Un nuevo modelo de ratón atáxico de ataxia telangiectasia causado por una mutación sin sentido clínicamente relevante (Parte 1)

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Resumen

La ataxia telangiectasia (AT) y la ataxia con apraxia ocular tipo 1 (AOA1) son trastornos neurológicos devastadores causados ​​por mutaciones nulas en los genes de estabilidad del genoma, AT mutado (ATM) y aprataxina (APTX), respectivamente. Nuestra comprensión mecánica y el repertorio terapéutico para tratar estos trastornos son muy escasos, en gran parte debido al fracaso de modelos animales anteriores con mutaciones nulas similares para recapitular la pérdida característica de la coordinación motora (es decir, ataxia) y los defectos cerebelosos asociados. Al aumentargenotóxicoestrés a través de la inserción de mutaciones nulas en los genes Atm (sin sentido) y Aptx (knockout) en el mismo animal, hemos generado un nuevo modelo de ratón que por primera vez desarrolla un fenotipo atáxico progresivamente severo asociado con atrofia del cerebelo molecular capa. Encontramos que las propiedades biofísicas de las neuronas de Purkinje del cerebelo están significativamente perturbadas (por ejemplo, capacitancia de membrana reducida, umbrales de potencial de acción más bajos, etc.), mientras que las propiedades de las entradas sinápticas permanecen prácticamente sin cambios. Estasperturbacionesalterar significativamente la actividad neuronal de la neurona de Purkinie, incluida una reducción progresiva en la activación del potencial de acción espontáneo

la frecuencia que se correlaciona tanto con la atrofia cerebelosa como con la ataxia durante el primer año de vida del animal. Los ratones doblemente mutantes también exhiben una alta predisposición a desarrollar cáncer (timomas) y anomalías inmunitarias (alteración del desarrollo temprano de timocitos y la maduración de células T), síntomas característicos de AT. Por último, al insertar una mutación nula de tipo sin sentido clínicamente relevante en Atm, demostramos que los compuestos de lectura directa de moléculas pequeñas (SMRT) pueden restaurar la producción de ATM, lo que indica su potencial como un futuro terapéutico de AT.

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1.0 Introducción

La ataxia telangiectasia (AT) es un trastorno genético autosómico recesivo raro (1 en ~ 100,000) (Swift et al. 1986) caracterizado por predisposición al cáncer, inmunodeficiencia y una ataxia grave y progresiva altamente penetrante vinculada a la atrofia cerebelosa (Rothblum-Oviatt et al. 2016; Boder y Sedgwick 1958; Levy y Lang 2018). Los pacientes con TA generalmente mueren en la segunda o tercera década de su vida (Crawford et al.2006) debido a cánceres linfáticos, infecciones respiratorias o complicaciones de la ataxia; desafortunadamente, la capacidad de supervivencia no ha cambiado drásticamente desde la década de 1950 (Micol et al.2011; Rothblum- Oviatt et al.2016). Si bien la progresión de la enfermedad y la causa de la muerte varían ampliamente entre pacientes, se informa que la disminución progresiva altamente penetrante en la coordinación motora tiene el mayor impacto negativo en la calidad de vida de un paciente (Jackson et al.2016). El cuidado es generalmente paliativo, dirigido a reducir, limitar o eliminar cánceres o infecciones. No hay terapias a largo plazo disponibles para tratar la ataxia y la disfunción y atrofia cerebelosa asociadas. AT es causado por deficiencia o disfunción del cajero automático (AT mutado) proteína (Savitsky et al. 1995). El codón de terminación prematura (PTC) que causa mutaciones sin sentido representa hasta la mitad de los casos conocidos, y también contribuyen las mutaciones sin sentido y deleción (Concannon y Gatti 1997; Sandoval et al. 1999). ATM es una quinasa de la familia PIKK de serina/treonina que desempeña un papel clave en la respuesta al daño del ADN (DDR), protegiendo a las células de las decenas de miles de lesiones en el ADN que se producen cada día (Lindahl y Barnes 2000; Kastan y Bartek 2004; Shiloh y Ziv 2013). En la forma monomérica activa, ATM fosforila varias proteínas clave que detienen la producción de ADN nuevo (detención del ciclo celular) (Ando et al. 2012), y luego, dependiendo de la gravedad del daño, inicia la reparación del ADN o la activación celular programada. muerte (es decir, apoptosis)(Ando et al.2012; Rashi-Elkeles et al.2006). Se han identificado varios objetivos de la vía DDR aguas abajo de ATM, incluidos p53, CHK2, BRCA1, SMC1 y NBS1 (Matsuoka et al. 2007). El papel de ATM en la reparación del ADN también está implicado en el desarrollo normal del sistema inmunitario, donde se propone contribuir a la recombinación del empalme del ADN natural que ocurre durante el reordenamiento genético en la maduración de los linfocitos T y B (Chao, Yang y Xu 2000; Matei, Guidos y Danska 2006; Vacchio et al.2007; Schubert, Reichenbach y Zielen 2002) ). Aunque sus funciones aún están emergiendo, la ATM también se ha implicado en la homeostasis del estrés oxidativo (Guo et al. 2010) y la mitofagia (Valentin-Vega y Kastan 2012; Pizzamiglio, Focchi y Antonucci 2020). No está claro por qué la deficiencia de ATM causa ataxia, pero está lejos de ser la única proteína DDR relacionada con la ataxia, como Aprataxin.APTX) (Aicardi et al.1988), Recombinación meiótica 11 homólogo 1(MRE11)(Sedghi et al.2018), Nibrina (NBS1)(van der Burgt et al.1996), Senataxina (SETX) (Moreira et al.2004) , y Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1 (TDP1)(Takashima et al. 2002) cuando están ausentes o son disfuncionales pueden causar ataxia relacionada con el cerebelo. Esto sugiere que las características neurológicas de los síndromes de inestabilidad del genoma tienen una causa subyacente común, aunque esto aún no se ha demostrado mecánicamente (McKinnon 2009; Rass, Ahel y West 2007). Un factor importante que limita nuestra capacidad para definir por qué la pérdida de proteínas DDR, como ATM, afecta selectivamente al cerebelo y causa ataxia progresiva es la falta de un modelo animal que recapitule estos síntomas neurológicos (Lavin 2013). Se han creado varios modelos de roedores AT en los últimos años mediante la inserción de mutaciones genéticas que causan disfunción de proteínas (falta de actividad quinasa) o deficiencia completa (Herzog et al. 1998; Xu y Baltimore 1996; Elson et al. 1996; Spring et al. 2001, Campbell et al.2015, Quek et al.2016, Tal et al.2018, Lavin 2013); También se informó recientemente de un minipig (Beraldi et al. 2017). Sin embargo, ninguno desarrolla ataxia progresiva y manifiesta con disfunción cerebelosa y atrofia que recapitula la enfermedad humana, aunque sí se desarrollan otros aspectos del trastorno como cánceres de tiroides, infertilidad y anomalías inmunitarias. No está claro por qué estos modelos animales anteriores no muestran el fenotipo atáxico progresivo (Lavin 2013). Es posible que las compensaciones moleculares específicas de la especie en ratones proporcionen redundancias o vías alternativas que minimicen los efectos de la deficiencia de ATM en el cerebro (El-Brolosy y Stainier 2017). También es posible que la vida útil más corta de los modelos anteriores (Barlow et al. 1996) sea demasiado breve para que los mecanismos estocásticos que impulsan la disfunción y la atrofia del cerebelo se acumulen y afecten el comportamiento motor. Otros desafíos incluyen manipulaciones genéticas potencialmente con fugas que dan como resultado niveles bajos de proteína ATM o fragmentos activos con actividad de quinasa residual, lo que limita la neuropatología (Li et al. 2011). El impacto de perder un modelo animal tan crucial ha

sido significativo, limitando gravemente la identificación de los mecanismos celulares y moleculares de los estudios experimentales y obstaculizando el desarrollo preclínico y las pruebas de terapias muy necesarias. Probamos aquí si el aumento del estrés genotóxico, al colocar mutaciones nulas no solo en el gen Atm, sino también en el gen Aptx relacionado, conduce a un modelo de ratón más representativo que muestra disfunción cerebelosa, atrofia y el desarrollo de ataxia progresiva. Elegimos eliminar Aptx adicionalmente porque su deficiencia causa un trastorno similar a AT en humanos llamado ataxia con apraxia ocular tipo 1 (AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T) en el gen Atm común a una gran familia de pacientes de AT del norte de África (Gilad, Bar-Shira, et al. 1996). Esta mutación da como resultado un codón de terminación prematuro (PTC) en lo que normalmente sería el aminoácido 35 y la pérdida de la traducción ATM. Aquí, informamos experimentos de prueba de principio que demuestran que las mutaciones genéticas clínicamente relevantes incorporadas en el modelo de ratón AT son susceptibles de lectura de compuestos y, por lo tanto, apropiadas para pruebas preclínicas de compuestos SMRT.

2.0 Resultados

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>La mutación T da como resultado diferentes PTC en el gen humano en comparación con el ratón Atmgen—TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>La mutación T transforma el codón CAG que codifica la glutamina (Q) en un codón de parada TAG y se denota Atm235 × (oficialmente Atmm1.103c) tiempo). La presencia del PTC da como resultado una pérdida de expresión de ATM, ya sea reducida a aproximadamente la mitad en el heterocigoto que expresa una copia de ratón normal del

o Atm Q35v35×) (Fig. o Atm 835×), o completamente en el homocigoto (gen Atm?35×R35×Atm (Atm35× más 1C).

Atm35x7R35×; Se crearon ratones Aptx^ (doble mutante) cruzando primero ratones AtmF3xR3x mutantes simples (congénicos en el fondo C57BL/6J) y Aptx' (mezcla C57BL/6J y fondo 129) con ratones Aptx*. F1-5 camada Atm"; luego se cruzaron ratones Aptx* para generar heterocigotos Atm dentro de las camadas para crear un número suficiente de los genotipos experimentales y de control deseados para determinar cómo la pérdida de diferentes cantidades de ATM y APTX afecta el fenotipo del animal ( Fig. 1D).

Al igual que los modelos anteriores de ratones AT con deficiencia de ATM, la deficiencia de ATM o APTX por sí sola no resultó en ratones con ataxia (Video 1 y 2). Sin embargo, la deficiencia en ambas proteínas (Atm35k35x; Aptx') da como resultado el desarrollo de un fenotipo grave y progresivamente atáxico (Fig. 1E, Video 3 y 4).

2.2 Los ratones con deficiencia de ATM tienen una menor capacidad de supervivencia y una alta incidencia de timomas

Evaluamos la salud general y el desarrollo de ratones de control y experimentales que expresaban diferentes niveles de ATM y APTX (Fig. 2). Encontramos que Atm735xR35×; Los ratones Aptx^' crecieron ~ 55 por ciento más lento y alcanzaron pesos de meseta estimados que fueron ~ 35 por ciento menos que los genotipos de control (rango logarítmico, n=21 a 40, p<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0.4 para todas las comparaciones por pares; Fig.2-fig.S1B]. En general, un tercio de los ratones con deficiencia de ATM murió por complicaciones relacionadas con grandes cánceres tímicos (timoma) que se encuentran en la cavidad torácica (Fig. 2C). La presencia o ausencia de APTX no afectó la prevalencia del cáncer, y los ratones con al menos una transcripción Atm estaban libres de cáncer hasta al menos P400. En general, la deficiencia de ATM, pero no de APTX, tuvo efectos graves en la salud y la capacidad de supervivencia de los ratones.

2.3 Tanto la deficiencia de ATM como la de APTX son necesarias para producir una disfunción motora progresiva

El desarrollo progresivo de ataxia grave es una característica distintiva de la AT que se recapitula en el Atm? 35/R35x; Ratones Aptx' pero ninguno de los otros genotipos de control que probamos. En general, encontramos que los déficits de coordinación motora surgen entre 210 y 400 días después del nacimiento en Atm735Xk3x; Aptxmice y no encuentra evidencia de ataxia en ratones con al menos una copia del gen Atm o Aptx (Fig. 3A, B). Para la prueba de poste vertical, Atm735xR3x×; Los ratones Aptx' tardaron el doble en descender en P400 en comparación con Atm*;Aptx*,Atm*; Aptx',Atm735xR35×; Aptx* o Atm35×*; Ratones Aptx' [macho: 29,1 ± 0,9 s (n=3) frente a 7,5 ± 0,4 s (n=12), 12,5 ± 2,5 s (n=9), 9,2 ± 0,9 s (n=10),8.6±0.9s(n=11),1-vía ANOVA,F4.40=19.9,p<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4 Las propiedades sinápticas y de la membrana están perturbadas en las neuronas de Purkinje con deficiencia de ATM y APTX

Las neuronas de Purkinje (PN) son un subtipo neuronal clave ubicado en la corteza cerebelosa. Muestran una excitabilidad intrínseca considerable, disparando potenciales de acción de forma espontánea a velocidades significativamente más altas que la mayoría de las demás neuronas del cerebro (50 a 100 Hz más en muchos casos). Su actividad da forma a la salida del cerebelo a través de la inhibición tónica de las neuronas de los núcleos del cerebelo, que se proyectan a los centros de coordinación motora en el prosencéfalo, el tronco del encéfalo y la médula espinal. La disfunción de la NP cerebelosa se asocia con varias formas de ataxia y está implicada en la TA (Hoxha et al.2018: Cook. Fields. and Watt 2021: Shiloh Aptx*-X/R35X.2020). Por lo tanto, examinamos si las propiedades electrofisiológicas de las PN en el cerebelo Atm' eran anormales. Dado que la actividad de referencia de PN y la capacidad de respuesta a la entrada están mediadas por un conjunto de referencia de propiedades de membrana pasivas y activas (Fig. 4), registramos y comparamos directamente las propiedades de membrana de PN en secciones agudas de cerebelo recolectadas de Atm35XR35×; Aptx* y Cajero Automático*; Ratones aptx* (P350 a 400). PN registradas desde Atm35xR35×; Los ratones Aptx tenían membranas significativamente "más ajustadas", mostrando resistencias de entrada de membrana más altas (Rm) que los de Atm; Ratones Aptx* [47,7±5,6 (n=15)vs.

30.2±1.47(n=23)MQ, prueba t,p-0.008; Fig.4B] y mostró una constante de tiempo de membrana más rápida () [3.6±0.4(n=15)vs.5.1±0.3(n=23)ms, prueba t, p=0 .009;Fig.4B]. Estos resultados indican que la capacitancia total de la membrana (Cm=t/Rm) de Atm35x/35x;Aptx^PN se reduce significativamente [98,25±19,23(n=15)vs.175,6± 12,67(n =23)pF,t-test,p=0.0025;Fig.4B]. A nivel celular, esto sugiere que las PN deficientes en ATM y APTX tienen menos (es decir, área reducida) o membranas más delgadas

que el de las PN de tipo salvaje, un resultado que sugiere un déficit de desarrollo o un proceso neurodegenerativo; Aptx/-and (DellOrco et al.2015). A continuación, evaluamos la excitabilidad intrínseca de las PN en AtmR35xR3x;

Ratones Atm*;Aptx* mediante el examen de la dinámica y la generación del potencial de acción (AP) de la PN. Se observaron déficits significativos en la capacidad de las PN para activarse continuamente en respuesta a la inyección de corriente en ratones Atm?35x3x;Aptx^ (Fig. 4C). Estos déficits se asociaron con perturbaciones significativas en la amplitud, el umbral y el área de los potenciales de acción evocados [amplitud: 66,2± 0,7 (n=14)vs. 72.1±1.4 (n=13)AmV, prueba t,p=0.003;umbral:-55.2±1.5vs.-48. 61±1,9 mV, prueba t, p=0,0196; área: 17.96±0.6vs.

20.63± 1.0 mV*ms, prueba t, p=0.048; Figura 4C]. Juntos, estos experimentos demuestran perturbaciones significativas de las propiedades fisiológicas de la PN que probablemente alteran su capacidad para funcionar normalmente en el cerebelo de At/mR35×R35×; Ratones Aptx'.

A continuación, probamos si las propiedades de PN extrínsecas y/o sinápticas también se vieron afectadas en AtmR35xR3sx. Ratones aptx*. Primero examinamos las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (iPSC) generadas por sinapsis de células granulares a PN (es decir, entradas de fibra paralelas). No se detectó ninguna diferencia en el tamaño de UPSC, lo que indica que la función de los terminales axónicos de las células granulares (es decir, fibras paralelas) era relativamente normal en el AtmR35KR35X;Aptx'cerebelo[18,92±1,3(n{{10}}). 23,4±3,3(n=11)pA,t-test,p=0.477;Fig.4D](Yamasaki, Hashimoto y Kano 20{{5{{58} }}}6). Sin embargo, se encontró que la frecuencia de sEPSC aumentó significativamente, un fenómeno que podría atribuirse a un aumento en el número total de sinapsis, un aumento en el tamaño del grupo de vesículas sinápticas fácilmente liberables o un aumento en la probabilidad de neurotransmisor. lanzamiento en PN de fAtmR35XR35X; Ratones Aptx [18,75±2,8 Hz(n=11) frente a 11,4±1.0Hz(n=11), prueba t,p=0.{{ 69}}47; Figura 4D]. A continuación, exploramos la liberación sináptica evocada y la plasticidad a corto plazo mediante el registro simultáneo de las PN y la estimulación eléctrica de los axones de las células granulares (es decir, fibras paralelas) o de la oliva inferior (es decir, fibras trepadoras) con un estallido de pulso emparejado (2- pulsos, 50 ms de diferencia). Se encontró que las propiedades sinápticas de las fibras paralelas eran normales, sin mostrar diferencias significativas en la facilitación esperada a corto plazo (Atluri y Regehr 1996) o la constante de tiempo de decaimiento y ancho medio del EPSC evocado [PPR: 1.3±0. 03 (n=10) frente a 1,4±{{90}}.{{1{{1{{106}}5}}1 }}5(n=13),t-test,p=0.162;medio ancho:3.9±0.6 vs.4.9±0.4 ms,t -test,p=0.175;constante de tiempo: 3.5±0.5 vs.4.7±0.4 ms,t-test,p=0.054;Fig. 4E]. En comparación, encontramos respuestas sinápticas de escalada de fibra a PN, que normalmente muestran depresión de pulso de par (Hansel y Linden 2000), t deprimen en magnitudes significativamente mayores en Atm/3338/R35X;Aptx'mice [PPR:0.6±0.03 (n=6)vs.0.7±0.02(n=9),t-test,p=0.03;Fig.4F].El ancho total y la constante de tiempo de caída de la evocación las corrientes también eran más pequeñas [medio ancho: 2.3±0.6(n =6).3.0±0.2(n=9)ms,t-test,p=0.004;constante de tiempo (rápido) :1.1±0.14 vs.2.9±0.4ms, prueba t, p=0.001]. Si bien estos resultados podrían ser causados ​​por un déficit presináptico, como depósitos de vesículas reducidos en la terminal del axón de la fibra trepadora, la magnitud inicial no afectada del EPSC [2.4±0.4(n=6)vs. 1.9 ±0.2 nA (n=9), prueba t, p=0.3] apunta a un déficit más intrínseco, como una entrada reducida de Ca2* del retículo endoplásmico, que podría afectar significativamente a largo plasticidad sináptica a largo plazo crítica para la función cerebelosa (Hoxha et al. 2018; Kano y Watanabe 2017). En general, las perturbaciones de las propiedades pasivas y activas de la PN que observamos aquí probablemente den lugar a una disfunción cerebelosa significativa en AtmR35X/R35X; ratones aptos.

2.5 La deficiencia de ATM y APTX provoca una perturbación progresiva de la actividad neural de la PN que se asocia con dendritasencogimiento y atrofia cerebelosa general Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0.3 en todas las comparaciones por pares; Fig. 4-fig. S3). Estudios previos en varios modelos de ratón de ataxia hereditaria, incluida la ataxia episódica y varias variantes de la ataxia espinocerebelosa, encontraron que la interrupción fisiológica en la activación de la NP no solo cambia su frecuencia, sino también su regularidad (Kasumu y Bezprozvanny 2012; Jayabal et al. 2016; Stoyas et al., 2020; Cook, Fields y Watt, 2021). Comparamos tanto el coeficiente de variación (CV) como la variabilidad en intervalos adyacentes (CV2) entre AtmR35X/R35X; Aptx/ y ratones de control (Fig. 4-figs.S4, S5). No se detectaron diferencias en estos parámetros según el sexo, la edad o el genotipo. De acuerdo con los resultados de comportamiento, la disfunción cerebelosa se encontró solo en AtmR35XR35X; Aptx'ratones que desarrollaron ataxia y no en ratones con expresión parcial o total de ATM o APTX.

La deficiencia de 2.5 ATM y APTX induce atrofia cerebelosa

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>0.3 para los 4 genotipos en P460, n=10 a 20]. Además, encontramos que el tamaño del cerebelo no difirió entre los machos y los ratones hembra, en promedio, un 22 % más pequeños en todos los genotipos a esta edad [2-vía ANOVA, F(2. 153)=1.9, p =0.2]. Por lo tanto, la neurodegeneración cerebelosa en el Atm35XR35×; Aptx*mice, que comienza después de P120, se correlaciona con la deficiencia de ATM y APTX. Encontramos que la atrofia cerebelosa está asociada con una reducción selectiva en el ancho de la capa molecular donde residen las dendritas PN (Fig. 5B). De acuerdo con los cambios temporales en el tamaño bruto del cerebelo, la frecuencia de disparo de PN y el comportamiento, el ancho de ML en Atm35 × R35X; Los ratones Aptx* fueron normales en los ratones más jóvenes, pero su anchura disminuyó progresivamente a medida que aumentaba la gravedad de la ataxia 【P400∶120,2±2,1 μm （n=5）vs.140,2±4,8 μm（n=5）,{ {31}}forma ANOVA,Fu42=45.04,p<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

Las infecciones sinopulmonares crónicas asociadas con la inmunodeficiencia son una de las principales causas de muerte en pacientes con AT (Morrell, Cromartie y Swift 1986; Bhatt y Bush 2014). La inmunodeficiencia está relacionada con déficits en la generación de linfocitos B y T que se han relacionado con defectos en los procesos de reordenamiento del gen del receptor de antígeno durante la generación de estas células en la médula ósea y el timo, respectivamente (Staples et al. 2008). Los defectos resultantes en el número de linfocitos maduros incluyen disminuciones en las células T colaboradoras CD4t y las células T asesinas CD8* (Schubert, Reichenbach y Zielen 2002). Por lo tanto, examinamos los porcentajes de células T en sangre periférica y de diferentes subpoblaciones en el timo de Atm35xR35×; Ratones Aptx*' que utilizan el receptor de antígeno de células T (TCR) y la expresión del co-receptor CD4/CD8. En la sangre periférica, observamos una reducción significativa en la fracción total de células T CD3* en ratones con expresión de ATM reducida o ausente en comparación con ratones de tipo salvaje (Fig. 6). Esta reducción se agravó aún más por la deficiencia concomitante de APTX. Las deficiencias de ATM y APTX redujeron las células T en la sangre periférica en más del 65 por ciento en comparación con los controles de tipo salvaje. El efecto de la deficiencia de APTX fue aditivo al de la deficiencia de ATM, lo que sugiere un mecanismo de acción diferente para cada una de estas dos proteínas en la generación de células T. La reducción en el porcentaje de células T en sangre periférica se asoció principalmente con una reducción en la población de células T auxiliares CD4 más (Fig. 6B). De interés, la proporción de células T CD8 plus aumentó solo en AtmR35X/R35×; Ratones Aptx* (Fig. 6B). Nuevamente, observamos un efecto diferencial de las deficiencias de ATM y APTX como se ve en los efectos de estas mutaciones en la fracción total de T-cel. Dada la reducción de las poblaciones de células T en la sangre, a continuación evaluamos el desarrollo de células T en el timo. En este órgano, los progenitores de células T derivados de la médula ósea experimentan un reordenamiento del gen TCR seguido de una selección positiva para la restricción del MHC y una selección negativa de clones autorreactivos. Las fases del desarrollo de los timocitos se pueden seguir controlando la expresión de CD4 y CD8 en los timocitos. La progresión de este programa de desarrollo va desde timocitos doblemente negativos (CD4CD8) a timocitos doblemente positivos (CD4*CD8) y luego a timocitos positivos simples (CD4*o CD8*). Además, dentro de la etapa de doble negativo, se pueden identificar cuatro subpoblaciones diferentes, en función de la expresión de CD25 y CD44, conocidas como DN1 (CD44*CD25), DN2 (CD44*CD25*), DN3 (CD44 CD25*) y DN4 (CD44 grado CD25) (Germain 2002). El reordenamiento de genes durante el desarrollo de los timocitos ocurre dos veces: una vez en la etapa de timocitos doblemente negativos en la etapa CD25*CD44 (Krangel 2009) y luego nuevamente en la etapa de timocitos doblemente positivos antes de progresar a poblaciones separadas CD4* y CD8t positivas individuales (Livak et al. . 1999). La deficiencia de ATM se ha relacionado con defectos en ambos episodios de reordenamiento en ratones (Vachio 2007, Hathcock 2013). Por lo tanto, comparamos la proporción de células en el timo que expresan estos diferentes marcadores de superficie celular de desarrollo en nuestros ratones de control y deficientes en ATM (Fig. 7). AtmR35xR35×; Aptx y Atm35×; Aptx^ pero no AtmR35XR35; Los ratones Aptx* tenían proporciones significativamente elevadas de células CD44*CD25, CD44*CD25t y CD44CD25* en comparación con los de tipo salvaje (Fig. 7A). como la fracción de células CD44CD25 de Atm735xR35×; Aptx'y Atm35× plus; Los ratones aptx son significativamente más bajos que los de tipo salvaje (Fig. 7A). De interés, la deficiencia de APTX en sí misma tuvo el mayor efecto sobre la pérdida de células DN4, lo que sugiere que la deficiencia de APTX, en lugar de la deficiencia de ATM, es responsable de este efecto. Hasta donde sabemos, este hallazgo implica por primera vez a APTX en el reordenamiento de genes durante el proceso de recombinación de TCR. A continuación, observamos las proporciones de timocitos CD4*CD8t en comparación con CD4tCD8 y CD4CD8 más timocitos positivos únicos en estas cuatro cepas diferentes. De acuerdo con nuestros resultados en la sangre y estudios previos, encontramos que los ratones deficientes en ATM, pero no los ratones de control, mostraban una expresión reducida de timocitos positivos únicos CD4*CD8 y CD4CD8* (Fig. 7B). Estos resultados respaldan el papel de ATM en el reordenamiento del gen TCR a/δ durante el desarrollo de los timocitos (Bredemeyer et al.2006), un papel que es independiente del papel que juega APTX en la maduración temprana de los timocitos.

2.7 Las moléculas de lectura completa superan el PTC para restaurar la expresión de ATM

Nuestro principal motivo para insertar una mutación sin sentido clínicamente relevante en el gen Atm fue generar un ratón apto para pruebas preclínicas críticas de un nuevo conjunto de compuestos SMRT. Anteriormente demostramos que los compuestos SMRT recuperan la producción de proteína ATM en líneas celulares linfoblastoides derivadas de pacientes AT al superar los codones de terminación prematura (PTC) causados ​​por mutaciones sin sentido (Du et al. 2013). Para demostrar la idoneidad de este nuevo modelo animal de AT para las pruebas de compuestos SMRT, elegimos examinar directamente su capacidad para restaurar la expresión de ATM utilizando un enfoque de explante que elude los desafíos relacionados con la administración in vivo (p. ej., biodisponibilidad, vía de administración, etc.). La expresión de ATM se midió en muestras del bazo, donde ATM normalmente se expresa en niveles altos, y del cerebelo, un tejido diana clave para el trastorno. ¿Expusimos estos tejidos de explantes, obtenidos de homocigotos Atm?35× y Atm? 35 ratones con un compuesto SMRT candidato (GJ103) o un aminoglucósido previamente conocido por tener propiedades de lectura (G418) y luego midieron la expresión de ATM mediante inmunotransferencia para evaluar la restauración. En ambos tipos de ratones deficientes en ATM, tanto G418 como GJ103 restauraron consistentemente la expresión de ATM en el bazo y el cerebelo (Fig. 8). Estos resultados demuestran que nuestros compuestos SMRT pueden permitir la lectura completa de al menos 2 de las 3 posibles mutaciones sin sentido que causan PTC y proporcionan la justificación para las pruebas de eficacia in vivo en estudios de seguimiento.