Una nueva preparación de albúmina sérica humana s-sulfhidratada suprime la síntesis de melanina

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La albúmina sérica humana (HSA) es la proteína más abundante en el suero y es ampliamente utilizada como portador de fármacos debido a su biocompatibilidad y propiedades de retención plasmática prolongada [14,15]. HSA contiene un total de 35 residuos de Cys y uno de ellos, Cys34, está presente en forma de un grupo tiol libre [16]. Cys34 es a veces un objetivo para un sitio de unión a fármacos, debido a su grupo tiol reactivo [17,18]. Por ejemplo, en presencia de óxido nítrico (NO), el grupo tiol Cys34 es S-nitrosado. Anteriormente desmintamos que la HSA S-nitrosada (SNO-HSA) permite que el NO se retenga durante largos períodos en suero [19]. SNO-HSA tiene varias funciones biológicas, incluyendo un efecto protector del hígado contra la isquemia/reperfusión [20] y efectos supresores de tumores [21].

En consecuencia, planteamos la hipótesis de que HSA podría usarse como portador de RSS (como SNO-HSA) a través de la S-sulfhidratación de Cys34-SH. Como fuente de polisulfura, DATS y DMTS son limitados debido a su li- pophilicidad y volatilidad. Por lo tanto, en este estudio se utilizó Na2Sn disponible comercialmente (Na2S, Na2S2, Na2S3 y Na2S4). Ogasawara et al. prepararon previamente la albúmina sérica unida al azufre reaccionando con sulfuro de sodio (NaHS) mediante una simple mezcla de los reactivos [22]. El azufre de NaHS se agregó a Cys34 y la preparación resultante protegió el daño hepático causado por el peróxido lipídico. Adoptamos este método para la pre-paring RSS-added-HSA usando Na2Sn para la entrega de RSS.

En este trabajo, informamos sobre la preparación de HSA tratada con Na2Sn y su uso como un nuevo sistema de administración de RSS. El azufre añadido se analizó mediante una sonda de azufre de sulfano [23] y la eliminación de sulfuro del polisulfuro [24]. Para evaluar el efecto de la HSA tratada con Na2Sn sobre el blanqueamiento de la piel, se estudió el efecto de la HSA tratada con Na2Sn sobre la síntesis de melanina utilizando una línea celular de melanoma B16.

2. Material y métodos

2.1. Materiales

La albúmina sérica humana (HSA) se compró a KAKETSUKEN (Kumamoto, Japón) y todas las muestras de HSA se desgrasaron mediante un tratamiento con carbón. El sulfuro de sodio y el tetrasulfuro de sodio se compraron al Laboratorio DOJINDO (Kumamoto, Japón). La sonda de azufre de sulfano 4 (SSP4) se preparó como se describió anteriormente [23]. L-DOPA, glu- tathione, (DTNB), ácido ascórbico y reactivo de Griess satírico de sodio (sulfanilamida, naftilendiamina-HCl) fueron comprados a Nakarai Chemicals (Kyoto, Japón). La columna desalinizante Sephadex G-25 (φ 1,6 × 2,5 cm) se compró a GE Healthcare (Kyoto, Japón). El medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco y el 2,2-difenil-1-pi-crilhidracil (DPPH) se obtuvieron de Wako Pure Chemical (Osaka, Japón). La tirosinasa de hongo fue comprada a Sigma-Aldrich. Todos los demás productos químicos eran del mejor grado que estaba disponible comercialmente, y todas las soluciones se preparaban en agua desionizada y destilada.

extracto de cistanche

2.2. Ensayo de proteína BCA

Las concentraciones de proteínas se midieron mediante un ensayo de proteína BCA. Se incubaron alícuotas de 10 μL de muestras y estándares de albúmina sérica bovina (BSA) en 100 μL de tampón de reacción a 25 °C durante 30 min. Después de la reacción, se utilizó un lector de microplacas para medir la absorbancia de 540 nm. BSA se utilizó para construir una curva estándar.

2.3. Síntesis de Na2Sn tratado-HSA

HSA (300 μM) se incubó con 1 mM de polisulfuros de sodio (Na2Sn) en PBS (pH 7.4) durante 1 h a 37 °C. Después de la reacción, el exceso de polisulfuros de so-dium se eliminó mediante filtración en gel con una columna de Sephadex G-25.

2.4. Determinación de la tasa de unión al azufre por método de eliminación de sulfuro a partir de polisulfuro (EMSP)

EMSP se preparó como se describió anteriormente (3×EMSP mediante la adición de 792 mg de ácido L-ascórbico a 5 ml de 3 N de NaOH) [24]. Las muestras (7,5 μM, 133 μL) se incubaron con 66,7 μL de 3×EMSP durante 3 h a 37 °C. Luego se agregó una solución de acetato de zinc al 1% (600 μL) a la solución de re-acción, seguida de vórtice inmediatamente. Las muestras se centrifugaron a 8.000×g durante 5 min y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces. Después de eliminar los sobrenadantes, se agregó agua desionizada y destilada (200 μL) a los precipitados. Después de agregar acetato de zinc al 1% (300 μL), 50 μL de 20 mM de mina N,N-dimetil-p-fenilenodia- y 20 mM de FeCl3 en 7.2 N HCl, la solución se incubó durante 30 min a 25 °C. Las muestras se centrifugaron a 8000×g durante 1 min y se transfirieron a placas de 96 pocillos y se midió el OD a 665 nm. Na2S se utilizó para construir una curva estándar.

2.5. Detección de azufre de sulfano con SSP4

Cada muestra (20 μM) se incubó con 5 μM de SSP4 en 1 mM de bromuro de cetiltrimetilamonio / PBS (pH 7,4) durante 10 min a 25 °C. Después de la incubación, la fluorescencia medida por un espectrofotómetro (JASCO Corporation) con excitación a 457nm, emisión a 490–535 nm.

2.6. Pruebas de radicales DPPH

DPPH (250 μM) en etanol se mezcló con la misma cantidad de tampón MES (50 mM, pH 7.4). El HSA tratado con Na2Sn (40 μM) se agregó a esta solución de DPPH, que luego se incubó durante 30 min a 25 °C y la absorbancia de los radicales DPPH se midió a 540nm. Las tasas de radicales eliminados se convirtieron utilizando la siguiente fórmula;

Radical eliminado (%) = (Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. Análisis de NO y SNO

La HSA tratada con Na2Sn (50 μM) se incubó con un donante de NO, NOC7 (200 μM), durante 30 min a 25 °C. Después de la reacción, la concentración de NO y SNO se midió mediante un ensayo de Griess con modificaciones menores [25]. La solución del reactivo de Griess se preparó mezclando 0,1% de N-1- naftiletileno-diamida diclorhidrato y 1% de sulfanilamida en ácido fosfórico al 2%. El tampón de reacción estaba compuesto por 0,1 M de NaCl, 0,5 mM de DTPA y 10 mM de AcONa・AcOH (pH 5,5). Las muestras (20 μM) se reaccionaron con la solución de reactivo de Griess (60 μL) en tampón de reacción (110 μL) con 3 mM de HgCl2 en acetato de Na de 10 mM (pH 5,5). Después de una incubación de 15 min, se midió la absorbancia de 540 nm por medio de un lector de microplacas. La relación NO/SNO restante (%) se calcu- lató y se comparó con los valores de PBS para las muestras.

2.8. Cultivo celular

Las células de melanoma B16 fueron proporcionadas por el Banco Japonés de Recursos de Investigación del Cáncer (JCRB, Tokio, Japón), y se cultivaron en DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal y una solución de antibióticos. Las células se cultivaron con un mantenimiento a 37 °C en aire humidificado que contenía un 5% de CO2 en la incubadora (número de paso 10-20).

2.9. Producción de melanina

Las células de melanoma B16 se sembraron en 24 placas de pocillos a una concentración de 2,5×104 células/pozo y se cultivaron por debajo del 5% de CO2 a 37 °C durante 24 h. Las muestras se trataron con 0,4 mM de tirosina y 10 mM de NH4Cl en DMEM que contenía un 10% de FBS y luego se incubaron bajo un 5% de CO2 a 37 °C durante 72 h. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se disolvieron en 1 N NaOH (200 μL). Después de una incubación de 2 h a 60 °C, la absorción (405 nm) se midió por medio de un lector de microplacas.

Cistanche inhibe la producción de melanina.

2.10. Radiaciones UV

Se utilizó una lámpara UV de mano para irradiar las muestras a una distancia de 5 cm de la placa del pozo. Esta lámpara UV proporciona una intensidad UV de 614 o 743 μW/cm2 respectivamente con radiación de 254 nm o 365 nm desde una distancia de 5 cm.

2.11. Actividad de eliminación de HSA tratada con Na2S4 contra ROS intracelulares, NO, RSS

ROS y NO en células de melanoma B16 se midieron mediante cada una de las sondas de fluorescencia, CM-H2DCF-DA y DAF-FM-DA, respectivamente. Las células de melanoma B16 se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 1 × 104 células/pozo y se cultivaron en 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h. Después del cultivo, el medio se retiró y se reemplazó con CM-H2DCF-DA (5 μM) o DAF-FM-DA (10 μM) en PBS. Las sondas fueron recogidas por las células incubándolas a 37 °C durante 30 min. Después de la reacción, se retiraron los super-natants, las muestras se diluyeron en PBS y la fluorescencia se midió inmediatamente. Las células fueron irradiadas por una lámpara UV durante 15 min. Después de la irradiación, la intensidad de fluorescencia (Ex. 485 nm, Em. 535 nm) se midió por medio de un lector de microplacas de fluorescencia.

2.12. Actividad de la tirosinasa de hongos y agregación de melanina

Las soluciones de tirosinasa y L-DOPA se prepararon en PBS (pH 7.4) inmediatamente antes del ensayo. La tirosinasa, aislada de hongos, se utilizó para examinar la actividad inhibitoria de la HSA tratada con Na2Sn. Luego se agregó una porción de 20 μL de tirosinasa de hongo (537 U/mL) y 100 μL de HSA tratada con Na2Sn (40 μM) con PBS (60 μL) en placas de 96 pocillos y 20 μL de L-DOPA (5 mM). Después de una incubación de 30 minutos, se analizó el nivel de melanina sintetizada midiendo la OD 490 nm. Para el ensayo de la agregación de melanina, la mezcla se centrifuga a 20.000 g, 15 min durante 3 h. La flecha blanca muestra el material agregado. La melanina no agregada en el sobrenadante se midió a una OD de 490 nm.

2.13. Ensayos de seguridad

La crema tópica utilizada en este estudio se preparó mezclando agua (30 ml) aceite de jojoba (15 ml) y 5 g de cera emulsionante a 60 °C. Después del enfriamiento, el HSA tratado con Na2S4 (20 μM) y la suspensión resultante se mezclaron bien. La prueba de irritación de la piel se realizó siguiendo la Guía de prueba 439 de la OCDE utilizando el LabCyte Epi-Model (un modelo de piel humana cultivada en 3D).

2.14. Análisis estadístico

La significación estadística de los datos recogidos se evaluó mediante análisis ANOVA seguido del método de Newman-Keuls para más de 2 medias. Las diferencias entre los grupos fueron evaluadas por la prueba t de Student. P< 0.05="" was="" regarded="" as="" being="" statistically="">

3. Resultados

3.1. Preparación de S-sulfydrated HSA

El HSA tratado con Na2Sn se preparó a partir de HSA que había sido incubado con Na2Sn y sometido a filtración en gel después de la reacción. Para evaluar la cantidad de azufre de sulfano en la muestra, se empleó EMSP, un nuevo método cuantitativo que desarrollamos previamente,[24]. Por lo tanto, el HSA tratado con Na2S4 se preparó a partir de HSA y Na2Sn permitiendo que los reactivos reaccionaran durante 1 h a 37 ° C. Se permitió que diferentes cantidades de polisulfuros de sodio reaccionaran con HSA. Luego, las muestras de HSA se incubaron con solución EMSP, que se preparó en el momento de su uso, durante 3 h a 37 ° C. Según los análisis EMSP, el nivel de S-sulfuración aumentó independientemente de la cantidad de azufre (Fig. 1A). Por otro lado, como se muestra en la Fig. 1B, el tratamiento Na2S3 o Na2S4 mejoró la intensidad de fluorescencia SSP4 (una sonda de fluorescencia para azufre sulfano) en comparación con los tratamientos Na2S o Na2S2, lo que sugiere que SSP4 posiblemente reaccionó con el polisulfuro de la proteína de manera no lineal (Fig. 1B).

3.2. Efecto antioxidante y NO supresor de la HSA tratada con Na2S

Postulamos que la HSA tratada con Na2Sn suprimiría la producción de melanina debido a su actividad antioxidante. Por lo tanto, se realizó una prueba de radicales DPPH [26,27] para analizar la actividad antioxidante in vitro. Como resultado, el HSA tratado con Na2Sn tuvo una concentración significativamente mayor de azufre añadido (Fig. 2A). Para dilucidar el efecto del NO, se cocubinó NOC7 (un donante de NO) con HSA tratada con Na2S4 a 25 °C. Después de un período de incubación de 30 minutos, la concentración restante de NO se cuantificó mediante un ensayo de Griess. Como se ve en los compases cerrados de la Fig. 2B, el HSA tratado con Na2S4 eliminó significativamente más NO en comparación con el control y el HSA (Fig. 2B). Se sabe que el mercurio elemental (Hg) reduce el SNO y libera NO2-. Cuando se agregó Hg a una solución de HSA tratada con Na2S4, se liberó NO2,, lo que sugiere que la HSA tratada con Na2S4 se eliminó a través de la nitrosación S.

3.3. Efecto supresor de melanina de la HSA tratada con Na2Sn

Se cultivaron células de melanoma de ratones B16 y se promovió la síntesis de melanina mediante la adición de tirosina a los medios. Como se muestra en la Fig. 3, el HSA tratado con Na2Sn inhibió la síntesis de melanina y la inhibición dependió del contenido de azufre. Las imágenes celulares de células de melanoma B16 después de la aplicación de la HSA tratada con Na2Sn también demostraron que la HSA tratada con Na2Sn disminuyó la proporción de producción de melaninacélulas positivas (Fig. 3).

3.4. Efecto antioxidante de la HSA tratada con Na2S4 con irradiación de UV

Para examinar si la HSA tratada con Na2Sn suprimió la formación de ROS o NO inducida por UV, se realizó una prueba de esfuerzo oxidativo utilizando células de melanoma B16 como modelos. La producción de ROS por HSA tratada con Na2S4 en células de melanoma B16 por irradiación con 2 dispositivos UV diferentes durante 15 min se midió mediante CMH2-DCF-DA. Los hallazgos indican que la HSA tratada con Na2S4 causó una disminución significativa en la fluorescencia de CMH2-DCF-DA a PBS y HSA por irradiación a 254 nm y 365 nm (Fig. 4AB). Por el contrario, la HSA tratada con Na2S4 también suprimió la producción de NO en células de melanoma B16 por irradiación con 254 nm UV (Fig. 4CD). Estos resultados indican que la HSA tratada con Na2Sn suprime la síntesis de melanina al inhibir las ROS y el NO producidos por la irradiación UV.

3.5. Supresión directa de la agregación de tirosinasa y melanina por HSA tratada con Na2Sn

Se sabe que algunos agentes antimelanina comerciales inhiben directamente la actividad de la tirosinasa. Por lo tanto, probamos si la HSA tratada con Na2Sn alteraba la actividad de la tirosinasa. Los hallazgos indicaron que la HSA tratada con Na2Sn inhibió la tirosinasa de hongos en mayor medida que la HSA no tratada (Fig. 5A). Después de ser generada, la melanina desagüe fácilmente la agregación e induce la formación de médula [28]. Por lo tanto, a continuación abordamos la cuestión de si la HSA tratada con Na2Sn inhibe la agregación de melanina. En consecuencia, cuando la tirosinasa y la L-DOPA se incubaron juntas durante 3 h, los pigmentos de melanina se agregaron, pero la HSA tratada con Na2Sn impidió la agregación (Fig. 5B). Por un lado, también se encontró que la HSA inhibe la agregación, lo que indica que la propia HSA podría prevenir la unión de la L-DOPA a la tirosinasa.

3.6. Prueba de seguridad de la HSA tratada con Na2Sn utilizando piel humana cultivada en 3D

Las pruebas de irritación cutánea para la HSA tratada con Na2S4 se realizaron utilizando células de la piel humana cultivadas en 3D de acuerdo con las directrices de la OCDE. Como resultado, el número de células sobrevivientes no disminuyó por la HSA tratada con Na2S4 con / sin el uso de una crema tópica (Fig. 6A). El uso de un kit de detección de citotoxicidad LDH también reveló que las células de la piel no fueron dañadas por la HSA tratada con Na2S4 (Fig. 6B). Estos datos indicaron que la HSA tratada con Na2Sn es muy segura para su uso contra la piel humana bajo las concentraciones examinadas en este estudio.

4. Discusión

La melanina se sintetiza por la oxidación de la tirosina. La tirosina se oxida a L-DOPA, y luego a dopaquinona por la acción de la tirosinasa. La dopaquinona se oxida espontáneamente a melanina. La melanina induce la formación de pigmentos negros y pecas, pero también desempeña un papel en la protección de la piel contra el daño de la radiación UV. En la piel humana, los melanocitos producen ROS y NO cuando son estimulados por la ra- diación UV [2,29,30]. ROS promueve la síntesis de melanina mediante la activación de la tirasinasa a través de la acción de la ATP sintasa, la fenilalanina hidroxilasa y la fosforilación de mapks [31,32]. El NO activa la tirosinasa mediante el aumento del nivel celular de cGMP [6]. Por lo tanto, los carroñeros ROS y NO se consideran agentes anti-melanogénesis. Aquí, in-vestigamos el efecto de síntesis anti-melanina de la HSA tratada con Na2Sn. La HSA tratada con Na2Sn suprimió fuertemente los niveles celulares de ROS y NO producidos por la radiación UV (Fig. 4). Además, la HSA tratada con Na2Sn tuvo un efecto directo en la inhibición de la acción de la tirosinasa (Fig. 5A) y la agregación de melanina (Fig. 5B). No pudimos aclarar el mecanismo de cómo se transfirió el azufre de sulfano del HSA tratado con Na2Sn a una célula. Por lo tanto, la naturaleza de cómo funcionan los efectos directos de la HSA tratada con Na2Sn sigue sin estar clara. Yamashita et al. demostraron que la dopaquinona se une a las proteínas tiol a través de residuos de cisteína [33]. En conjunto, la inhibición de la agregación de melanina por HSA y HSA tratada con Na2Sn también puede implicar la formación de enlaces disulfuro con dopaquinona o melanina. Por otro lado, la inhibición de la tirosinasa dependía del contenido de azufre añadido (Fig. 5A). Se sabe que el GSH se une a la tirosinasa y disminuye su actividad [34]. Debido a que la cisteína S-sulfhidratada tiene una reactividad más fuerte que la cisteína normal [11], el persulfuro de glu-tationona (GSSH) puede inhibir la acción de la tirosinasa más que el GSH. Se necesitan más estudios con respecto a la cuestión de si la HSA tratada con Na2Sn aumenta el GSSH intracelular en el futuro.

Las ROS se producen por irradiación UV o estrés externo que inducen signos de envejecimiento, no solo en forma de síntesis de melanina sino también por la aparición de arrugas y flacidez de la piel, causada por el daño del ADN y la formación de colágeno reticulado. También se sabe que las ROS son un factor agravante en varios tipos de inflamación, como las espinillas y la psoriasis. Varios agentes blanqueadores de la piel, como el ácido tranexámico [35] y la arbutina [36], se han diseñado para abordar estos problemas. Sin embargo, estos compuestos sólo inhiben la síntesis de melanina y no tienen ningún efecto sobre el estrés oxidativo. Por lo tanto, los riesgos de toxicidad inducida por ROS se mantuvieron. Una ventaja de usar HSA tratada con Na2Sn es que elimina eficientemente las ROS (Figs. 2 y 4).

El sulfuro de hidrógeno se ha estudiado como una tercera molécula esencial después del óxido nítrico y el monóxido de carbono. Se ha demostrado que los efectos terapéuticos del sulfuro de hidrógeno son aplicables al tratamiento de la isquemia / reperfusión [37], la aterosclerosis [38], la sepsis [39] y la toxicidad inducida por una dieta alta en grasas [40]. Además, el hidropersulfuro tiene una mayor actividad que el sulfuro de hidrógeno. Por ejemplo, Na2S4 desintoxica eficazmente el metilmercurio e inhibe la diferenciación de las células de neuroblastoma, mientras que Na2S no [12,41]. Por lo tanto, no solo es posible un efecto blanqueador de la piel, sino también otros efectos positivos de la HSA tratada con Na2Sn.

En conclusión, informamos sobre el desarrollo de un nuevo sistema de desautoa RSS que utiliza la albúmina sérica como portador estable. El azufre reactivo, cuando se combina con HSA, tuvo un efecto antioxidante más fuerte que HSA e inhibió la síntesis de melanina en las células de melanoma. El mecanismo de la anti-melanogénesis implica no solo la eliminación de ROS y NO, sino también la supresión de la actividad de la tirosinasa y la agregación de melanina. Por lo tanto, la HSA tratada con Na2Sn tiene un potencial considerable para su uso como un agente blanqueador de la piel seguro.

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