Parte uno Acteoside reprimió la polarización de Microglia M1 a través de la vía de señalización NF-κB inhibida y la recuperación de la función mitocondrial mediada por AMPK

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PARTE 1 ¿Cómo mejoran Cistanche Acteosides la vitalidad de las células cerebrales y alivian la enfermedad de Alzheimer?

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Palabras clave de investigación: acteósido, células BV-2, metabolismo, RNA-seq, mitocondrias, neuroinflamación

Resumen

Antecedentes: la enfermedad de Alzheimer (EA) es el tipo de demencia más frecuente. Tiempoacteósido(ACT), un compuestoaisladodeCistanche tubulosa, poseepropiedades neuroprotectoras. Sin embargo, el mecanismo subyacente en la regulación de la polarización de la microglía permanece mal definido. Métodos: En este documento, se aplicó el modelo de AD inducida por AlCl3-en larvas de pez cebra para descubrir la eficacia terapéutica de ACT. Se usaron células BV-2 para demostrar el papel de ACT en la polarización de la microglía. Se combinaron secuencias de ARN, HPLC-Q-TOF-MS, western blot y acoplamiento molecular para confirmar su mecanismo.

Resultados: ACT mejoró significativamente la discinesia experimental y los trastornos del sistema nervioso en el pez cebra. Posteriormente, suprimió la polarización M1 y promovió el fenotipo M2 en células BV-2 inducidas por LPS. Primero demostramos que ACT ejercía un profundo impacto transcriptómico, que implicaba la regulación de vías de señalización clave en la inflamación, la biosíntesis de arginina, así como la biosíntesis de pantotenato y CoA, en correlación con la función mitocondrial. El tratamiento con ACT redujo la polarización de la microglía M1 al inhibir la vía de señalización de NF-κB. Y las vías metabólicas se confirmaron aún más mediante HPLC-Q-TOF-MS. Además, ACT rectificó el exceso de ROS para restaurar la función mitocondrial a través de la regulación positiva de PGC-1 y UCP-2 mediada por AMPK, de acuerdo con los cambios metabólicos. Curiosamente, ACT puede unirse directamente tanto a NF-κB como a AMPK, como lo demuestra el acoplamiento molecular. Conclusiones: la investigación proporcionó un mecanismo de infusión de ACT e ilustró una nueva perspectiva basada en la disfunción mitocondrial para revelar la conexión entre el metabolismo y la polarización de la microglía.

Fondo

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa común acompañada de deterioro cognitivo y discinesia[1]. Se caracteriza por pérdida neuronal severa, placas seniles y ovillos neurobrillares[2]. La patogenia de la EA es multidimensional y está ligada a la neuroinflamación. La neuroinflamación está impulsada por la activación de las células gliales, estrechamente relacionada con el desarrollo de la EA[3, 4]. Durante la progresión y exacerbación de la neuroinflamación, la microglía se considera el factor clave. La microglía son las células inmunes primarias en el sistema nervioso central. Está estrechamente asociado con una cascada de procesos, que incluyen el desarrollo del cerebro, el mantenimiento de un entorno neutral, así como la respuesta a las lesiones y la reparación[1]. Además, la microglía puede estimularse a un fenotipo M1 y la expresión de citocinas proinflamatorias aumenta cuando se producen enfermedades relacionadas con la neuroinflamación, como la EA [5]. Los estudios también demuestran que la polarización al fenotipo M1 suele ir acompañada de trastornos metabólicos[6], lo que provoca un desequilibrio del metabolismo energético y disfunción mitocondrial[7]. Estos cambios adversos se derivan de la neurodegeneración, incluso de la EA.

Acteósido(ACT), un glucósido feniletanoide, se deriva principalmente deCistanchetubulosa. Cada vez más evidencia ha sugerido queACTUARposeía numerosas farmacológicasactividades, incluidos los efectos neuroprotectores[8], antiinflamatorios[9] y antioxidantes[10]. En particular, se ha informado que ACT mejora el aprendizaje y el deterioro de la memoria, así como también regula al alza el metabolismo energético en ratas inducidas por estreptozotocina [11]. También se ha sugerido que inhibe la muerte de células apoptóticas neuronales y el daño mitocondrial en ratones experimentales con encefalomielitis autoinmune [12]. Sin embargo, menos estudios se han centrado en el efecto de ACT en la polarización de microglia M1/M2. Especialmente, no se han llevado a cabo varios mecanismos, como la reparación de la función mitocondrial y la regulación del metabolismo celular. Además, el mecanismo deACTUARcontribuido a la polarización microglia M1/M2 ha permanecido sin explorar. El presente informe tuvo como objetivo investigar la eficacia terapéutica de ACT, así como el mecanismo molecular subyacente deACTUARenANUNCIO. Aquí en,ACTUARmostró un efecto de neuroprotección significativo en larvas de pez cebra con DA inducida por AlCl3-. Además, ACT inhibió eficazmente la polarización M1 y promovió el fenotipo M2 en células BV-2 inducidas por LPS. Secuenciación de ARN (RNA-Seq) integrada con el método de metabolómica para comprender mejor el mecanismo subyacente de ACT en la regulación de la polarización de la microglía. Se investigó la diafonía entre el metabolismo y la polarización de la microglía en términos de la función mitocondrial. Este estudio brindará un nuevo respeto para la investigación adicional de ACT como un agente terapéutico potencial para tratar la EA.

Métodos

Agrupación de animales y modelos.

En este estudio se eligió pez cebra de tipo salvaje (cepa AB, 4 meses de edad) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h a 28 grados, siguiendo el método anterior[13]. El fertilizante natural y los embriones desarrollados normalmente se generaron y cultivaron hasta 3 días después de la fertilización (pdf) en una incubadora de iluminación. Todos los experimentos con peces cebra se llevaron a cabo bajo la supervisión del Comité de Ética Animal de la Universidad Farmacéutica de China. Las larvas de pez cebra se dividieron en seis grupos y se trataron de 3 pdf a 7 pdf: grupo de control, grupo modelo, grupo modelo más clorhidrato de donepezilo (DPZ), grupo modelo más ACT. El grupo de control se mantuvo en el medio con DMSO al 0,2 por ciento y el grupo modelo se trató con AlCl3 150 μM (pH 5,8). El grupo modelo más DPZ se cotrató con AlCl3 y DPZ 8 μM. Los grupos del modelo más ACT se cotrataron con AlCl3 y diferentes concentraciones de ACT (200, 100, 50 μM). ACT (pureza de HPLC superior o igual al 98 por ciento) se obtuvo de Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China). AlCl3·6H2O y DPZ se adquirieron de Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, China).

Análisis de comportamiento Página 3/34 Los movimientos de las larvas de pez cebra se registraron con un analizador de comportamiento ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) a 28 grados. Brevemente, los parámetros de comportamiento y el procesamiento de resultados fueron consistentes con el método que establecimos anteriormente [13]. Aquí, se seleccionaron la velocidad promedio (AS), el cambio de velocidad (ΔS), la tasa de recuperación de discinesia (DRR) y la eficiencia de respuesta (RE, porcentaje) para evaluar la recuperación de discinesia en el pez cebra.

Determinación de la actividad de acetilcolinesterasa (AChE) y colina acetiltransferasa (ChAT)

Después del tratamiento de 3 pdf a 7 pdf, se recolectaron larvas de pez cebra para medir la actividad de AChE y ChAT.

Según el protocolo del fabricante, la actividad se detectó mediante los kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghái, China). Y las concentraciones de proteína de diferentes muestras fueron determinadas por el método BCA

Cultivos celulares y tratamientos.

La línea celular BV-2 (línea celular microglial murina inmortalizada) se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Se cultivaron en DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, China). El medio se complementó con 10 % de FBS (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.), 100 U/mL de penicilina, así como 100 mg/mL de estreptomicina, con 95 % de aire/5 % de CO2 a 37 °C. Las células BV-2 se incubaron con ACT (50, 25, 12,5 μM) o se estimularon con lipopolisacárido (LPS, 1 ug/mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) durante 24 h. Finalmente, se recogieron todas las células o sobrenadante para los distintos análisis.

Ensayo de viabilidad celular

Se utilizó el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) para evaluar la viabilidad de las células BV-2. Las células se sembraron en una 96-placa de pocillos (1 x 104 células/pocillo, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). Brevemente, el medio se eliminó al final del tratamiento y se agregaron 100 μl de medio sin suero que contenía solución de CCK-8 a cada pocillo durante 2 horas a 37 grados. La absorbancia se midió a 450 nm con un lector de microplacas (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, EE. UU.). La viabilidad celular se expresa como un porcentaje del grupo de control. El experimento se repitió tres veces.

Ensayo de producción de óxido nítrico (NO)

El NO se determinó midiendo los niveles de nitrito en el sobrenadante del cultivo BV-2 utilizando el reactivo de Griess. Brevemente, al final del tratamiento, el medio (100 μL) se transfirió a una nueva placa de 96-pocillos. Se añadió el mismo volumen de reactivo de Griess a cada pocillo y se hizo reaccionar durante 15 min en la oscuridad. La absorción a 540 nm se determinó mediante un lector de microplacas.

Niveles de citocinas inflamatorias en el sobrenadante

Las concentraciones de TNF-, IL-1 e IL-10 en el sobrenadante de células BV-2 se determinaron mediante kits ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghái, China). ).

Observación de la morfología celular

Para determinar el efecto de ACT en la polarización M1/M2 de las células BV-2, las células se sembraron en una placa de pocillos 6-y se observaron bajo el microscopio invertido (Nikon ECLIPSE Ti2, Japón).

Determinación del metabolismo celular mediante análisis HPLC-Q-TOF-MS

Las células BV{{0}} se sembraron en una placa 6-bien por separado (n=6/grupo). Después del tratamiento, se eliminó el medio y las células se lavaron tres veces con PBS frío. Luego se expone inmediatamente a nitrógeno líquido para suprimir el metabolismo de las células. Las células se recogieron con metanol frío al 80 por ciento (1 ml/pocillo) y la suspensión se transfirió a un tubo Eppendorf de 2 ml. Para facilitar la precipitación de proteínas, agitar vigorosamente durante 1 min y centrifugar a 13,000 rpm durante 15 min a 4 grados. La suspensión celular se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo de 2 mL y se secó bajo una corriente de nitrógeno y se almacenó a -80 grados hasta su análisis. El residuo seco se reconstituyó en 15{{40}} μL de acetonitrilo al 25 por ciento preenfriado. Para garantizar la estabilidad y precisión del análisis de secuencias, se combinaron volúmenes iguales (10 μL) de cada muestra de células como muestras de control de calidad (QC). Durante la detección de metabolitos, estas muestras se inyectaron después de cada seis muestras de células para confirmar su estabilidad. Se inyectó una alícuota de 1 μL para HPLC-Q-TOF-MS. El análisis HPLC-Q-TOF-MS se realizó en el sistema HPLC Agilent 1290 conectado con el espectrómetro de masas Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La separación se realizó en una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1x100 mm, 1,7 μm). La fase móvil estaba compuesta por 0,1 por ciento de ácido fórmico-agua (v/v; A) y acetonitrilo (B). El caudal se fijó en 0,4 ml/min con la siguiente condición de elución de gradiente óptimo: 0 a 2 min, 5 por ciento de B; 2 a 20 min, 5 por ciento a 95 por ciento B (modo de iones positivos); 0 a 2 min, 5 por ciento B; 2 a 20 min, 5 por ciento a 95 por ciento B (modo de iones negativos). Los parámetros de funcionamiento del espectrómetro de masas se establecieron como sigue: temperatura del gas, 320 grados; gas de secado, 10 L/min; nebulizador, 35 psi; VCap, 4000 V; fragmento, 120 V. Los datos sin procesar se operaron con el software MassHunter Workstation versión B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los datos sin procesar fueron preprocesados ​​por la plataforma XCMS. El análisis de componentes principales (PCA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) de los datos normalizados se realizaron con MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). En combinación con la bibliografía, los metabolitos diferenciales (VIP > 1, T-test P < 0,05)="" se="" identificaron="" en="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finalmente,="" el="" análisis="" de="" rutas="" se="" realizó="" con="">

Medición del potencial de membrana mitocondrial (MMP)

Se detectó MMP usando una sonda fluorescente JC-1 (Beyotime, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células de diferentes grupos se enjuagaron con PBS y se incubaron con solución de tinción JC-1 durante 20 minutos a 37 grados. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con tampón de tinción. Luego, las señales fluorescentes fueron detectadas por citometría de flujo (BD Accuri C6).

Medición de adenosina 5'-trifosfato mitocondrial (ATP)

La concentración de ATP en las mitocondrias se detectó mediante un kit de ensayo de ATP (Beyotime, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se descartó el medio de cultivo de células BV-2 de diferentes grupos y las células se homogeneizaron con tampón de lisis en hielo. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación (12,000 g, 5 min) se utilizó para determinar la concentración de ATP. La luminiscencia (reacción de fluoresceína catalizada por luciferasa) fue detectada por el lector de microplacas multimodo EnVision (PerkinElmer).

Medición del nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares

Se usó el kit de ensayo ROS (Beyotime, China) para medir el nivel de ROS. Las células de diferentes grupos se incubaron con DCFH-DA (10 μM) durante 20 min a 37 grados. Después de cargar la sonda, las células se lavaron tres veces con DMEM. Luego, se detectaron señales fluorescentes por citometría de flujo (BD Accuri C6)

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Se sembraron células BV-2 en una placa de 6-pocillos. Se retiró el medio y se añadió rápidamente a cada pocillo 1 ml de glutaraldehído al 2,5 por ciento. Luego, las células se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 min. Las células se fijaron durante la noche con glutaraldehído al 2,5 por ciento nuevo a 4 grados. Después de la fijación, deshidratación e inclusión, las células se observaron con un microscopio electrónico de transmisión HT7800 (Hitachi, Tokio, Japón).

Análisis de datos bioinformáticos y RNA-seq

ARN total de células BV-2 (n=3/grupo) se extrajeron con el reactivo Trizol (Vazyme Biotech, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del reactivo. Todas las muestras analíticas se enviaron a Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) para realizar el ensayo de secuencia de ARN. Los datos fueron analizados en la plataforma online gratuita de Majorbio Cloud Platform. Los parámetros para el análisis de expresión diferencial fueronP-ajustar <0.05 y |log2FC|Mayor qué o igual a1. Los datos de la secuencia original se han enviado a la base de datos del archivo de lectura de secuencias (SRA) del NCBI.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

El ARN total de las células BV-2 de cada grupo se recolectó con un reactivo de aislamiento RNA-easyTM de 500 μL (Vazyme Biotech, China) y se realizó una reacción de transcripción inversa con FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, China) . Las reacciones se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc se sometió a ensayos qRT-PCR con cebadores específicos y TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). Los cebadores se enumeran en la Tabla S1 (ver archivo adicional 1) y se usó -actina como control interno. Se utilizó el método 2-ΔΔCT para el análisis cuantitativo.

Análisis de Western Blot

Las células BV-2 se lisaron con tampón de lisis RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, China) que contenía cóctel inhibidor de proteasa al 1 por ciento (Thermo Fisher) para obtener la proteína total. Se realizó una SDS-PAGE al 10 por ciento para separar las proteínas, que se transfirieron a membranas NC. Después de bloquear con leche desnatada al 5 %/BSA durante 2 h, las membranas se incubaron con AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), Anticuerpos p-NF-κB (ABclonal) o GAPDH (ABclonal) en TBST al 5 por ciento a 4 grados durante la noche. Las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (ABclonal) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la visualización y la cuantificación se utilizaron el sustrato de transferencia Western ECL de alta firma (Tanon, China), el sistema de imágenes Gel (Tanon, China) y el software ImageJ.

acoplamiento molecular

Los análisis de acoplamiento molecular se realizaron utilizando el software Autodock (Versión 4.2). La afinidad entre ACT y proteínas fue observada por el software AutodockTools. Las estructuras proteicas tridimensionales (3D) de AMPK (PDB ID: 5g5j) y NF-κB (PDB ID: 4q3j) se recuperaron del Protein Data Bank

análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias entre los diferentes grupos se analizaron mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de múltiplo de Tukey.

Resultados

ACT alivió la discinesia y mejoró la función del sistema colinérgico en larvas de pez cebra

Se utilizó un modelo de EA inducido por AlCl3-en larvas de pez cebra para demostrar el efecto de ACT en la EA. En primer lugar, se observó el movimiento de las larvas de pez cebra dentro de los ciclos de luz/oscuridad y se registraron sus rutas de natación (Fig. 1a, 1b). Se calcularon AS y ΔS del movimiento del pez cebra inducido por AlCl3 en el tiempo correspondiente después de la administración. Los resultados mostraron que diferentes dosis de ACT aumentaron efectivamente el AS y el ΔS del pez cebra (Fig. 1c). DRR y RE descubrieron una comparación más intuitiva de ACT y DPZ (Fig. 1d). En consecuencia, ACT alivió la discinesia, exhibiendo efectos similares a los de DPZ. En general, se acepta que el sistema colinérgico juega un papel importante en los procesos de aprendizaje y memoria. Por lo tanto, las actividades de AChE y ChAT se usaron para revelar el efecto de ACT. Exposición a AlCl3 en pez cebra con alteración colinérgica cerebral (Fig. 1e). Fue sobresaliente que el tratamiento con ACT suprimiera la actividad de la AChE. Además, la actividad de ChAT exhibió una disminución después del tratamiento con ACT. En resumen, ACT mostró un profundo impacto en la función del sistema colinérgico en larvas de pez cebra con DA inducida por AlCl3-.

ACT suprimió la polarización M1 y promovió la polarización M2 en células BV-2 inducidas por LPS

Se estudiaron los efectos de ACT en la polarización de la microglíain vitroutilizando células microgliales BV-2. LPS disminuyó significativamente la viabilidad de las células BV-2 después de ser tratadas 24 h. Afortunadamente, ACT aumentó la viabilidad celular de las células BV-2 inducidas por LPS (Fig. 2a). Además, se observó la morfología de las células BV-2. Después de 24 h de estimulación con LPS, mostró que las células BV-2 experimentaron un estado de polarización M1. Y los cambios morfológicos fueron prevenidos por el tratamiento conjunto con ACT (Fig. 2b). Además, los resultados indicaron que, a diferencia de las células BV-2 estimuladas por LPS, las células BV-2 cotratadas con ACT mostraron una supresión significativa de TNF- (Fig. 2c), IL-1 ( Fig. 2d) y expresiones de NO (Fig. 2f) en el sobrenadante celular. Estas son citocinas proinflamatorias clásicas como indicadores de la polarización de la microglía M1. Similar a los resultados de ELISA, los resultados de qPCR descubrieron que las expresiones de ARNm de TNF-, óxido nítrico sintasa (iNOS), IL-1 y CD86 eran significativas.cantly inhibido por el tratamiento ACT en comparación con el grupo LPS (Fig. 3a). Además, medimos los niveles de polarización de la microglía M2 mediante ELISA (Fig. 2e) y qPCR (Fig. 3b), cuyos resultados indicaron que ACT aumentó significativamente los niveles de expresión de marcadores relacionados con la microglía M2 (IL-10, CD206 , TGF- y Arg-1). En conjunto, estos resultados mostraron que ACT suprimió la polarización de la microglía M1 y promovió el fenotipo M2.

ACT reguló la polarización M1/M2 a través de la inhibición de la vía de señalización de NF-κB en células BV-2 inducidas por LPS

El análisis transcriptómico fue realizado por RNA-seq para comprender el mecanismo de ACT en células BV-2 desde un nivel general. PCA ilustró que los grupos de control, LPS y ACT podrían distinguirse bien (Fig. 4a). Reveló 899 genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) entre el grupo de control y el grupo LPS, mientras que 49 DEG estaban entre el grupo LPS y el grupo ACT (Fig. 4b). Consistentemente, el análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) (Fig. 4c) y el análisis de enriquecimiento de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Fig. 4d) descubrieron que el efecto de ACT estaba involucrado en la vía de señalización de NF-κB. El conjunto de genes asociados con la vía de señalización de NF-κB se confirmó aún más y su homeostasis ciertamente se vio afectada por LPS. Como era de esperar, ACT afectó significativamente sus expresiones (Fig. 4e). Una vía de señalización de NF-κB es una vía clásica para regular la progresión de la inflamación, lo que finalmente da como resultado la liberación de factores proinflamatorios. Para obtener apoyo mecánico, se evaluó una proteína clave de la vía de señalización de NF-κB mediante análisis de transferencia Western. La estimulación con LPS condujo a la activación de NF-κB, asociada con la promoción de la polarización M1. De acuerdo con el análisis de RNA-seq, ACT inhibió la fosforilación de NF-κB estimulada por LPS (Fig. 4f). Por lo tanto, ACT alivió la polarización M1 inducida por LPS a través de la vía de señalización NF-κB en células BV-2.

ACT deterioró la biosíntesis de arginina, así como la biosíntesis de pantotenato y CoA en células BV inducidas por LPS-2

RNA-seq demostró que las vías afectadas por ACT también incluían la biosíntesis de arginina (Arg), así como la biosíntesis de pantotenato y CoA (Fig. 4d). Y se ha sugerido que la estimulación con LPS causa trastornos del metabolismo de las células BV-2 asociados con la polarización M1[14]. Por lo tanto, se usó un metaboloma celular no dirigido por HPLC-Q-TOF-MS para identificar el efecto de ACT en el metabolismo celular. PCA (Fig. 5a) y PLS-DA (Fig. 5b) ilustraron que los grupos de control, LPS y ACT podrían distinguirse bien en función de los metabolitos intracelulares. Los niveles de varios metabolitos en las células BV-2 inducidas por LPS cambiaron después del tratamiento con ACT (Fig. 5c). En comparación con el grupo de control, hubo 11 metabolitos que cambiaron significativamente en el grupo LPS (Tabla S2, consulte el Anexo 2 adicional). Mientras que 14 metabolitos se alteraron claramente después del tratamiento con ACT (Tabla S3, ver Anexo 3), que involucran 11 vías metabólicas (Fig. 5d). El efecto de ACT consistió principalmente en regular el metabolismo de aminoácidos (biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano, metabolismo de D-Glutamina y D-glutamato, biosíntesis de Arg, metabolismo de fenilalanina), metabolismo de nucleótidos (metabolismo de purinas, metabolismo de pirimidinas), metabolismo energético (metabolismo de nitrógeno metabolismo), así como el metabolismo de cofactores y vitaminas (biosíntesis de pantotenato y CoA). Curiosamente, las vías metabólicas obtenidas por el metaboloma fueron consistentes con RNA-seq, incluida la biosíntesis de Arg, así como la biosíntesis de pantotenato y CoA. Lo anterior mostró que ACT podría regular la biosíntesis de Arg, así como la biosíntesis de pantotenato y CoA en células BV-2 estimuladas con LPS.

Ley mitigada Bv inducida por Lps-2 Disfunción mitocondrial

Las mitocondrias son el núcleo de las vías metabólicas. La evidencia está evolucionando de que las mitocondrias son actores clave en la polarización microglial M1/M2. Investigaciones anteriores demostraron que el LPS podría causar disfunción mitocondrial. TEM juzgó una descripción general del estado de las mitocondrias en morfología y distribución celular. Después de la estimulación con LPS, las células BV-2 mostraron condensación de cromatina en el núcleo, disminución del citoplasma y menos mitocondrias (Fig. 6a). Además, las crestas mitocondriales del grupo LPS estaban desordenadas o incluso desaparecidas, exhibiendo cristolisis parcial, tamaño reducido y morfología de forma redonda. Curiosamente, el tratamiento con ACT podría aliviar los cambios morfológicos inducidos por LPS en las mitocondrias. Por turnos, examinamos la función de las mitocondrias de las células BV-2 tratadas con LPS, incluidas las MMP y la producción de ATP mitocondrial. La producción de MMP (Fig. 6b, 6c) y ATP en las mitocondrias (Fig. 6d) mejoraron significativamente en las células tratadas con ACT en comparación con las del grupo LPS. La disfunción mitocondrial puede estar relacionada con el aumento del nivel de ROS en la célula. El análisis de citometría de flujo reveló que los contenidos de ROS estaban sobrecargados en el grupo LPS (Fig. 6e, 6f). Afortunadamente, ACT eliminó el exceso de ROS. Sugiere que ACT puede restaurar la función de las mitocondrias al eliminar las ROS.

ACT restauró la función de las mitocondrias a través de la regulación positiva de PGC-1 y UCP-2

El coactivador del receptor activado por la proliferación de peroxisomas-1 (PGC-1 ) desempeña un papel importante en la biogénesis mitocondrial[15]. La estimulación de LPS disminuyó la expresión de PGC-1, exhibiendo disfunción mitocondrial. Sorprendentemente, el ARNm del gen PGC-1 y la expresión de proteínas se revirtieron significativamente mediante el tratamiento con ACT en células BV-2 tratadas con LPS (Fig. 7a). También se sabía que la proteína de desacoplamiento mitocondrial-2 (UCP-2) regulaba las funciones mitocondriales. Como proteína corriente abajo de PGC-1 , puede controlar la despolarización de MMP inducida por LPS y la producción de ROS. Informes recientes indican que es fundamental para el proceso de activación microglial, con regulación opuesta de polarización M1 y M2[16]. Los resultados de Western blot mostraron que el nivel de proteína UCP-2 disminuyó después de la estimulación con LPS. El tratamiento conjunto de LPS y ACT podría aumentar la expresión de UCP-2 en comparación con el tratamiento con LPS. El nivel de expresión de ARNm de UCP-2 también mostró cambios similares (Fig. 7b). En conjunto, ACT restauró la función mitocondrial a través de la regulación positiva de PGC-1 y UCP-2.

ACT reprimió la polarización de la microglía M1 a través de la recuperación de la función mitocondrial a través de la activación de AMPK

La proteína quinasa activada por AMP (AMPK), como sensor de energía celular clave, juega un papel importante en el mantenimiento del equilibrio del metabolismo celular. Al mismo tiempo, PGC-1 es una proteína corriente abajo de AMPK. Los resultados revelaron que el LPS inhibía la activación de AMPK, lo que provocaba trastornos del metabolismo celular y disfunción mitocondrial. Es digno de mención que ACT podría aumentar de forma dependiente de la dosis la expresión proteica de p-AMPK (Fig. 8a). Se sugiere que ACT podría aumentar la expresión de PGC-1 y restaurar la función mitocondrial al activar la vía de señalización de AMPK. En este estudio, para investigar si la activación de AMPK contribuía al efecto de regulación de ACT sobre la polarización M1/M2, se empleó el compuesto C (CC) para inhibir el efecto de AMPK. En contraste con el nivel de NO regulado a la baja en el grupo de tratamiento con ACT, CC bloqueó parcialmente el efecto de ACT en el nivel de NO (Fig. 8d). Según estos resultados, ACT podría regular la polarización M1/M2 de las células BV-2 mediante la activación de AMPK.

ACT se une e inhibe NF-κB, así como AMPK activado

Se aplicó acoplamiento molecular para confirmar si ACT se une a las proteínas NF-κB y AMPK. Los hallazgos demostraron que la energía de unión de ACT y NF-κB fue de -8,4 kcal/mol, mientras que la de ACT y AMPK fue de -10,8 kcal/mol. Afinidades significativas verificaron que ACT está directamente unido a NF-κB y AMPK (Fig. 9). Posteriormente, se exploraron más los posibles modos de unión e interacciones dentro del bolsillo de aminoácidos, incluidos Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 y Tyr A227 de NF -κB (Fig. 9c), así como Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 y Thr A224 de AMPK (Fig. 9f). Estos resultados indicaron que ACT podría afectar directamente a NF-κB y AMPK para atenuar la polarización M1 de la microglía BV-2 y promover el fenotipo M2.