Un papel para BATF3 en la diferenciación Tu9 y las patologías mucosas L impulsadas por células T (Parte 2)

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DISCUSIÓN

Las células T#9 son importantes para el desarrollo de enfermedades inflamatorias y alérgicas. Sin embargo, el programa transcripcional y los desencadenantes inflamatorios que impulsan la diferenciación de las células TH9 aún no se conocen por completo. En este estudio, identificamos la citocina proinflamatoria TL1A como un potente inductor de la diferenciación T-9 murina y humana e identificamos a BATF3 como un factor de transcripción importante involucrado en la diferenciación de las células TH9. La red transcripcional que fue inducida por TL1A incluía los factores de transcripción BATF y BATF3 y varios genes regulados por BATF (Figura 7 complementaria). In vivo, en experimentos de transferencia adoptiva,Células Tμ9-TL1Aeran altamente proinflamatorios y provocaban inflamación intestinal y pulmonar. La propensión proinflamatoria de las células T-9-TL1A dependía de la producción de IL-9. Las transferencias de células Batf3-/T y 9-TL1A dieron como resultado una reducción de la inflamación de la mucosa y la expresión de citoquinas in vivo.

Aunque las células Tμ9 se han identificado como un subconjunto distinto de T-helper, no se ha identificado un factor de transcripción que actúe como un regulador maestro o identifique únicamente el fenotipo TH9. En cambio, varios factores de transcripción actúan en concierto para regular la diferenciación de las células T-9. Se ha demostrado que el BATF coopera funcionalmente con IRF4 y se une a elementos compuestos dentro de las regiones promotoras de los genes sensibles. Se ha demostrado que el BATF junto con el IRF4 propuestos recientemente como "factores pioneros" en la diferenciación de células Tp17 al contribuir a la accesibilidad inicial de la cromatina y facilitar el acceso de otros factores de transcripción.36 Observamos que TL1A tiene un efecto directo sobre la expresión de BATF y se sinergiza con TGF{{9} } e IL-4 para inducir al máximo la expresión de BATF, particularmente al comienzo de la diferenciación de TH9. En apoyo de esta idea, la estimulación con TL1A solo conduce a la unión de BATF al promotor II9 mientras que no tiene un efecto directo sobre la unión de otros factores de transcripción (IRF4 y BATF3). Sin embargo,TH9-TL1ALas condiciones mejoran sinérgicamente la unión de BATF3 e IRF4, así como la acetilación de la histona H3, una modificación permisiva de la cromatina que se correlaciona con la actividad del promotor ll9.14 De acuerdo con los datos publicados anteriormente, se requiere BATF para la expresión de IL-9 e IL-10 en condiciones T,9.15 TL1A es, al menos parcialmente, capaz de superar el requisito de BATF en la inducción de IL-9 e IL-13 muy probablemente a través de la mejora de otra transcripción factores que podrían compensar la pérdida de BATF. Un candidato para la compensación funcional es BATF3, que es inducido transcripcionalmente por TL1A. Se ha propuesto que BATF y BATF3 son funcionalmente intercambiables para el desarrollo de Tu17 y Tp2 y la sobreexpresión de BATF3 en células T BATF-'- puede restaurar la producción de IL-17 en células TH17 e IL-4 e IL{{ 23}} en células T#2.18323738 Sin embargo, no se ha definido el papel de BATF3 en el desarrollo de células Tu en condiciones fisiológicas y la posible interacción entre BATF y BATF3 durante la diferenciación de TH9. Demostramos aquí que TL1A facilita la unión de BATF3 al promotor ll9. Como consecuencia funcional, BATF3 contribuye a la producción de IL-9 en condiciones T-9, particularmente en el contexto de la estimulación de TL1A. Sorprendentemente, BATF3 es prescindible para la diferenciación temprana de las células Tu9, pero podría ser necesario para estabilizar o mantener el fenotipo TA9 y la secreción de IL-9 en puntos de tiempo posteriores. Nuestros hallazgos sobre el papel de BATF3 en la diferenciación de TH9 contrastan con informes previos de que BATF3 es prescindible para la diferenciación de Tu1, TA2 y Tu17.2'3'En contraste con BATF, BATF3 solo contribuye a la secreción de IL-9 y no a otras citoquinas TH9 como IL-10 e IL-13, lo que sugiere que BATF3 se une específicamente al promotor ll9 e induce la secreción de IL-9. Se requieren más estudios para determinar genes diana de BATF3 adicionales durante la diferenciación de TH9 y su función en otros subconjuntos de Tu.

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Fig.7 La deficiencia de Batf3 conduce a una reducción de la inflamación de la mucosa provocada por las células TH9-TL1A. Se diferenciaron células WTor Batf3-/ingenuas en células T_9-TL1A y se inyectaron en ratones Rag1-7. a Tinciones H&E representativas de pulmones (paneles superiores) e intestino grueso (paneles inferiores). Barra de escala: 200 mm. b Puntuaciones histológicas para los pulmones.c Recuento total de células (izquierda, centro), frecuencia de células T CD4* (derecha). Los datos representan medias ± SD.n=10/grupo.d Tinción intracelular de IL{{11} }, IL-13 e IL-17 del bazo, MLN y pulmones después de la reestimulación ex vivo con PMA más lonomicina. Los datos representan medias ± SD.n=5/grupo. Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes.*p<0.05,><0.01 as="" determined="" by="" student's="">

Aunque se han descrito otras citocinas proinflamatorias o mediadores como IL-1 , OX40 y TSLP para mejorardiferenciación TH9, TL1A parece ser único en la regulación positiva de BATF, lo que abre la cromatina para el reclutamiento de otros factores de transcripción, incluido BATF3.353940. Nuestros datos de secuenciación de ARN respaldan esta conclusión que identifica un subconjunto de genes dependientes de BATF significativamente regulados por TL1A. Además, nuestros datos de secuenciación de ARN revelan que BATF3 regula la actividad de los factores de transcripción, la proliferación celular y la transducción de señales intracelulares, lo que sugiere un papel importante de BATF3 durante la diferenciación de T#9. In vivo, las células Batf3-'- TA9-TL1A dieron como resultado una reducción de la inflamación de la mucosa y de la expresión de citoquinas. No observamos una migración alterada de las células Batf3-'- TH9-TL1A al intestino, lo que contrasta con las células T BATF-'- CD4 más que no regulan al alza los marcadores de migración intestinal y no pueblan los intestinos.4' Nuestros datos respaldan el papel de BATF3 en la función fisiopatológica de las células TA9-TL1A.

Las células IL-9 y TA9 se han asociado recientemente con la patogenia de la EII.*-10 IL-9 más CD4 más células T se enriquecieron en pacientes con CU y niveles séricos elevados de IL{{ 5}} se correlacionó con enfermedad grave en pacientes con EC.-10En un modelo experimental de enfermedad similar a la CU inducida por hapteno, IL-9-y PU.1-los ratones deficientes están protegidos contra la inflamación y los anticuerpos anti-IL-9 son protectores en un modelo de prevención crónica. grado Sin embargo, no observamos ningún efecto de TL1A en la expresión de PU.1 en condiciones T9. Hemos demostrado que la estimulación de TL1A da como resultado una regulación positiva de BATF y BATF3 pero no de PU.1. Aunque PU.1 se ha descrito como un regulador maestro de la diferenciación de TH9, solo se requiere para la expresión de un subconjunto de genes TH9 y ratones. lo que sugiere que la unión de PU.1 no cambia en la independencia completa de BATF de PU.1 y BATF. 75

Demostramos que las células T,9-TL1A son altamente patógenas in vivo e inducen inflamación intestinal y pulmonar. Inflamación intestinal enTH9-TL1Areceptores se limitaba principalmente al intestino delgado. Además, observamos un mayor número de células CCR6* y CD103 en receptores TH9-TL1A in vivo. Estos datos demuestran consistentemente que el receptor de quimioquinas CCR6 y la integrina CD103 se expresan en las células TH9 y facilitan la migración a sitios inflamatorios y superficies mucosas.15,42 El aumento en el número de células CCR6 plus en receptores Tμ9-TL1A in vivo consistente con nuestra observación de inflamación principalmente del intestino delgado ya que se ha demostrado que el eje CCR6/CCL20 facilita específicamente la migración de células T,17 al intestino delgado y es plausible que mecanismos similares se apliquen a las células Tμ9.3 Nuestros hallazgos también son consistentes con hallazgos recientes de niveles séricos elevados de IL-9 en pacientes con EC, particularmente con enfermedades graves.?

TL1A mejora la diferenciación de T,1, TH2 y TA17 y, aunque no observamos ningún indicio de un cambio global de células T9 a otros subconjuntos de TH in vitro, podría sugerir que las células TH9 diferenciadas con TL1A podrían ser inestables in vivo y "trans -diferenciar" en otros subconjuntos. El potencial de transdiferenciación de las células TH9 ha sido controvertido y podría depender del contexto, el modelo de enfermedad y el estado inmunitario del huésped. En EAE, se produce la transdiferenciación de TH9 a células productoras de IFN-Y; sin embargo, el fenotipo T,9 parece ser estable en modelos de cáncer.339 Sorprendentemente, las células T9-TL1A in vivo continuaron produciendo IL{ {18}} y citocinas aguas abajo como IL-17 e IL-13 y no se transdiferenciaron. Esta idea también está respaldada por nuestros datos que muestran que el tratamiento anti-lL-9 por sí solo es suficiente para bloquear los efectos patogénicos de las células T9-TL1A. El tratamiento con anticuerpos anti-Lil-9 solo redujo la producción de IL-13 y atenuó la inflamación intestinal y pulmonar hasta los niveles de TH9. El desarrollo de la inflamación pulmonar alérgica requiere la incorporación de células TH2 y TH9. Sin embargo, nuestro modelo de inflamación pulmonar crónica no alérgica parece estar impulsado principalmente por células T.9 productoras de IL-9-, aunque no podemos excluir una contribución de células no T productoras de IL-9-en la patogénesis en nuestro modelo.

En resumen, TL1A es un fuerte inductor de la diferenciación T9 murina y humana y aclaramos las vías de señalización involucradas. Dadas las propiedades proinflamatorias de las células TH9-TL1A in vivo, dirigirse al eje TL1A-BATF3-IL-9 puede ser un enfoque terapéutico prometedor en patologías impulsadas por T19- como la EII o la enfermedad pulmonar alérgica.

MÉTODOS

Ratones C57BL/6, C57BL/6 Rag1-/, B6.SJL-Ptprc" Pepc/BoyJ(CD45.1),(B6.Cg-Nfkb1*m130l/J), Stat 6-/-(B6.129S2(C)-Stat6"miGr"/J), p50-/-B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/ (OT-I),Batrf/( Se adquirieron ratones B6.129s-Batm1.1kmm/) y Bat3-/(B6.129 S(C)-Batf3m1km"/) de Jackson Laboratory. Dr3-/- n ratones se han descrito en otro lugar.4 Los ratones se mantuvieron en condiciones SPF. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Centro Médico Cedars-Sinai. Aislamiento y diferenciación de células T Se aislaron células T ingenuas (CD62LhichcD44'o"CD25~; clones MEL-14, IM7, PC61.5; eBioscience) de bazos y MLN utilizando el EasySeptM Mouse CD4 plus Isolation Kit (Stem Cell Technologies) seguido de clasificación celular (MoFlo, Beckman Coulter). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (10 por ciento FBS) con anti-CD3 (145-2C11; BD Biosciences), anti-CD28 (37,51 ; eBioscience)(condiciones TH0) y TL1A murino (100 ng/ml; R&D Systems) en condiciones T-9 (TGF humano- 1 [3 ng/ml], Biolegend, IL{{66} } [20 ng/ml, PeproTech).Después de 2 días, se añadió IL-2(20 U/ml).Para evaluar la proliferación celular, las células seleccionadas se marcaron con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE; Invitrogen), diferenciadas por 5 días, y la dilución de CFSE se evaluó mediante citometría de flujo.Para evaluar la diferenciación T9 específica de antígeno, se estimularon células T CD4 plus ingenuas de ratones OT-Il durante 3 días con 1 ug/ml de OVA;23-339 péptido en presencia de APC singénicas (proporción 1:3). e preparado por depleción de células CD90.2T de esplenocitos (Stem Cell Technologies) seguido de tratamiento con mitomicina C. aislamiento de células T CD4 plus humanas y diferenciación Se obtuvo sangre de voluntarios sanos después del consentimiento informado de acuerdo con los procedimientos establecidos por la Junta de Revisión Institucional de Cedars-Sinai (IRB # 3358, 2673). Se aislaron linfocitos T CD4 más vírgenes (CD4 más CD25-CD45RA más CD45RO7) de PBMC utilizando el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD4 humanos EasySepl (tecnología de células madre) seguido de clasificación celular. Las células se cultivaron con anti-CD3 (5 ug/ml) y anti-CD28 (2 ug/ml) con TL1A humano (100 ng/ml; Fitzgerald) en condiciones TH9 (TGF humano- 1 [5 ng/ml] , IL humana-4 [10 ng/ml]). ELISA La concentración de citocinas en los sobrenadantes de cultivo se analizó mediante ELISA para IL-9 murina o humana, IL{108}} e IL-13(eBioscience). Tinción intracelular Las células se reestimularon con 50 ng/ml de PMA (phorbol 12-miristato 13-acetato), 500 ng/ml de ionomicina y monensina (eBioscience) durante 4 h, teñidas con anti-CD4 (RM{{ 117}},eBioscience), fijado y permeabilizado con el juego de tampones de tinción FoxP3 (eBioscience), y teñido con anticuerpos contra IL murino-9 (RM9A4, BioLegend),IL-10(JES{{123} }E3),IL-13(13A),IL-17A (eBio17B7), IL-17F (eBio18F10),IFN-y(XMG1.2),IL{{136} } (BVD6-24G2),IL-22 (1H8PWSR),Ki67(SolA15),BATF(MBM7C7), IRF4 (3E4),IL humano-9(MH9A4, todo eBioscience), y BATF3(841792, Sistemas de I+D). Las muestras se analizaron utilizando un citómetro de flujo CyAnADP (Dako Cytomation) y el software FlowJo (TreeStar Inc.).

RT-PCR cuantitativa

El ARN total se aisló usando kits RNeasy y se transcribió inversamente en ADNc con el kit Omniscript RT (ambos de Qiagen). La qPCR se realizó usando el sistema Mastercycler" ep realplex² (Eppendorf). Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen) y TaqMan sondas y cebadores fueron utilizado para Actb, I9, I10, 13 y BATF (IDT) (Tabla complementaria 7). RT² SYBR"Green qPCR Mastermix (Qiagen) y conjuntos de cebadores se utilizaron para Actb y Batf3 (IDT). La expresión de ARNm de los genes diana se normalizó a la expresión de Actb. La expresión génica relativa se calculó por el método.

la inmunoprecipitación de cromatina 2-AACt

Cloe se realizó con el kit de inmunoprecipitación de cromatina EZ ChIP (Millipore) seguido de análisis qPCR. Totalmente, se estimularon, fijaron, sonicaron e inmunoprecipitaron células de 1 × 10 grados usando 2 ug de anticuerpos de grado ChIP: anti-BATF (sc-100974), anti-BATF3 (sc-162246), ratón normal lgG(sc-2025), anti-IRF4(sc-6059), cabra normal lgG(sc-2028)(todo Santa Cruz Biotechnology), anti-acetil-histona H3({{17 }}), y IgG de conejo normal (Milli-pore). El ADN inmunoprecipitado se sometió a entrecruzamiento inverso, se purificó mediante columnas giratorias y se analizó mediante qPCR (secuencias de cebadores: Tabla complementaria 7). Para cuantificar el ADN inmunoprecipitado, generamos una curva estándar a partir de diluciones en serie del ADN de entrada. Los datos se presentan como el porcentaje de ADN de entrada basado en la normalización frente a la cantidad de ADN de entrada.

Secuenciación de ARN (números de acceso de GEO: GSE60362 y GSE106926)

Seg. de ARN de entrada baja (TH9 frente a TH9-TL1A): se empleó el kit de ARN de entrada baja SMARTer Ultra" de Clontech para secuenciación v3 para generar bibliotecas de ADNc de doble cadena de 1,5 a 2,5 ng de ARN total de cada muestra según las recomendaciones del fabricante. Las bibliotecas de ADNc de doble cadena se fragmentaron individualmente y se ligaron con adaptadores de código de barras lon Torrent lon Xpress" utilizando el kit de biblioteca de fragmentos lon Xpress" Plus con modificaciones limitadas, incluidas bibliotecas finales seleccionadas por tamaño con una limpieza de doble perla y volumen V de adaptadores de iones Se evaluó la concentración y la longitud de las bibliotecas de RNA-Seq utilizando el kit de ensayo QubitdsDNA HS de Invitrogen y AgilentKit de ADN de alta sensibilidad, respectively. Samples were multiplexed to obtain >10 millones de lecturas cada uno para la secuenciación. Las bibliotecas agrupadas se amplificaron en lon Sphere" y se secuenciaron con el kit lon PIM Sequencing 200 v2,lon Torrent".

ARNm-Seg (WT vs.Baft3-7T,9-TL1A): Illumina TruSeq Stranded mRNA library preparation kit was employed for RNA-Seq. Of total RNA, 1 ug per sample was used for poly-A mRNA selection using streptavidin-coated magnetic beads. cDNA was synthesized from enriched and fragmented RNA using reverse transcriptase (Super-Script ll, Invitrogen) and random primers. The cDNA was converted into double-stranded DNA, and enriched with PCR for library preparation. The PCR-amplified library was purified using Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter). The concentration of the amplified library was measured with a NanoDrop spectrophotometer and on an Agilent 2100 Bioanalyzer. Samples were multiplexed to obtain >20 millones de lecturas/muestra y secuenciado en una plataforma NextSeq 500 (Illumina) usando secuenciación de extremo único 75-bp.

Análisis de los datos. Las lecturas sin procesar fueron filtradas y recortadas por el kit de herramientas FASTX (http://hannonlab.cshl.edu/fastx{{0}}toolkit/) y alineadas usando Tophat versión 2.0.8 con UCSC GRCm38/mm10 anotación del genoma de referencia del ratón (http://genome.ucsc.edu). Los recuentos de lecturas de genes se generaron con HTSeq (v0.5.4) y luego se normalizaron mediante la media recortada del método de normalización de valores M con edgeR (v3.0.8) en Bioconductor en R (v2.15), que utiliza una media recortada ponderada de las proporciones de expresiones logarítmicas. Para todos los análisis, solo se usaron señales de calidad (umbral: diez recuentos por millón en al menos dos de cuatro muestras). Se realizó un análisis no supervisado utilizando los 100 genes mejor clasificados por el rango intercuartílico y luego se generó un agrupamiento jerárquico utilizando (v2.11) utilizando correlaciones de Pearson bidireccionales para visualizar patrones de expresión génica omnipresentes e imparciales. Se utilizó un análisis supervisado con una prueba exacta de Fisher modificada en edgeR y un límite de tasa de descubrimiento falso del 10 % con el procedimiento de Benjamini y Hochberg para determinar las expresiones diferenciales entre TH9 y T.9-TL1A o WT y Batf{{23} }T,9-TL1A. El análisis de enriquecimiento de vías se realizó con DAVID6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) con umbral de conteo antiguo =5 y umbral de puntuación de facilidad=0.05.

modelo de transferencia de células T

Las células T CD4 más CD62LighcD44"cD25- de ratones CD45.1 se diferenciaron en células T9 o T,9-TL1A durante 3 días. Rag macho{{10}}/ratones receptores se inyectaron ip con 0,5 × 10 grados TH9, o TH9-células TL1A. Los ratones se pesaron durante 6-8 semanas. Para los experimentos de neutralización, a los ratones se les inyectó ip con control anti-IL-9 o lgG2b anticuerpo (ambos 50 ug/dosis; R&D Systems) tres veces por semana durante 4 semanas y dos veces por semana durante el tiempo restante a partir del día de la transferencia de células T. Los tejidos se fijaron con formalina, se incluyeron en parafina y se tiñeron con H&E o AB-PAS.La inflamación fue puntuada por un sistema de puntuación semicuantitativo por un patólogo entrenado ciego a las condiciones experimentales.45,46 LPMC fueron aislados del intestino grueso como se describió previamente.7 El tejido pulmonar fue digerido durante 45 min a 37 grados C con 10 ml de HBSS que contiene 15 ug/ml de Liberase" (Roche) y 25 ug/ml de DNasa I (Sigma) y filtrado a través de un filtro de células de 40-μm seguido de lisis de glóbulos rojos. Las suspensiones unicelulares se tiñeron con anti-CD4, anti-CD45.1(A20), anti-CCR6 (29-2L17) y anti-CD103(2E7, todo eBioscience) y anti-Ki{{52 }}(SolA15, BD PharMingen)anticuerpos para citometría de flujo o reestimulados con anticuerpos anti-CD3c/anti-CD28 durante 3 días. Los niveles de citoquinas en los sobrenadantes se midieron por ELISA.

Estadísticas

La significación estadística se calculó utilizando el software SPSS (IBM SPSS Statistics 20, IBM Machines Corp., Armonk, NY, EE. UU.). Los datos se analizaron utilizando un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de una prueba t de Student de dos colas no apareada post hoc, o prueba U de Mann-Whitney, según se indica. Las diferencias se consideraron significativas en p<>

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por el NIH (DK056328 a SRT) y la Fundación F. Widjaja (SRT y KSM). Anita Vibsig Neutzsky-Wulff recibió becas posdoctorales de la Fundación Carlsberg (Dinamarca) y la Fundación Lundbeck (Dinamarca). Jordan Nunnelee recibió un Premio de Investigación Estudiantil de la Fundación de Crohn y Colitis de América. El biobanco MIRIAD IBD de Cedars-Sinai cuenta con el respaldo del Instituto de Investigación de Inmunobiología e Inflamación Intestinal de la Fundación F. Widjaja, las subvenciones NIH/NIDDK P01 DK046763, U01 DK062413 y The Leona M and Harry B Helmsley Charitable Trust.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

MT,HH,LT,MW,BS,MW, BS,MW,JN,JS, AN-W,RB,YW,JT,VF y KM. realizó experimentos analizó los datos y revisó críticamente el manuscrito. AP, J. T y YW realizaron análisis de datos de RNA-Seq. MT, ST y KM diseñaron los experimentos. MT y KM escribieron el manuscrito.

INFORMACIÓN ADICIONAL

La versión en línea de este artículo (https://doi.org/10.1038/s41385-018-0122-4) contiene material complementario, que está disponible para usuarios autorizados.

Conflicto de intereses: Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Nota del editor: Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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