Una nueva mutación homocigótica de KLHL3 como causa de pseudohipoaldosteronismo autosómico recesivo tipo II diagnosticada en una etapa avanzada de la vida Ⅱ
Nov 02, 2023
Resultados
Reporte de un caso
El sujeto, una mujer de origen turco, fue remitida a la edad de 58 años a la clínica ambulatoria del Departamento de Nefrología del Hospital Universitario de Düsseldorf, por hiperpotasemia persistente (diagnosticada por primera vez a los 47 años), sospecha de acidosis tubular renal tipo IV en la presencia de enfermedad renal crónica (ERC) (G3a A2, KDIGO), cirrosis del riñón izquierdo, nefrolitiasis con antecedentes de extracción quirúrgica de cálculos a los 17 años, infecciones recurrentes del tracto urinario e hipertensión (diagnosticada por primera vez a los 41 años). años). Su historial médico previo era significativo de enfermedad coronaria, con estado posterior a un infarto de miocardio sin elevación del segmento ST a la edad de 47 años, múltiples implantes de stent e infarto de miocardio con elevación del ST 5 meses antes de la derivación. Después del segundo infarto de miocardio, los niveles séricos de potasio habían aumentado hasta 7,3 mmol/l y habían comenzado dolores musculares intensos. El paciente también refirió fibrilación auricular paroxística, hipercolesterolemia y alergia a agentes de contraste. Los medicamentos incluyeron bisoprolol 2,5 mg dos veces al día, poliestireno sulfonato de calcio 15 g dos veces al día, hidrogenocarbonato de sodio 3 g tres veces al día, fenprocumón, atorvastatina 40 mg una vez al día, aspirina 100 mg una vez al día, pantoprazol 40 mg una vez al día, L-tiroxina 25 ug una vez al día y clopidogrel 75 mg una vez al día. . La interrupción temporal del tratamiento con estatinas no alivió el dolor muscular. La interrupción de un antagonista del receptor AT1 que había estado en su régimen, así como una dieta baja en potasio, no condujeron a una mejora de la hiperpotasemia.
Los antecedentes familiares fueron significativos por consanguinidad de los padres (primos de primer grado), hipertensión en ambos padres, un derrame cerebral fatal en su madre cuando tenía poco más de 60 años y enfermedad de las arterias coronarias en su padre. Su hermano había muerto a causa de una enfermedad renal de origen poco claro en Turquía cuando tenía 50 años (como se muestra en la Fig. 1 a).
En el momento de la evaluación, la presión arterial era de 148/87 mm Hg y su frecuencia cardíaca era de 60/min. La exploración clínica no presentaba alteraciones destacables, salvo leve edema en extremidades inferiores, múltiples hematomas y estrías distensas.
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El examen de laboratorio mostró hiperpotasemia (potasio sérico de 5,3 mmol/L [normal 3,6–4,8]), sodio sérico normal (139 mmol/L, normal 135–145), hipercloremia (107 mmol/L, normal 95 –105), hipomagnesemia de 0,55 mmol/L (normal 0,73–1.00), creatinina sérica elevada de 1,18 mg/dL (normal<0.90) with an estimated glomerular filtration rate of 51 mL/min (CKD-EPI [40], normal 90–140), elevated urea of 47 mg/dL (normal 21– 43), suppressed renin concentration (<1.0 pg/mL [normal 1.7–23.9]), and aldosterone of 157 pg/mL (normal 12–236). Serum calcium and phosphate were normal (2.31 mmol/L [normal 2.10–2.42] and 0.95 mmol/L [normal 0.84–1.45], respectively). Venous blood gas analysis revealed pH 7.33 (normal 7.35–7.43), standard bicarbonate 19.8 mmol/L (normal 24–30), and standard base excess −5.3 mmol/L (normal −2 to +3). Spot urinary potassium was low (6.5 mmol/L [normal 10–200]), whereas spot urinary calcium was normal (0.36 mmol/L); urinary creatinine was 24.2 mg/dL. There was no detectable albuminuria or proteinuria.
La ecografía renal demostró un riñón derecho pequeño (8,5 cm de longitud) con parénquima delgado y no homogéneo, sospecha de cicatrización y un quiste redondo bien definido de 12- mm. El riñón izquierdo era de tamaño normal (10 cm de longitud), con espesor parenquimatoso normal, un quiste redondo bien definido de 22- mm y un quiste redondo bien definido complicado de 12- mm con sospecha de tabique. . No hubo evidencia de hidronefrosis.
La presencia de acidosis metabólica hiperpotasémica con excreción urinaria de potasio insuficientemente baja, que no se explica solo por ERC, hipertensión con niveles bajos de renina con aldosterona insuficientemente baja para hiperpotasemia y consanguinidad de los padres, nos llevó a considerar PHA II. El inicio del tratamiento con hidroclorotiazida 25 mg una vez al día provocó una disminución del potasio sérico a 4,2 mmol/l en 1 semana y la presión arterial se normalizó. El poliestireno sulfonato de calcio y el hidrogenocarbonato de sodio se suspendieron rápidamente. Una reducción temporal de la hidroclorotiazida a 12,5 mg una vez al día provocó la reaparición de la acidosis hiperpotasémica. La hiponatremia se produjo después del tratamiento con hidroclorotiazida y se resolvió con una dieta rica en sal. Dos meses después de la primera visita a nuestra clínica, los dolores musculares inicialmente informados habían desaparecido. Un dolor menor que se describió como de carácter diferente se atribuyó al tratamiento con estatinas en presencia de CK leve (153 U/l, normal).<145) and LDH (250 U/L, normal <147) elevation. A review of prior therapy for hypertension revealed a regimen of valsartan plus hydrochlorothiazide (12.5 mg) prior to myocardial infarction, after which hydrochlorothiazide had been discontinued, apparently unmasking electrolyte abnormalities and causing muscle pain.
Análisis genético
Debido a la sospecha clínica de PHA II, realizamos PCR y secuenciación de Sanger de los genes KLHL3, CUL3, WNK1 y WNK4 (ver Métodos). No se identificaron variantes en los genes WNK1, WNK4 y CUL3. Sin embargo, se identificó una variante homocigótica chr5:g.136973013 G > A (GRCh37) en el gen KLHL3, lo que resultó en una mutación sin sentido p.Arg431Trp (NP_059111.2) que se predice que probablemente sea dañina por PolyPhen [41] , perjudicial por SIFT [42] y causante de enfermedades por MutationTaster [43] (que se muestra en la Fig. 1b). Esta variante está presente una vez en estado heterocigoto entre 251.436 alelos en gnomAD (frecuencia alélica 4 × 10−6) [44] y una vez en estado heterocigoto entre 21.366 alelos en el Proyecto ALFA (www.ncbi.nlm.nih.gov/ snp/docs/gsr/alfa/; frecuencia alélica 5 × 10−5). Aparece en dbSNP como rs769995865 y no se ha informado en ClinVar. La arginina en la posición humana 431 está completamente conservada entre 100 vertebrados (http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=hg19&g=multiz100way, con la excepción del caballo, para el cual no hay secuencia disponible), en C. intestinalis (tunicado de florero), D. melanogaster (mosca de la fruta) y C. elegans (gusano nematodo) (que se muestra en la Fig. 1c). De 41 proteínas parálogas, la arginina se conserva en 17, y ninguno de los parálogos muestra triptófano en esta posición (suplemento en línea, Fig. 1). El hallazgo de una variante homocigota en el contexto de consanguinidad, en combinación con su rareza en la población general y la conservación evolutiva del residuo afectado, nos llevó a considerar la mutación KLHL3 p.Arg431Trp como candidata a causalidad de la enfermedad. La variante está ubicada en la repetición 3 similar a Kelch (que se muestra en la Fig. 1d). Una variante homocigótica de p.Arg431Gln en el residuo idéntico se describió previamente en un solo individuo [12] (Tabla 1).
Análisis estructural
El dominio Kelch (que se muestra en la Fig. 2a) está compuesto por seis "palas de hélice" estabilizadas por enlaces de hidrógeno entre palas [45]. Estudios de simulación anteriores de mutaciones en la superficie del dominio Kelch demostraron una menor interacción con el péptido WNK4, pero encontraron poca alteración de la unión de Kelch-WNK4 por mutaciones en el núcleo de la proteína [46]. Aquí, utilizamos simulaciones de dinámica molecular de equilibrio para determinar las consecuencias estructurales y dinámicas de la mutación central R431W. R431W está colocado en la interfaz entre las palas de la hélice tercera (K3) y cuarta (K4), situadas directamente debajo del sitio de unión WNK4-(que se muestra en la Fig. 2a). El cálculo de la diferencia en las fluctuaciones cuadráticas medias (una medida de la varianza en la estructura de la proteína) entre las simulaciones R431W y WT demostró de manera reproducible que la perturbación en la dinámica de las proteínas causada por la mutación se propaga a lo largo de toda la proteína, con una dinámica estructural fuertemente aumentada en K3–. Interfaz K4 y la región K3-K5 circundante, pero también disminuyó la dinámica en sitios más distantes (como se muestra en la Fig. 2b). Los cálculos globales de RMSD indicaron un ligero aumento en la inestabilidad estructural del mutante con respecto a las simulaciones de 1,1-μs: cálculos de RMSD centrados en la interfaz K3-K4 (residuos 425-465) y el sitio de unión WNK4- (residuos 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 y 577), lo que sugiere una alteración de la estructura terciaria en el mutante R431W (que se muestra en la Fig. 2c, e; ver abajo).
Para una mayor cuantificación de la interacción entre las palas K3 (residuos 425–441) y K4 (residuos 442–465), se calculó el número de enlaces de hidrógeno (enlaces h) y la distancia COM entre los dos grupos. La interfaz WT mantiene, en promedio, siete enlaces h más que en el mutante R431W. El propio R431 solo participa en 4 a 5 enlaces h, que representan aproximadamente el 27% de los enlaces h K3-K4, lo que indica que la mutación R431W altera toda la interfaz (como se muestra en la Fig. 2d, e). Además, el mutante R431W muestra una distancia COM aumentada entre los dos subdominios (que se muestra en la Fig. 2d), lo que corrobora el análisis del enlace h.
Para evaluar los efectos de la mutación en la unión de WNK4, calculamos la electrostática del bolsillo de unión durante la simulación de 1,1-μs. La mutación R431W induce un cambio moderado en la electrostática del bolsillo de unión hacia voltajes negativos (como se muestra en la Fig. 2d). Aunque modesto, la disminución del potencial positivo en el bolsillo de unión desfavorecería la asociación del motivo ácido WNK4 cargado negativamente.
Análisis funcional
Para estudiar más a fondo la fisiopatología asociada con KLHL3 p.Arg431Trp, obtuvimos plásmidos que codifican WNK4 humano etiquetado con FLAG 3x en el vector pTRE2hyg y KLHL3 humano etiquetado con Halo en el vector pFN21A [47]. Introdujimos la mutación p.Arg431Trp en el plásmido WT KLHL3 mediante mutagénesis dirigida al sitio y expresamos de forma heteróloga los plásmidos correspondientes en células COS7. Al coexpresar WT y KLHL3 mutante con WT WNK4, las transferencias Western con anticuerpos primarios anti-Halotag revelaron bandas WT KLHL3. Sin embargo, las transfecciones repetidas de dos clones independientes de KLHL3 p.Arg431Trp inicialmente no dieron como resultado bandas detectables (intensidad relativa normalizada por la expresión de -actina, 0.761 ± 0.144 en WT vs. {{25). }}.0{{3{{40}}}}9 ± 0.002 en p.Arg431Trp, p < { {60}}.0001,t= 12.81). Los niveles de expresión de WNK4, determinados mediante Western blot anti-FLAG, fueron significativamente mayores en las células que coexpresan KLHL3 p.Arg431Trp que en las células que coexpresan WT KLHL3 (intensidad relativa normalizada por la expresión de -actina, 0,721 ± 0,137 con WT frente a 0,967 ± 0,115 con Arg431Trp , p= 0.005, t= 3.546). Todos los valores se dan como media ± SEM, y la comparación se realizó mediante una prueba t de relación pareada de dos colas, df=11 (que se muestra en las figuras 3a, b). Para evaluar si KLHL3 p.Arg431Trp se expresaba en cantidades más bajas, transfectamos cantidades crecientes (0, 0,5, 1, 2, 4 y 8 µg) de WT y plásmidos mutantes. Con 8 µg, observamos una mayor letalidad (datos no mostrados), pero con la expresión de 4 µg de plásmido mutante, pudimos detectar una banda débil en el tamaño esperado (tenga en cuenta el tiempo de exposición más largo en comparación con WT, que se muestra en la Fig. 3c). Para evaluar si la disminución de la estabilidad de la proteína podría causar una disminución de los niveles de expresión de la proteína mutante, realizamos ensayos de persecución de cicloheximida. KLHL3 p.Arg431Trp se degradó más rápidamente que WT (como se muestra en la Fig. 3d).
Fig. 3. Transferencias Western representativas de lisados celulares transfectados con WNK4 y vector vacío, WT o p.Arg431Trp (R431W) KLHL3. b Gráficos de caja y bigotes (Tukey) con cuantificación de los resultados de 12 experimentos, utilizando dos clones independientes de cada plásmido. **, p= 0.0046; ****, p < 0,0001 (pruebas t pareadas de razones de dos colas). c Transferencias Western representativas de lisados celulares transfectados con cantidades crecientes de WT o R431W KLHL3. Tenga en cuenta los diferentes tiempos de exposición para WT y R431W. Las bandas positivas de HaloTag inferior y superior pueden reflejar el monómero y el dímero KLHL3, respectivamente. d Transferencias Western representativas de células transfectadas con 2 µg de WT o 4 µg de plásmido R431W KLHL3, tratadas con cicloheximida y lisadas en los momentos indicados. Tenga en cuenta los diferentes tiempos de exposición. El análisis de 2 réplicas biológicas con 2 réplicas técnicas cada una muestra una estabilidad disminuida de la proteína mutante, normalizada a beta-actina y en el momento 0 h (media ± DE). A las 12 h, está presente significativamente menos R431W que la proteína WT (prueba de Mann-Whitney, *, p=0.029).
Discusión/Conclusión
A la edad de 58 años, el paciente reportado aquí fue diagnosticado más tarde en la vida que cualquiera de los casos reportados anteriormente con mutación recesiva KLHL3. El paciente de mayor edad reportado en la literatura fue diagnosticado a la edad de 56 años [15]. Sin embargo, retrospectivamente, la hipertensión y la hiperpotasemia habían estado presentes en nuestro paciente durante varios años. La acidosis metabólica hiperpotasémica característica asociada con PHA II probablemente había sido enmascarada por la administración de un diurético tiazídico. La interrupción de la hidroclorotiazida después de un infarto de miocardio fue la causa probable de acidosis hiperpotasémica masiva asociada con dolor muscular e hipertensión que finalmente condujo al diagnóstico de PHA II. Por lo tanto, sugerimos que la presencia de acidosis metabólica hiperpotasémica que es inadecuada para la función renal en combinación con renina suprimida debería generar sospecha de PHA II incluso en pacientes mayores de 50 años de edad. El diagnóstico de PHA II puede complicarse por los efectos del tratamiento preexistente con medicamentos antihipertensivos que influyen en el sistema renina-angiotensina-aldosterona y pueden conducir a valores de renina y/o aldosterona falsamente elevados o bajos [48, 49]. La hiperpotasemia a pesar de una tasa de filtración glomerular normal se describe a menudo como un rasgo característico de PHA II [6]. Si bien esto puede ser característico en niños, en adultos, como en el paciente reportado aquí, la hipertensión prolongada, la nefrolitiasis y las infecciones recurrentes del tracto urinario pueden provocar un deterioro de la función renal, como se informó previamente en un paciente con una mutación heterocigótica [14]. La nefrolitiasis como en nuestro paciente se ha descrito en PHA II [50] pero no es un hallazgo común. Curiosamente, los cocientes de calcio:creatinina en orina puntual no estaban elevados en nuestro paciente (0,17 y<0.06 mmol/mmol creatinine, respectively), contrary to observations in large kindred with the WNK4 mutation and average urinary calcium of 0.85 ± 0.27 mmol/mmol creatinine [51]. Severe target-organ damage in our patient, including myocardial infarctions and CKD, emphasizes the need for early diagnosis and adequate therapy of PHA II, although hypertension and target-organ damage in our patient's parents may also point to a genetic risk independent of the homozygous PHA II mutation. To prevent delayed diagnosis, after more common causes, such as primary aldosteronism, have been excluded, genetic testing for Mendelian forms of hypertension should be considered by practitioners when patients present with low-renin hypertension in the presence of hormonal and/or electrolyte abnormalities.
Las muestras de la familia del paciente no estaban disponibles para el análisis; sin embargo, en el caso de consanguinidad, es muy probable que ambos padres fueran portadores heterocigotos de la mutación p.Arg431Trp. No se dispuso de información detallada sobre el hermano fallecido del paciente. Es concebible que él también padeciera PHA II, lo que provocó una ERC que finalmente fue fatal.
Es posible que la mutación p.Arg431Trp observada en nuestro paciente impida que el dominio Kelch se pliegue, lo que coincide con la disminución de la estabilidad estructural del dominio mutado observada en nuestras simulaciones, donde la sustitución de la cadena lateral se insertó en la proteína ya plegada. En consecuencia, el análisis de transferencia Western indicó niveles de expresión significativamente reducidos de p.Arg431Trp KLHL3 (que se muestra en las figuras 3a-c). El ensayo de persecución de cicloheximida (un inhibidor de la biosíntesis de proteínas) demostró además una estabilidad proteica reducida de p.Arg431Trp KLHL3 (que se muestra en la Fig. 3d), similar a observaciones anteriores en la variante p.Ser410Leu [52]. Estos datos indican que la consecuencia principal de la mutación p.Arg431Trp es desestabilizar el estado plegado de la proteína, mientras que la disminución de las interacciones de KLHL3 plegado con WNK4 es, como mucho, un efecto secundario. En cualquier caso, los niveles más bajos de KLHL3 reducen la ubiquitinilación de WNK, lo que resulta en una mayor abundancia de WNK4 (que se muestra en la Fig. 3) y se infiere que causan una mayor fosforilación de NCCT, así como una menor secreción de potasio a través de ROMK, lo que explica la fisiopatología subyacente.
Expresiones de gratitud
Agradecemos al Dr. Shinichi Uchida (Universidad Médica y Dental de Tokio) por proporcionarnos amablemente los plásmidos pTRE2hyg WNK4 y pFN21A KLHL3, a Iana Lukianova por su apoyo con los experimentos de Western blot y a Gabriel Stölting por sus útiles debates.
Declaración de ética
El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf (estudio número 4330), y se obtuvo del participante de la investigación el consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki para el estudio de investigación y la publicación de este informe de caso. .
Declaracion de conflicto de interes
AE, NH, BGH, JPM y TM no tienen conflictos de intereses que declarar. LCR recibió honorarios personales por consultorías y conferencias de Astellas, Baxter, Bayer-Vital, Boehringer, Fresenius, Medtronic, Novartis y Recor, sin relevancia para el artículo. La UIS figura como inventora en las patentes US 10.696.739 y 16/614.401, sin relevancia para el artículo.
Fuentes de financiamiento
Este estudio fue financiado por el Ministerium für Kultur und Wissenschaft der Landes Nordrhein-Westfalen (Rückkehrprogramm), la Stiftung Charité (BIH_PRO_406) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG, SCHO 1386/{ {4}}; proyecto-ID 431984000, CRC 1453), todo a UIS Fue financiado por la Deutsche Forschungsge meinschaft (Fundación Alemana de Investigación) a JPM (MA 7525/2- 1, como parte de la unidad de investigación FOR 5046 , proyecto P2) y por una subvención del Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad RWTH Aachen (IZKF TN1- 3/IA532003). Los autores agradecen el tiempo de cálculo concedido a través de JARA en el superordenador JURECA del Forschungszentrum Jülich. Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.
Referencias
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