxígeno, en el modelo de cubre labios, que limitaba la entrada de los medios de forma similar a una hipoperfusión in vivo. modelo. En este modelo de hipoperfusión, el pH intracelular disminuyó a medida que aumentaba la distancia desde el borde del cubreobjetos, y se observó un gradiente de pH alrededor del borde del cubreobjetos. Mostramos que la acumulación de HIF-1 se suprimió a un pH bajo, alrededor de un pH de 5,0, en comparación con la incubación a un pH casi neutro bajo una tensión de oxígeno homogénea. El borde exterior del anillo HIF se expandió hacia afuera a pH 6,5, y el borde interior del anillo HIF se contrajo hacia adentro a pH 8,5, según el borde del área positiva para pimonidazol. El anillo de HIF se oscureció en condiciones ácidas y la señal de HIF-1 se desvaneció a pH 5,0. Por lo tanto, aclaramos la importancia del pH para la formación del anillo HIF en un modelo de cubreobjetos. Demostramos la posibilidad de que el anillo HIF se haya formado por la supresión de la acumulación de HIF-1 por el bajo pH dentro del anillo.

Varios estudios previos que utilizaron el método del cubreobjetos han utilizado células cancerosas. Según un informe que utilizó la línea celular de hepatoma humano Hep3B, que expresa el corrimiento al rojo dependiente del oxígeno de la proteína verde fluorescente (AcGFP1), las imágenes en vivo de células cubiertas con un cubreobjetos rectangular mostraron un corrimiento al rojo a medida que aumentaba la distancia desde el borde del cubreobjetos (Takahashi & Sato, 2010). El espectro de emisión de las células de hepatoma cambió de la longitud de onda de la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) a la del rojo a medida que disminuía la tensión de oxígeno. En otro estudio, se midió la tensión de oxígeno de las células SCC-7 con un cubreobjetos redondo de 15-mm utilizando una técnica de vida útil de fosforescencia. La tensión de oxígeno fue de 6,9 ​​mmHg y 166 mmHg, calculada a partir de PL, que fue de 3,89 µs y 893 µs, 0–2 mm dentro y 0–1 mm fuera del borde del cubreobjetos, respectivamente (Yoshihara et al., 2015). El método del cubreobjetos también se ha utilizado con miocitos cardíacos, un sistema que ha llamado la atención como un modelo prometedor de isquemia-reperfusión in vivo. Kelly et al demostraron que los miocitos cubiertos con un cubreobjetos sufrieron cambios morfológicos marcados con el tiempo, acompañados de alteraciones en el potencial de la membrana mitocondrial y la dinámica de la membrana plasmática, lo que eventualmente resultó en la muerte de los miocitos. También demostraron que el pH intracelular de los miocitos cubiertos con un cubreobjetos cae rápidamente a un pH de aproximadamente 4 en el centro de un cubreobjetos (Pitts & Toombs, 2004). Un modelo de cubreobjetos, que inhibe la difusión de oxígeno o nutrientes a las células cultivadas debajo de un cubreobjetos, puede imitar un modelo in vivo de zonas isquémicas, normales y marginales en el centro, el exterior y el borde de un cubreobjetos, respectivamente. Varios estudios han utilizado este modelo como modelo de isquemia-reperfusión de miocitos in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primero en aplicar un método de cubreobjetos a las células tubulares. En nuestro sistema, la distancia desde el borde de un cubreobjetos hasta una región equivalente a 10 mmHg de tensión de oxígeno, donde el pimonidazol debería volverse positivo, fue de 1,22 mm, y la tensión de oxígeno disminuyó hasta cero dentro de una distancia de 2 mm desde el borde del cubreobjetos. . Este resultado puede ser compatible con informes anteriores que utilizaron cubreobjetos de alrededor de 15 mm, lo que demuestra la existencia de un gradiente de oxígeno al menos dentro de los 2 mm desde el borde (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Examinamos la tasa de apoptosis de las células bajo cubreobjetos (Figura S11) y descubrimos que GAPDH y actina se mantuvieron incluso dentro del anillo HIF, lo que indica que el anillo HIF no fue causado solo por la apoptosis celular o la muerte dentro del anillo HIF.

Varios estudios han medido la tensión de oxígeno en los riñones utilizando diferentes métodos. Algunos ejemplos de la medición de la tensión de oxígeno de los riñones normales fueron los siguientes: 50 mmHg y 30 mmHg en la corteza y la médula usando microelectrodos; y 49 mmHg y 41 mmHg en los segmentos S1 y S2 de células tubulares de la corteza usando PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). La tensión de oxígeno de los riñones enfermos sería menor. Según un informe anterior que utilizó microelectrodos de oxígeno, las ratas diabéticas tenían una tensión de oxígeno en el parénquima renal más baja: 36 mmHg y 11 mmHg en la corteza y la médula respectivamente (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Dado que los microelectrodos de oxígeno miden la tensión de oxígeno parenquimatosa promedio, se espera un rango más amplio en los riñones enfermos. La tensión de oxígeno intracelular disminuyó a cero mmHg en un modelo de riñón isquémico cuya arteria y vena renales laterales fueron pinzadas (Hirakawa et al., 2015). Teniendo en cuenta estos hallazgos, el rango de tensión de oxígeno en el anillo HIF, aproximadamente 4-20 mmHg, parecía plausible in vivo.

Además, descubrimos que el pH afectaba la formación del anillo HIF, así como la tensión de oxígeno. Dado que las células epiteliales tubulares del riñón están continuamente expuestas al líquido urinario, el pH de las células tubulares debería verse afectado por el de la orina. Teniendo en cuenta el amplio rango de pH de la orina, decidimos estudiar las células incubadas en un rango de pH de 5.0–8,5. Se han realizado estudios sobre el rango de pH en riñones normales. Un estudio encontró que el pH de la corteza era de 7,39 ± 0.{{10}}8, y el de la médula era de 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, medido con microelectrodos (Burke et al., 1999). Otro estudio, utilizando imágenes de pH basadas en MRI, mostró valores de pH de 7,3 ± 0,13 y 7,0 ± 0,29 respectivamente (Raghunand et al., 2003). Se informó que el pH renal disminuyó de 6,5 a 6,32, y tan bajo como 5,83 en un caso grave, en un modelo de ratón con ERC con acidosis (Pavuluri et al., 2019). Estas observaciones han proporcionado evidencia de la caída y variación del pH en la ERC. Sin embargo, el impacto del pH en el HIF-1 inducido por la hipoxia crónica en la ERC no ha sido suficientemente examinado. En el presente estudio, se observó un cambio del anillo HIF entre pH 6,5 y pH 7,4, un rango de pH plausible en la ERC. Este resultado apoyó la hipótesis de que una leve disminución del pH afecta la acumulación de HIF-1 en la ERC. En base a la evidencia de una caída del pH por debajo de 6,0 en casos graves de ERC, también es necesario evaluar el estado fisiológico del HIF-1 a un pH más bajo. Aunque ha habido informes de que un ambiente ácido, incluso en normoxia, estabiliza HIF-1 , la mayoría de estos informes investigaron condiciones de acidez leve, por encima de pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . En este trabajo, mostramos la supresión de la acumulación de HIF-1 en células tubulares a pH 5,0 y la atenuación de las señales de HIF-1 en un modelo de cubreobjetos incubado a pH 5,0. Por lo tanto, la disminución del pH renal en la ERC in vivo podría estar correlacionada con una activación insuficiente del HIF, así como con toxinas urémicas en el riñón hipóxico, lo que agrava la progresión de la ERC (Tanaka et al., 2013).

Nuestro estudio tiene varias limitaciones. Primero, en el área de hipoperfusión, los medios de cultivo deben ser deficientes en nutrientes, además de la presencia de deficiencia de oxígeno y disminución del pH. Sin embargo, es difícil delinear los efectos del pH, la tensión de oxígeno y otros factores inducidos por la hipoperfusión. En el cuerpo, la isquemia, hipoperfusión patológica de la sangre provocada por una combinación de bajo nivel de oxígeno y bajo nivel de nutrientes, se produce en órganos y células. Es importante comprender las diferencias entre la detección de hipoxia y la detección de isquemia. A pesar de la dificultad para dilucidar el efecto biológico de cada factor, nuestro modelo de hipoperfusión es fisiológicamente plausible, imitando el estado patológico in vivo. En segundo lugar, hacer un modelo de cubreobjetos requiere habilidad y práctica, ya que la mayoría de las células se desprendieron ocasionalmente durante la extracción de un cubreobjetos, especialmente cuando se utiliza el método tradicional (Figura S2a). Este problema dependía de la línea celular utilizada. Por ejemplo, nos resultó difícil aplicar un modelo de cubreobjetos a las células HEK 293 porque su adhesión al cubreobjetos era relativamente débil. En tercer lugar, era deseable minimizar el daño a las células cultivadas bajo un cubreobjetos. El número de células dañadas aumentaba a medida que aumentaba el período durante el cual estaban cubiertas, como lo muestra el análisis de la apoptosis. Determinamos que 3 h era apropiado para estimar el anillo HIF cuando parecía estar estático, y aproximadamente tan solo el 10 por ciento de las células se volvieron apoptóticas (Figura S11). La cuarta limitación fue la dificultad de unir células cultivadas a un cubreobjetos de manera uniforme en cada muestra (Figura S2b,c). La diferencia en la fijación entre un método tradicional y uno alternativo para hacer un modelo de cubre labios también podría haber afectado el estudio. Medimos el rango de tensión de oxígeno equivalente al anillo HIF mediante una técnica de vida útil de fosforescencia, en la que creamos un modelo de cubreobjetos utilizando un método tradicional. Dado que el anillo HIF durante la inmunocitoquímica se visualizó mediante un método alternativo, la tensión de oxígeno real podría ser diferente. Minimizamos estos errores usando la evidencia de que el pimonidazol fue positivo a 10 mmHg o menos de la tensión de oxígeno. La quinta limitación es que el pH intracelular no es necesariamente el mismo que el pH del medio de cultivo. Varios informes anteriores han demostrado que el pH intracelular es consistente con el pH medio hasta cierto punto en células cultivadas (Michl et al., 2019), solo pudimos evaluar la tendencia en el pH intracelular cambiando el pH medio. In vivo, la relación entre el pH de las regiones intracelulares y extracelulares, como la orina o los fluidos corporales, es más complicada que en las células cultivadas. Por lo tanto, en el futuro serán necesarios más estudios sobre la forma en que el cambio de pH regula la acumulación de proteína HIF-1 in vivo.

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Otra limitación es que el pH debería tener un efecto sobre el marcador de hipoxia, el pimonidazol. Comparamos la distancia del borde del área positiva de pimonidazol desde el centro de un cubreobjetos en diferentes condiciones de pH en nuestro modelo de cubreobjetos. El borde del área positiva para pimonidazol fue comparable entre pH 6,5, 7,4 y 8,5 (Figura S12a,b). Un estudio anterior también demostró el mantenimiento de la unión de pimonidazol a diferentes valores de pH (Kleiter et al., 2006). Con base en esta evidencia, concluimos que el pimonidazol es un marcador de hipoxia apropiado para nuestros experimentos con cubreobjetos. La limitación final es que, dado un rango de tensión de oxígeno entre aproximadamente 4 mmHg y 20 mmHg (0,52 por ciento de O2 a 2,6 por ciento de O2) del anillo HIF, las porfirinas Pt(II) y Pd(II), que se utilizan ampliamente como Las sondas de oxígeno tienen ventajas para medir concentraciones de oxígeno muy bajas debido a su vida útil de fosforescencia significativamente más larga en comparación con las que usan complejos Ir (III) (Yoshihara et al., 2017). Sin embargo, en general, una medición cuantitativa de oxígeno basada en la fosforescencia, calculada mediante la ecuación de Stern-Volmer, tiene un mejor desempeño en rangos bajos de O2 (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Varios estudios anteriores han demostrado la medición basada en el complejo Ir(III) de tensiones de oxígeno tan bajas como aproximadamente 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Por lo tanto, creemos que el rango de tensión de oxígeno del anillo HIF debería ser un resultado preciso.

5|CONCLUSIONES

En resumen, descubrimos que comprender las funciones tanto del oxígeno como del pH es esencial para comprender el estado fisiológico de HIF-1 en la ERC, y se puede obtener investigando las células tubulares con hipoperfusión. El modelo de cubreobjetos, con sus limitaciones de entrada de medios, fue un buen modelo de hipoperfusión in vivo, especialmente en los túbulos en la ERC, ya que la rarefacción de los capilares peritubulares es una característica importante de la ERC (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Este modelo de hipoperfusión también puede imitar los gradientes de oxígeno y pH in vivo, como tumores y lesiones isquémicas. El modelo proporciona un enfoque prometedor para la elucidación de estos mecanismos biológicos.

CONFLICTO DE INTERESES

Todos los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES

Todos los autores contribuyeron a la formación del concepto general. TH realizó los experimentos en general. TH y YH analizaron los resultados e hicieron las cifras. TH escribió el manuscrito original. KM, TY y ST realizaron el experimento utilizando una técnica de vida útil de fosforescencia y editaron parte del manuscrito. YH, TT y MN editaron el manuscrito general. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

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