Acteósido derivado de Cistanche mejora la osteoporosis inducida por glucocorticoides al activar la vía PI3K/AKT/mTOR

Abstracto

Objetivo

Los glucocorticoides se utilizan ampliamente en la práctica clínica; sin embargo, pueden causar efectos secundarios, comoosteoporosis. Acteósido(ACT) de Cistanche se ha utilizado para combatir una variedad de enfermedades. El estudio se realizó para evaluar la eficacia de ACT en el tratamiento inducido por glucocorticoides.osteoporosis(GIOP) y su mecanismo potencial.

Métodos
Se inyectó dexametasona (Dex) por vía intramuscular para inducirosteoporosisen un modelo de rata, y ACT se administró por vía oral. ACT se complementó in vivo en Dex-stimulatedosteoblásticoCélulas MC3T3-E1. Se realizó RT-qPCR para evaluar los niveles de ARNm deformación ósea(Runx2, CoL1A1) y reabsorción ósea (OPG y RANKL). Se aplicó un kit ELISA comercial para evaluar los niveles séricos de OC y CTX. Se realizó Western blot para evaluar los niveles de proteína en la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR. Se realizaron el ensayo CCK-8 y la citometría de flujo para evaluar la viabilidad y la apoptosis de los osteoblastos.

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Resultados
ACT redujo el deterioro de la microestructura ósea inducido por Dex, aumentó los niveles séricos de OC y disminuyó los niveles de CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and apoptosis promovida; sin embargo, este efecto fue atenuado en gran medida por ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Conclusión
ACTUAR desdeCistanchepuede ejercer efectos osteoprotectores al activar la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR para aliviar la osteoporosis inducida por Dex.

Palabras clave:Acteósido Cistancheinducida por glucocorticoidesosteoporosis

Introducción
La osteoporosis (OP) es una enfermedad esquelética generalizada caracterizada por una masa ósea baja, destrucción de la microestructura del tejido óseo y desequilibrio en la homeostasis ósea [1]. La OP causa más de 8,9 millones de fracturas al año y las fracturas osteoporóticas se producen casi cada 3 segundos y provocan una discapacidad de por vida o la muerte [2]. Los glucocorticoides (GC) se administran comúnmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias no infecciosas (como el asma y la enfermedad inflamatoria intestinal), así como para las enfermedades autoinmunes [3]. Sin embargo, el uso prolongado de GC predispone a más del 30 % de los casos de OP y más del 10 % de los casos de osteonecrosis [4]. Los GC inhiben directamente la proliferación y diferenciación de los osteoblastos [5], disminuyen la maduración y la actividad e inducen la apoptosis de los osteoblastos, lo que a su vez conduce al desarrollo de osteoporosis inducida por glucocorticoides (GIOP) [6]. Además, la creciente evidencia sugiere que la disfunción de los osteoblastos es la causa principal de la pérdida ósea. Por lo tanto, un aumento en el número y función de los osteoblastos parece ser la principal estrategia para prevenir la OP, especialmente la GIOP.

Las hierbas medicinales, especialmente aquellas basadas en compuestos naturales, se han practicado durante miles de años para el tratamiento de diversas enfermedades [7]. Cistanche es una hierba preciosa registrada en la Farmacopea China que crece en el área sur de la Región Autónoma de Xinjiang Uygur y se conoce como ginseng del desierto [8]. Se ha demostrado que la cistanche tiene varios efectos, como la mejora inmunológica, la protección renal, los efectos antienvejecimiento, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores [9].Acteósido(ACT) es un glucósido feniletanólico en Cistanche, que tiene actividades biológicas, como inhibición de la apoptosis neuronal [10], alivio del daño hepático [11], antiinflamatorio [12], antioxidación [13] , prevención de la diabetes [14] y la obesidad [15], así como la degeneración del cartílago articular [16]. Además, varios estudios informaron la farmacocinética de ACT y confirmaron que el efecto terapéutico existe incluso si la utilización oral es solo del 0,12 por ciento. ACT se considera un profármaco con metabolitos activos in vivo [17].

Zhang et al. demostró un efecto protector potencial de la ACT sobre la pérdida ósea inducida por la ovariectomía en ratas [18]. ACT modula la vía de señalización IGF-1/PI3K/mTOR para prevenir la pérdida ósea en ratas diabéticas [19]. Se ha informado que la vía PI3K/AKT/mTOR tiene funciones reguladoras críticas en varias enfermedades, incluida la GIOP [20]. La naringina alivia la GIOP al regular la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR [21]. Además, esta vía de señalización regula la diferenciación de osteoblastos [22], la formación de hueso [23] y la curación de fracturas [24]. Sin embargo, se desconoce el papel potencial de ACT en GIOP y si está regulado por la modulación de la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR.

El presente estudio tuvo como objetivo comprender los efectos protectores de ACT en un modelo de rata GIOP y osteoblastos in vitro y dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes.

materiales y métodos
animales de experimentación
Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (SD) macho de 8- semanas de edad que pesaban entre 280 y 340 g del Centro de animales de laboratorio de Shanghái (CAS, Shanghái, China). Los procedimientos de cuidado de los animales de experimentación se llevaron a cabo siguiendo el protocolo aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Qiqihar del Tercer Hospital Afiliado. Y el estudio se realizó de acuerdo con las pautas ARRIVE. Los animales se alojaron en centros de animales libres de patógenos, 24 ± 2 grados, ciclos de luz y oscuridad de 12 h, 50 ± 5 por ciento de humedad y con libre acceso a alimentos y agua.

Construcción del modelo GIOP
Después de 7 días de alimentación adaptativa, las ratas se dividieron aleatoriamente en grupos de control y modelo utilizando el método de tabla de números aleatorios, se inyectó dexametasona (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EE. UU.) 5 mg/kg dos veces por semana durante 6 semanas. por vía intramuscular para inducir OP en ratas en el grupo modelo [25]. A las ratas del grupo de control (n = 10) se les inyectó una cantidad igual de solución salina. No se observaron cambios significativos en el peso corporal en las ratas de ambos grupos a las 6 semanas. Posteriormente, las ratas del grupo modelo se subdividieron en el grupo modelo, el grupo de dosis baja de ACT (modelo más ACT-L) y el grupo de dosis alta de ACT (modelo más ACT-H). ACT (HPLC 98 por ciento) se obtuvo de Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, China) y se trató con una suspensión acuosa de disolvente. Se administró oralmente una dosis de 50 mg/kg/d y 100 mg/kg/d a ratas en los grupos de dosis baja y alta (8 ratas por grupo), respectivamente, y se continuó durante 8 semanas. Entre ellos, el tamaño de la muestra se calculó en base a un estudio previo [26]. Considerando un nivel de significancia bilateral de 0.05 [intervalo de confianza del 95 por ciento (= 0.05)], una potencia del 80 por ciento y un tamaño del efecto de 0.5, el análisis de la potencia estimó un tamaño de muestra necesario de 6 animales por grupo asumiendo un nivel de efecto relevante del 30 por ciento de osteoporosis. Además, con una tasa de abandono del 20 por ciento, se consideró ideal 8 animales por grupo (un total de 32 ratas).

Muestras de suero de rata
Después de 8 semanas, las ratas se anestesiaron con hidrato de cloral al 10 % (400 mg/kg, por vía intraperitoneal, Solarbio, Pekín, China), se extrajo sangre de la aorta abdominal, se coaguló a temperatura ambiente y se centrifugó a 3500 rpm/min durante 10 min. El suero se almacenó en tubos de centrífuga de 1,5 ml hasta su uso posterior.

Evaluación de la densidad mineral ósea
La densidad mineral ósea (DMO) se utilizó con un densitómetro óseo de animales pequeños DAX (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghái, China). Brevemente, las ratas se colocaron en posición supina y las patas traseras se colocaron hacia afuera. Se escaneó el fémur derecho de las ratas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se registraron los valores de DMO [27].

Análisis de morfología ósea
Al final del experimento, las ratas fueron sacrificadas mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral en exceso, y los fémures fueron fijados en etanol al 70 por ciento. Posteriormente, se realizaron escaneos en un sistema VivaCT 40μCT como se describe en un estudio anterior y el volumen óseo/volumen total (BV/TV), el número trabecular óseo (Tb.N), el espesor trabecular óseo (Tb.Tn) y la separación trabecular ósea (Tb.Sp) fueron evaluados [28]. Para la eutanasia, las ratas SD se anestesiaron después del análisis de la morfología ósea mediante una inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 10 por ciento (350 mg/kg).

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Se utilizaron kits comerciales de ELISA para la detección de niveles de osteocalcina (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) y telopéptido C-terminal (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) en el suero de ratas. Brevemente, los reactivos se eliminaron a 18-25 grados para equilibrar y preparar la solución para el lavado y el trabajo estándar. Placas de enzimas Las placas se prepararon con pocillos estándar, de blanco y de muestra. Se agregaron aproximadamente 100 μL de solución de diluyente de muestra a los pocillos, se incubaron durante 90 minutos a 37 grados y se reemplazaron con un anticuerpo biotinilado durante 60 minutos a 37 grados. Después del lavado, se añadió la solución de trabajo de unión a enzimas y se incubó durante 30 min. Se añadió la solución de sustrato (90 μL) y se incubó durante 15 min con protección de la luz. Cuando apareció el gradiente azul en los pozos estándar, se agregaron 50 μL de la solución de terminación y se analizó el cambio en OD450.

PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR)
Se añadió reactivo TRlzol LS al suero de ratas y células MC3T3-E1 tratadas con ACT, y el ARN total se extrajo mediante incubación a temperatura ambiente seguido de la adición de cloroformo. La concentración y la pureza del ARN se confirmaron midiendo la absorbancia A260/280 en un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000. Se usó el kit de transcriptasa inversa SuperScript II para la transcripción inversa de ARN a ADNc. Posteriormente, se aplicó cDNA como plantilla, se agregó un cebador, y el kit de mezcla maestra de PCR SYBR-Green se mezcló y complementó con ddH2O a 20 μL, y la reacción de amplificación de PCR se realizó utilizando Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR (ABI, CA, EE. UU.). GAPDH se utilizó como referencia interna para la normalización, y los niveles de expresión relativos se calcularon mediante el método 2−ΔΔCt y se realizaron por triplicado. La secuencia del cebador para el factor de transcripción relacionado con Runt 2 (Runx2), colágeno tipo I 1 (CoL1A1), activador del receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL), osterix y osteoprotegerina (OPG) se presentan en la Tabla 1.

Análisis de Western Blot
Se añadió a las células lisado de RIPA que contenía un 1 por ciento de inhibidor de proteasa, y la proteína total de cada grupo se recogió después de la lisis de las células mediante agitación durante 5 minutos a 4 grados. Se empleó el kit de ensayo BCA para cuantificar la concentración de proteínas en cada grupo. Después de esto, las muestras de proteína se mezclaron con tampón de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10 por ciento en un volumen igual y se hirvieron en un baño de agua a 95 grados durante 5 minutos para la desnaturalización de la proteína. Se preparó un gel vertical de poliacrilamida-SDS al 12 por ciento y, después de que el gel se solidificó, se tomaron muestras de 30 ug de proteína para la separación por electroforesis en gel de 120 mA y 90 min. Luego, la proteína se transfirió a la membrana de PVDF a 90 V durante 120 min. Después de sellar con albúmina de suero bovino al 5 por ciento, la membrana de PVDF se cortó según el peso molecular del marcador y la banda de proteína diana y se incubó con el anticuerpo primario correspondiente durante la noche a 4 grados. Los anticuerpos policlonales de conejo contra p-AKT, p-mTOR y p-PI3K se diluyeron en una proporción de 1:1000 (Proteintech, Wuhan, China). El TBST se lavó durante 30 min y se incubó con el correspondiente anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante a temperatura ambiente durante 1 h. La transferencia se visualizó utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorados. La densidad de las bandas de proteína se cuantificó utilizando Image J. GAPDH se empleó como control para calcular los niveles relativos de proteína.

Cultivo celular y agrupación.
Se adquirieron preosteoblastos de ratón MC3T3-E1 de Chinese Tissue Culture Collections (CTCC, China) y se cultivaron en -MEM que contenía 10 % de suero fetal bovino y 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina en un incubadora humidificada a 37 grados y 5 por ciento de CO2. Para el cultivo de diferenciación ósea, se preparó un medio de inducción osteogénica mezclando glicerofosfato 10 mM- -y 50 mg/mL de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich) con -MEM y se agregó a las células MC3T3-E1 para inducir su diferenciación. El medio se cambió después de 3 días. Se usaron cultivos durante 14 días para determinar la viabilidad de la fosfatasa alcalina (ALP). Además, las células se pretrataron con el inhibidor de PI3K LY294002 (10 μM) durante 30 min, seguido de tratamiento con Dex y ACT.

Ensayo de viabilidad celular
El ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) se realizó para evaluar la viabilidad de los osteoblastos tratados con ACT. Las células MC3T3-E1 se inocularon en placas de 96 pocillos a razón de 5 × 103 células/pocillo. Se consideró una cantidad de 1 μM de Dex en base a estudios previos [29] y se incubó conjuntamente con concentraciones en gradiente de ACT (10-8, 10-7, 10-6 y 10-5 M). El medio de cultivo en las 96-placas de pocillos se reemplazó después de agregar un medio de mezcla y el reactivo CCK-8 en una proporción de 10:1. Después de una incubación continua durante 1 hora a 37 grados, se evaluó el cambio en la DO450.

Detección del número de apoptosis de osteoblastos
Las células MC3T3-E1 que fueron sometidas a diferentes tratamientos fueron digeridas usando tripsina libre de EDTA y recolectadas por centrifugación. Después de lavar con un tampón de unión 1x, se añadieron 5 μl de anexina V-FITC y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min, se complementaron con 5 μl de PI y se pasaron a través de una red de nailon 200-mesh. Las muestras se analizaron utilizando el sistema de citometría de flujo FACScan.

ensayo de actividad ALP
Las células MC3T3-E1 se inocularon en 24-placas de pocillos y se añadieron ACT y Dex después del enyesado. El medio de cultivo celular se reemplazó con un medio de diferenciación osteogénica para cultivo. Después de usar la lisis de células por solución de lisis celular (P0012J, Beyotime Biotechnology), el sobrenadante se recogió por centrifugación y se trazó la curva estándar. Se utilizó un kit de ALP (P0132S, Beyotime Biotechnology) para evaluar la actividad de ALP y se calculó la DO450.

análisis estadístico
Después de realizar tres experimentos independientes por triplicado, los datos se analizaron con el software GraphPad Prism 6.0 y se expresaron como media ± desviación estándar. Se empleó ANOVA para comparar las diferencias estadísticas entre múltiples grupos. El valor P < 0.05 se consideró estadísticamente diferente.