Una nanopartícula dirigida al riñón para aumentar la densidad linfática renal disminuye la presión arterial en ratones hipertensos
Nov 10, 2023
Abstracto:Inflamación intersticial crónicay la infiltración renal de células inmunes activadas juega un papel integral en la hipertensión. Los linfáticos regulan la inflamación a través deeliminación de células inmunesy exceso de líquido intersticial. Anteriormente demostramosaumento de la linfangiogénesis renalPreviene la hipertensión en ratones. Presumimos que la administración dirigida de nanopartículas del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) al riñón induciría la linfangiogénesis renal, lo que reduciría la presión arterial en ratones hipertensos. Se cargó una nanopartícula dirigida al riñón con una forma específica del receptor de VEGF-3-de VEGF-C y se inyectó en ratones con hipertensión inducida por angiotensina II o hipertensión inducida por LNAME cada 3 días. Los ratones tratados con nanopartículas mostraron una mayor densidad y anchura de los vasos linfáticos renales en comparación con los ratones hipertensos a los que se les había inyectado VEGF-C solo. Los ratones tratados con nanopartículas mostraron una disminución de la presión arterial sistólica, una disminucióncélulas inmunes renales proinflamatoriasy aumento de la excreción urinaria fraccionada de sodio. Nuestros hallazgos demuestran que la expansión farmacológica de los linfáticos renales disminuye la presión arterial y se asocia con alteraciones favorables encélulas inmunes renalesyaumento de la excreción de sodio.
Palabras clave:riñón; linfáticos;inflamación; inmunidad; hipertensión
OBTÉN LA FORMULACIÓN HERBARIA DE CISTANCHE PARA RIÑONES
1. Introducción
Casi 1 de cada 2 adultos estadounidenses tiene hipertensión y en muchos pacientes no se controla [1]. A pesar de una mejor educación, los esfuerzos de salud pública y los medicamentos recetados, alrededor del 30% al 60% de los pacientes hipertensos no pueden alcanzar la presión arterial ideal. Esto es lamentable, ya que una disminución de la presión arterial sistólica de incluso 10 mmHg reduce significativamente los riesgos para la salud y mejora los resultados [2]. Se necesitan opciones de tratamiento adicionales para ayudar a esta población hipertensa a reducir su presión arterial, idealmente hasta el rango normotenso.
La infiltración de células inmunes renales, la inflamación y la retención de sodio están fuertemente asociadas con la hipertensión [3-5]. Los vasos linfáticos transportan líquido, electrolitos, células y proteínas desde el espacio intersticial hasta el ganglio linfático de drenaje y luego de regreso a la circulación [6,7]. La linfangiogénesis asociada a la inflamación se observa en la lesión renal aguda y enenfermedades inflamatorias crónicascomonefropatía diabéticaycarcinoma renal[8]. en unestado inflamatorio, un aumento de los vasos linfáticos intenta ayudar con la eliminación de células inmunitarias, proteínas y líquido del órgano. Hemos informado anteriormente que la linfangiogénesis también ocurre en el riñón como una respuesta compensatoria en varios modelos de hipertensión [9-11]. Sin embargo, este aumento compensatorio de los linfáticos renales no fue suficiente para resolver la inflamación y la hipertensión. La inducción genética de linfangiogénesis renal específica en ratones previno el desarrollo de hipertensión sensible a la sal, hipertensión inducida por la inhibición del óxido nítrico (L-NAME) (LHTN) e hipertensión inducida por angiotensina II (A2HTN), y esto se asoció con una reducción en acumulación de células inmunes renales y aumento de la excreción de sodio [9,11,12]. Además, la inducción genética de la linfangiogénesis renal específica en ratones atenuó la LHTN existente, y esto fue acompañado por un aumento en la excreción de sodio [12].
Aquí, queríamos desarrollar una posible terapia traslacional que se dirigiera específicamente al riñón y promoviera la linfangiogénesis para disminuir la presión arterial en condiciones de hipertensión. Utilizamos tecnología de nanopartículas para la administración de factor de crecimiento linfático específico según informes anteriores sobre nanopartículas dirigidas a los riñones [13-15]. Existen otros sistemas de administración de fármacos que utilizan nanopartículas y todos están destinados a mejorar la eficiencia, la especificidad y la biodisponibilidad. Las nanopartículas pueden diseñarse para exhibir propiedades fisicoquímicas únicas, como el tamaño (50 ~ 200 nm), la forma y la química de la superficie, y pueden equiparse para transportar uno o más agentes de diagnóstico y/o terapéuticos y liberarlos a través de desencadenantes externos como la temperatura. , pH y enzimas. Además, la encapsulación de esos agentes terapéuticos o de diagnóstico dentro de nanopartículas les permite mejorar sus vidas medias sistémicas y, por lo tanto, pueden localizarse significativamente en el área objetivo. Actualmente, existen diversas nanopartículas que incluyen micelas, liposomas, nanoesferas, nanotubos, nanocápsulas, cubosomas e hidrogeles en función de su morfología. Aquí probamos nanopartículas micelares y liposómicas para determinar cuál era más efectiva.
Nuestra hipótesis era que una nanopartícula dirigida al riñón que administra un factor de crecimiento prolinfangiogénico, una isoforma específica del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular-3 (VEGFR-3) del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) , aumentaría la densidad linfática renal y disminuiría la presión arterial en ratones machos y hembras con A2HTN o LHTN. También planteamos la hipótesis de que la disminución de la presión arterial se asociaría con una disminución de las células inmunitarias renales proinflamatorias, un aumento de las células inmunitarias renales antiinflamatorias y un aumento de la excreción de sodio. Debido a la larga duración para inducir la hipertensión sensible a la sal y al número limitado de inyecciones en la vena de la cola en ratones, este modelo no se utilizó en el estudio actual.
2. Materiales y métodos
2.1. Desarrollo y caracterización de nanopartículas.
El copolímero de bloque PLGA-PEG-folato se adquirió de PolySciTech (West Lafayette, IN, EE. UU.) y en la Figura S1 se puede ver el Certificado de análisis que muestra la RMN, el análisis FTIR y el GPC. Usando 50 mg de copolímero de bloque PLGA-PEG-folato, se encapsularon 10 mg de colorante cumarina 6, 10 mg de ovoalbúmina FITC o 1 mg de VEGF-C en las nanopartículas usando un método de diálisis para producir micelas. nanopartícula 1 (NP1). Específicamente, el fármaco y el polímero se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) y la solución se transfirió a una membrana de diálisis (MWCO 100,000). La diálisis se realizó durante 24 h frente a agua DI. Después de eso, la solución acuosa de partículas se centrifugó y se sonicó para concentrar las partículas. Para fabricar la nanopartícula liposomal, utilizamos varios componentes lipídicos, incluidos DSPC (120 mg), colesterol (16 mg), DSPE-PEG-folato (24 mg) y colorante Cumarina 6 (10 mg) o FITC-ovoalbúmina (10 mg). . Primero, todos los componentes anteriores se disolvieron en DCM (10 ml) y luego se eliminó el DCM mediante un flujo de aire para formar una película delgada sobre la superficie de los viales de vidrio. A continuación, se agregaron 10 ml de PBS a la película delgada para producir la nanopartícula liposomal 2 (NP2). El tamaño de las nanopartículas se determinó mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Zetasizer (Malvern Panalytical, Malvern, Reino Unido). La concentración de la muestra se mantuvo en 0,5 mg/ml. La cantidad de encapsulación del tinte Cumarina 6 se derivó de su medición de absorbancia disolviendo 100 µL de nanopartículas en 900 µL de DMSO, lo que liberó Cumarina 6 en la solución de DMSO.
Luego se midió la absorbancia a 444 nm. Utilizando una curva de calibración previamente medida de la absorbancia de Cumarina 6 según su concentración titulada, se calculó la concentración de Cumarina 6 encapsulada (NP1: 5 ± 0.35 mg y NP2: 4 ± {{10 }}.89 mg para cumarina 6). Utilizando una curva de calibración previamente medida de la absorbancia de ovoalbúmina FITC según su concentración titulada, se calculó la concentración de ovoalbúmina FITC encapsulada (4 ± 0,51 mg). La cantidad de encapsulación de VEGF-C dentro de NP se determinó mediante ELISA y fue ~500 ± 17 µg. Todas las NP estaban recubiertas con folatos que las dirigen a los túbulos proximales del riñón, dada la alta expresión de los receptores de folato. En la Figura S2 se puede ver un esquema que muestra el conjunto NP.
Los perfiles de liberación de cumarina 6 o FITC-ovoalbúmina se estudiaron utilizando un método de diálisis con tubo de membrana. Se añadió un ml de solución de nanopartículas a un tubo de diálisis (PM de corte 3500) y luego se sumergió en 10 ml de PBS que contenía una solución de Tween 80 al 0,5 % v/v. En el momento indicado, los medios fueron recogidos y reemplazados. La intensidad de fluorescencia de las muestras recolectadas se midió en Ex/Em=444/500 nm (cumarina 6) o Ex/Em=488/530 nm para FITC-ovoalbúmina usando un lector de microplacas. El% de liberación acumulada de cumarina 6 y ovoalbúmina FITC de las nanopartículas de folato se puede ver en la Figura S3.
Para el estudio de microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL JEM-2010, Japón), se dejaron caer suspensiones de muestras sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono y se secaron en condiciones de vacío. Luego se observó la rejilla bajo un microscopio electrónico de transmisión JEOL a un voltaje de aceleración de 200 kV. Para determinar la biodistribución in vivo, se inyectaron 100 µl de cada NP1 (10 mg/ml) o NP2 (10 mg/ml) en ratones hembra C57BL/6J (n=3) a través de la vena de la cola. Las señales de fluorescencia de Cumarina 6 se registraron a Ex/Em=444/500 nm. Doce horas después de la inyección, los animales fueron sacrificados y se recogió cada órgano. Los órganos extraídos se escanearon con un escáner In Vivo FX Pro para cuantificar la distribución de NP. Todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por la IACUC de la Universidad Texas A&M de acuerdo con la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
2.2. Ratones
Se adquirieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE. UU.). A ratones machos y hembras de 10–14 semanas de edad se les implantaron quirúrgicamente bajo anestesia con isoflurano inhalado (1,5–5%) con minibombas osmóticas (Alzet, modelo 1004, Cupertino, CA, EE. UU.) que contenían angiotensina II (490 ng/kg/min; BACHEM, Torrance, CA, EE. UU.) (A2HTN), seguido de lidocaína tópica. A otro grupo de ratones machos y hembras se les administró L-NAME (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) en el agua potable (0,5 mg/ml) durante la duración del experimento (LHTN). Después de 2 días, se confirmó la hipertensión mediante la presión arterial en el manguito de la cola en todos los grupos. Luego, los ratones fueron aleatorizados y se les inyectó en la vena de la cola una nanopartícula micelar cargada con el mutante específico VEGFR-3-de VEGF-C (VEGF C c156s) [16] o proteína VEGF-C libre sola cada 3 días durante el curso de 16 días (4 inyecciones totales en la vena de la cola). Este programa de inyección se modeló a partir de trabajos anteriores [17] y permitió que se produjera el tiempo adecuado para que se produjera la remodelación vascular a un nivel suficiente para afectar la presión arterial. Además, el período de descanso de 3- días extendió la vida de las frágiles venas de la cola murina mientras mantenía constante la señal prolinfangiogénica. Incluso con el período de recuperación, las venas de la cola solo pudieron soportar 5 inyecciones antes de sufrir daños irreparables. Todos los ratones fueron sacrificados 16 días después de la inyección inicial. Los ratones fueron sacrificados mediante perfusión tisular bajo anestesia profunda con isoflurano y luego dislocación cervical antes de la recolección de tejido. Todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por la IACUC de la Universidad Texas A&M de acuerdo con la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
2.3. Presión arterial
Se tomaron lecturas de la presión arterial sistólica (PAS) en varios momentos mediante un manguito en la cola. Para todas las mediciones se utilizó el sistema de adquisición de presión arterial no invasivo IITC Life Science para ratones (IITC Inc., Woodland Hills, CA, EE. UU.). Se tomaron las presiones arteriales después de un período de aclimatación de 30-min en un área tranquila designada. Durante este tiempo, se permitió que la cámara de calentamiento y las cámaras de restricción se calentaran a 34 ◦C. Los ratones se cargaron suavemente en cámaras de sujeción del tamaño adecuado y se dejaron aclimatar en la cámara de calentamiento durante 5 minutos antes de las mediciones de la PAS. Las mediciones de la PAS se derivaron de los trazados de presión realizados por dos investigadores ciegos e independientes.
2.4. Recolección y medidas de suero y orina
Recolección y medidas de suero y orina: Los ratones se colocaron en jaulas metabólicas (Hatteras, Cary, NC, EE. UU.) y se les permitió aclimatarse durante la noche. Después de la aclimatación, se recogió orina durante 24 h, concluyendo con la eutanasia. Se midió la orina recolectada. Se recogió sangre en el momento de la eutanasia a través del ventrículo izquierdo y se aisló suero para medidas posteriores. El suero y la orina se analizaron mediante electroforesis capilar para determinar el sodio utilizando un analizador químico DxC 700 AU (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.) y mediante potenciometría directa para la creatinina utilizando un sistema de electroforesis capilar P/ACE MDQ Plus (Sciex, Redwood City, CA). , EE.UU). Estas medidas se utilizaron para calcular la excreción urinaria, la excreción fraccionada de sodio (FENa) y el aclaramiento de creatinina.
2.5. inmunofluorescencia
En el momento de la eutanasia, se recogieron los riñones, se cortaron sagitalmente en mitades y se fijaron en una solución de formalina tamponada al 10% (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 48 h. Después de la fijación, las mitades de los riñones se lavaron en etanol al 100% y se incluyeron en parafina. Las mitades de los riñones se cortaron en secciones de 5 a 7 µm, que se desparafinaron, rehidrataron y permeabilizaron con una solución de Triton al 0,1% (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). El tejido se bloqueó con una solución AquaBlock al 10 % (EastCoastBio, North Berwick, ME, EE. UU.) antes de inmunomarcarlo con los marcadores de células endoteliales linfáticas LYVE-1 o podoplanina (policlonal de cabra; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) durante la noche. incubación a 4 ◦C. Se utilizaron anticuerpos secundarios Alexafluor 488 o 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) para visualizar los vasos linfáticos. Las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios apropiadamente conjugados durante una hora a temperatura ambiente. Los controles negativos se incubaron sólo con un anticuerpo secundario. Todos los portaobjetos etiquetados se montaron con reactivo anti-decoloración ProLong Gold que contenía DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Para obtener imágenes se utilizó un sistema de microscopía de fluorescencia Olympus BX51 con una cámara Olympus Q5. Las imágenes se capturaron con un aumento de 40 × utilizando el software de imágenes Olympus CellSens (Olympus, Shinjuku, Tokio, Japón). Se utilizaron los mismos métodos para obtener imágenes de los vasos linfáticos del corazón, el hígado, los pulmones y la piel (aumentos de 10x o 20x).
2.6. Inmunofluorescencia renal
Cuantificación De cada sección de riñón, se recogieron de 5 a 7 imágenes a 20 aumentos de áreas predeterminadas, evitando generalmente defectos tisulares, cáliz menor y una gran cantidad de glomérulos. ImageJ se utilizó para recopilar valores de área que miden el número total de píxeles de podoplanina+ después de establecer el umbral para endotelio positivo.
2.7. Cuantificación del ancho máximo de los vasos linfáticos renales
De cada sección de riñón, se recogieron imágenes de todos los vasos linfáticos asociados a las arterias dentro de la corteza a 20×. Los vasos linfáticos se identificaron por la presencia de tinción con podoplanina. Se utilizó ImageJ para recopilar la longitud en píxeles del punto más ancho de todos los vasos linfáticos que contienen luz.
2.8. Citometría de flujo
En el momento de la eutanasia, se recogieron los riñones y se retiraron las cápsulas. El tejido se trituró completamente y se digirió en tampón que contenía colagenasa D (2,5 mg/ml, Roche Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y Dispasa II (1 mg/ml, Sigma) a 37 ◦C durante 1 h. Las muestras digeridas se filtraron y enjuagaron a través de coladores de 100 y 40 µm. El flujo se centrifugó para aislar los componentes celulares y los glóbulos rojos se lisaron en NH4Cl/EDTA. Los esplenocitos se aislaron de manera similar para su uso como controles de anticuerpos y para la dispersión directa versus lateral del tamaño y la forma de las células inmunes. Las células renales se resuspendieron en solución de FBS al 0,1%. Para evitar la unión inespecífica de Fc, las muestras se incubaron con un anticuerpo anti-ratón CD16/CD32 (BD Pharmingen, San José, CA, EE. UU.) durante 10 minutos en hielo. Luego, las células se incubaron con anticuerpos conjugados fluorescentes contra CD45, F4/80, CD11c y CD3e y se filtraron a través de otro filtro estéril de 40 µm. Todos los anticuerpos se adquirieron de BD Biosciences. Consulte la Tabla S1 en línea para ver el panel descriptivo. Para la adquisición se utilizó un citómetro de flujo BD LSR Fortessa X-20 con software FACS DIVA (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.). Se analizaron poblaciones de hasta 500,000 células utilizando FlowJo v10.6.2.1 (FlowJo, LLC, Ashland, OR, EE. UU.). Las poblaciones de CD3e+ se cuantificaron dentro de la puerta CD45+. Las poblaciones CD3e PacBlue+ fueron negativas para los fluoróforos PE y PerCP-Cy5.5. Las poblaciones F4/80+ y CD11c+ se cuantificaron dentro de la puerta CD45+/CD3e- (Figura S4). Estas poblaciones fueron negativas para los fluoróforos PacBlue, APC y APC-Cy7. Los resultados se expresan como porcentaje del total de células CD45+ por riñón. La estrategia de activación se puede encontrar en la Figura S4. La información de los anticuerpos se encuentra en la Tabla S1.
2.9. Estadísticas
Los resultados se presentan como diagramas de puntos y medias o media ± SEM. Las diferencias entre 2 grupos se evaluaron mediante una 2-prueba t de Student no apareada de colas y entre 3 o más grupos con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Student-Newman-Keuls. El nivel de significancia se fijó en 0.05 para todas las comparaciones. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SigmaPlot 10 (Systat, San José, CA, EE. UU.).
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