La vacuna contra el adenovirus que contiene la subunidad S1 de la proteína de pico truncada del SARS-CoV-2 conduce a una respuesta inmunitaria específica en ratones

ResumenConnecticut:El desarrollo de una vacuna eficaz y segura contra la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es un enfoque crucial para gestionar la pandemia de enfermedad respiratoria aguda grave por coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a la luz de las condiciones actuales. En este estudio, produjimos un segmento acortado del gen de pico optimizado del SARS-CoV-2 (2043 pb, denominado S1) que podía codificar una proteína S1 truncada. La proteína se probó para determinar si podía provocar una inmunización eficaz en ratones contra el SARS-CoV-2. La presencia de la proteína S1 se confirmó con inmunofluorescencia y transferencia Western. Se administró por vía intramuscular a ratones una vacuna de adenovirus que llevaba el fragmento del gen S1 (Ad-S1) cuatro veces durante 4 semanas. La inmunidad humoral de la proteína S1 del SARS-CoV-2 se demostró en todos los ratones inmunizados. El suero de ratones inmunizados demostró una excelente actividad antiinfecciosa in vitro. Se observó una sólida respuesta inmune humoral contra el SARS-CoV-2 en los ratones después de la vacunación con Ad-S1, lo que sugiere que la vacuna de adenovirus puede ayudar al desarrollo de vacunas contra el SARS-CoV-2 y otras vacunas genéticamente distintas. virus.

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Palabras clave: SARS-CoV-2; vacunas; vector adenoviral; gen S1; inmunidad

1. Introducción

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) se asocia a menudo con insuficiencia orgánica múltiple y altas tasas de mortalidad [1] y representa una gran amenaza para la seguridad pública en todo el mundo. Al 15 de julio de 2022, la pandemia de COVID-19 ha persistido en todo el mundo, con 557.917.904 casos confirmados, incluidas 6.358.899 muertes, notificadas a la Organización Mundial de la Salud (OMS). Además, hasta el 11 de julio de 2022 se han administrado un total de 12.130.881.147 dosis de vacuna. Por lo tanto, el diseño y desarrollo de vacunas contra el nuevo coronavirus (nCoV) es de gran importancia y una de las principales prioridades de salud mundial. La proteína S es un factor clave en la entrada del coronavirus 2, enfermedad respiratoria aguda grave del SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) en las células huésped [2,3]. La proteína se une al receptor del huésped y permite que el virus ingrese a la célula huésped sin problemas [4]. Los glicanos unidos a N sobresalen de la superficie del trímero y decoran ampliamente la proteína S, afectando el plegamiento de la proteína S, la inmunidad humoral y el procesamiento de proteasas de la célula huésped [5]. La proteína S del SARS-CoV-2 tiene una menor densidad de glucanos ligados a N que otras proteínas S inducidas por coronavirus patógenos humanos [6]. Por lo tanto, la proteína S puede ser altamente inmunogénica y es un objetivo importante de los anticuerpos neutralizantes. La proteína S tiene tres dominios estructurales, entre los cuales el dominio S1 es el antígeno de superficie de la proteína S más importante [4]. Debido a la dificultad de producir proteínas recombinantes grandes (el dominio extracelular de la proteína S tiene aproximadamente 1300 aminoácidos) y el riesgo de mejora de la infección dependiente de anticuerpos (ADE), S1 (aproximadamente 700 aminoácidos) y su dominio de unión al receptor (RBD, alrededor de 200 aminoácidos) se consideran ampliamente como los objetivos potenciales más atractivos para una vacuna contra el coronavirus [7,8]. El adenovirus humano serotipo 5 (HAdV-C5) se utiliza ampliamente en virología básica como vector de terapia génica y administración de vacunas [9]. HAdV-C5 tiene diversidad natural y puede parasitar a la mayoría de los huéspedes, lo que constituye la base para el desarrollo de experimentos con animales. Los vectores de adenovirus recombinantes con replicabilidad y defectos de replicación construidos a partir de HAdV-C5 se han utilizado ampliamente en la administración de vacunas y la terapia génica [9,10]. Actualmente, los adenovirus han sido aprobados como vacunas contra las infecciones respiratorias agudas y se han realizado muchos ensayos de dichas vacunas, como las de la malaria y el VIH-1 [9]. En este artículo, describimos una vacuna de vector de adenovirus con replicación deficiente humana del SARS-CoV-2 y su preparación y aplicación. En este estudio, la vacuna de adenovirus se construyó de la siguiente manera: el vector fue adenovirus humano con replicación defectuosa HAdV-C5 con deleción E1 y E3, el plásmido esquelético fue adenovirus recombinante con pBHGlox∆E1,3Cre, la línea celular empaquetadora fue células HEK293, y el gen diana era el gen de la proteína S1 truncada del SARS-CoV-2. La expresión de la proteína S1 en la vacuna se identificó mediante ensayos de inmunofluorescencia y transferencia Western. Para determinar la calidad de las respuestas inmunes inducidas por las vacunas candidatas basadas en picos, se examinó en detalle la respuesta de anticuerpos posterior a la vacunación. El beneficio inmunológico de la vacuna se evaluó con una prueba de anticuerpos de unión (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA]) y una prueba de anticuerpos de neutralización. Nuestros hallazgos proporcionan la base para el desarrollo y evaluación de vacunas y tratamientos contra la COVID-19 basados ​​en la proteína S1.

2. Materiales y Método

2.1. Células y animales

En este estudio se utilizaron líneas celulares de riñón de mono HEK293 y Vero E6. Ambas líneas celulares se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina y estreptomicina a 37 ◦C con 5% de CO2 y humedad saturada. Se compraron veinte ratones hembra C57BL/6 (6 a 8 semanas) en el Centro Experimental con Animales de Zhejiang, provincia de Zhejiang. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos con 10 ratones en cada grupo. Un grupo fue inmunizado (inyección intraperitoneal de 100 µL) con un vector Ad5 que expresa la proteína de pico del SARS-CoV-2 (Ad5-S) y el otro con PBS (inyección intraperitoneal de 100 µL) como control. La cantidad total de virus fue de 5 × 109 VP. Todos los ratones fueron inmunizados con inyección intramuscular D0/D14 [11,12]. En D14, se tomaron 100 µl de sangre periférica, se separó el suero y se administró la segunda inyección dos horas después de la extracción de sangre. En D28, se recogió sangre mediante punción retroorbitaria y se separó el suero. Los anticuerpos de unión se detectaron 3 días después de cada extracción de sangre, los anticuerpos neutralizantes se detectaron 7 días después de cada extracción de sangre y las citocinas se detectaron 7 días después de la segunda extracción de sangre. Todos los ratones fueron sacrificados; Todas las pruebas se realizaron en estricta conformidad con las "Directrices para el cuidado y uso de animales de experimentación de la República Popular China" y fueron aprobadas por el Consejo Ético de la Universidad Shuren de Zhejiang.

2.2. Vacunas

Todas las cepas de SARS-CoV-2 utilizadas en este estudio se obtuvieron de pacientes con COVID-19 con su consentimiento. El Laboratorio Estatal Clave para el Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Infecciosas desarrolló una vacuna de adenovirus (célula Vero, cepa WuHan, número GISAID: EPI_ISL_415711) contra el SARS-CoV-2 y luego la La vacuna se fabricó en un entorno que cumplía con el nivel de bioseguridad (BSL). La especificación de la vacuna es de 0.5 ml/dosis y contiene Tris, NaCl, azúcar de caña, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, etanol absoluto y la proteína S1 del SARS-CoV-2.

2.3. Construcción de adenovirus recombinante

La secuencia de la proteína S1 del SARS-CoV-2 (n.º QRU91950.1) se obtuvo de PubMed. De acuerdo con la degeneración genética, la secuencia de nucleótidos de codón optimizada adecuada para la expresión de células de mamíferos se diseñó basándose en la premisa de que la secuencia de aminoácidos de la proteína producto codificada por la proteína S1 del SARS-CoV-2 permaneció sin cambios. La longitud total fue de 2043 pb. La secuencia precursora 50 se sintetizó con activador del plasminógeno tisular (tPA) y se ligaron la secuencia que codifica el aminoácido 2–688 S1 del SARS-CoV-2 y la secuencia precursora de tPA. Se agregaron una secuencia de Kozak y un sitio de restricción SpeI delante del codón de inicio y el sitio de restricción XbaI se agregó después del codón de terminación. Sangon Biotech sintetizó y clonó las secuencias de nucleótidos de los genes anteriores en pUC18 para obtener el plásmido clonado del gen sintético. La secuencia del gen S1 sintetizado y el vector pDC316 se digirieron con endonucleasas de restricción SpeI y XbaI. El fragmento diana y el vector se recuperaron del gel y se conectaron para formar un plásmido lanzadera. El plásmido lanzadera SARS-CoV-2 se empaquetó con el plásmido esquelético del sistema de adenovirus AdMax pBHGloxd∆E1 y 3Cre mediante cotransfección de células HEK293. La solución de virus primario se obtuvo después de repetidas congelaciones, descongelaciones y centrifugaciones, y el virus se amplificó y cultivó después de la purificación en placa.

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2.4. Determinación del título de adenovirus

Se seleccionaron células HEK293 en buen estado de salud y se resuspendieron para preparar una suspensión celular de 5,0 × 105 células/ml, que se sembró en una placa de 24-pocillos (1 ml/pocillo). ) y cultivado a 37 ◦C en un ambiente con 5% de CO2. La muestra se diluyó en serie diez veces y se inoculó una muestra diluida (0.1 ml) de 10-5 a 10-8 células en una placa de 24-pocillos. . Luego, las placas se expusieron a infección a 37 ◦C con 5% de CO2 durante 48 h. Posteriormente se eliminó el medio de cultivo, se añadió metanol preenfriado (0,5 ml) y las muestras se fijaron a −20 ◦C durante 20 min. Después de la fijación, las muestras se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquearon con albúmina sérica bovina al 1% (BSA, 0,2 ml) a 37 ◦C durante 1 h. A continuación, se agregaron los anticuerpos primarios (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) y secundarios (Goat pAb to MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) y se incubaron durante 1 h, durante la cual PBS se utilizaba para lavar. Después de la incubación, se añadió una solución de trabajo recién preparada (0,2 ml) y se incubó durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, se descartó la solución de trabajo, las muestras se lavaron con PBS y se añadió nuevamente PBS (1 ml). Se calculó el número promedio de células positivas en el campo microscópico (cat. CKX53, microscopio de sistema invertido de investigación OLYMPUS), donde se seleccionó un gradiente con 5 a 50 células positivas en el campo de visión y se seleccionaron aleatoriamente al menos cinco áreas para el recuento. . Se calculó el número de campos visuales en cada pocillo de la 24-placa de pocillos. Luego, se calculó el título de virus según la siguiente Fórmula (1):

2.5. PCR en tiempo real

Para detectar la expresión del ARNm de las células HEK293 después de una infección viral, extrajimos el ARN intermedio de acuerdo con las instrucciones operativas de TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). El ARN total se extrajo usando TRIzol y se procesó con ADNasa I libre de ARNasa RQ1 (Promega, Madison, WI, EE. UU.) para eliminar el ADN residual. El ADN complementario (ADNc) se obtuvo mediante transcripción inversa del ARN extraído utilizando un kit de reactivos PrimerScript™ RT con un kit de borrador de ADNg (Takara, Kusatsu, Japón). Se generaron fragmentos de ADN con los cebadores específicos P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) y P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​del gen diana (S1). El gen se amplificó con los cebadores P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30) y P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) como control interno (GAPHD).

2.6. Transferencia occidental

El lisado celular y el sobrenadante se separaron con electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y luego se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Las transferencias se visualizaron con un equipo de imágenes de transferencia Western (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Brevemente, las membranas se transfirieron a TBST (50 ml de Tris-HCl, pH 7,5, 8 g de NaCl [0.5 ml], 0.2 g de KCl, 0,5 ml de Tween -20) con leche en polvo desnatada al 5% y se agitó en un agitador decolorante a temperatura ambiente durante 1 h. Las membranas de los grupos experimental y de control se retiraron de la solución selladora y se incubaron con el anticuerpo primario: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, cat. #40591- T62, Sino Biological, Beijing, China)] a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se agitaron y se incubaron durante la noche en un agitador decolorante a 4 ◦C. La transferencia se enjuagó con solución TBST y se incubó durante 2 h con el anticuerpo secundario [inmunoglobulina G (IgG) H&L (HRP) anti-conejo de cabra (1:10,000, cat. #ab6721, Abcam, Cambridge, Reino Unido)]. Después del enjuague, las transferencias se incubaron durante 1 minuto con un kit de solución de sustrato LumiBest ECL (n.º de catálogo 4AW011-100, 4A Biotech) y luego se observaron en un generador de imágenes.

2.7. Ensayo de inmunofluorescencia

Se sembraron células HEK293 (3 × 106/pocillo) en placas de 12-pocillos. Después de 48 h, las células se infectaron con adenovirus que contenían el gen S1 (Ad-S1). Después de 48 h, se aspiró el medio y las células se lavaron una vez con PBS que contenía BSA al 2% y se fijaron durante 15 minutos con metanol que se había enfriado previamente durante 15 minutos a -20 ◦C. Después de tres lavados con BSA al 2% en PBS, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 10 min. Luego, las células se bloquearon durante 1 h con 2 ml de BSA al 2%, se descartó la solución de bloqueo y las células se lavaron tres veces con PBS. Posteriormente, se agregaron 2 ml de anticuerpo primario [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] a cada pocillo y Se incuba a temperatura ambiente durante 1 h o 4 ◦C durante la noche. Luego, la muestra se enjuagó tres veces con BSA al 2% durante 5 minutos por enjuague. A continuación, se agregaron 2 ml de anticuerpo secundario [IgG H&L anti-conejo de cabra (Alexa Fluor 488) (1:1000, n.º de catálogo 550037, ZenBio)] a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente, las muestras se enjuagaron tres veces con BSA al 2% durante 5 min por enjuague. Se añadió a cada pocillo una solución de 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, cat. n.º S0001, Bioss, Woburn, MA, EE. UU.) y reaccionó durante 10 min en la oscuridad. El análisis se observó con un sistema de imágenes EVOS™ M7000 (n.º de catálogo AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

La proteína S del SARS-CoV-2 (1 µg/mL) se recubrió durante la noche en 96-placas de pocillos (100 µL/pocillo) con 0. 0Tampón de bicarbonato 5 M. Después de lavar con PBST (0.2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 ml de Tween-20, agregue agua a 1000 ml) cinco veces, se añadió solución bloqueadora y se incubó a 37 ◦C durante 1 h. La muestra de suero se diluyó y se añadió a cada pocillo (100 µl/pocillo). Después de 1 h de incubación a 37 ◦C, las muestras se lavaron con PBST cinco veces. Se añadió el anticuerpo primario [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] y se incubó durante 1 h, luego las muestras se lavaron cinco veces con PBST, seguido de 1 h de incubación a 37 ◦C con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante [IgG H&L anti-conejo de cabra (HRP) (1:10,000, cat. #ab6721, abcam)] y cinco se lava con PBST. Después de agregar anhídrido de 3, 30, 5 y 50-tetrametilbifenilo durante 5 minutos, la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 M. La densidad óptica se midió a 450 nm y 630 nm mediante un instrumento de marcado enzimático (Molecular Devices, SpectraMax 190) y luego se ajustó a una curva estándar.

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2.9. Determinación de citocinas 

La placa (n.º de cat. T-k15048D-1, MSD) se lavó tres veces con 150 µl/pocillo de tampón de lavado y se añadieron 50 µl de muestra preparada a cada pocillo. Luego, la placa se selló con un sello adhesivo para placa y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante 2 h. A continuación, la placa se lavó tres veces con 150 µl/pocillo de tampón de lavado y se añadieron 25 µl de solución de anticuerpo de detección a cada pocillo. La placa se selló nuevamente y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante 2 h. A continuación, la placa se lavó tres veces con al menos 150 µl/pocillo de tampón de lavado; Se añadieron 150 µl de tampón de lectura T (MSD) 2X a cada pocillo y la placa se analizó en un instrumento MSD.

2.10. Anticuerpo neutralizante

2.10.1. Ensayo de neutralización de pseudovirus

La actividad de neutralización del suero de ratón se probó utilizando un sistema pseudoviral del virus de la estomatitis vesicular (VSV). El suero se inactivó en un baño de agua durante {{0}}.5 h a 56 ◦C, y luego se diluyó en serie hasta el rango requerido. Se sembraron células HEK293 en una placa de pocillos 96-. El suero diluido se mezcló con 200 DICC50 (la dosis de virus que puede infectar el 50% del cultivo celular)/100 µL de la suspensión del virus en una proporción de 1:1 y se colocó en una incubadora de CO2 (37 ± 1 ◦C) durante 2h. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 µl de solución de mantenimiento de virus que contenía un anticuerpo doble de penicilina-estreptomicina al 0,5 % y la mezcla neutralizada se inoculó en una placa de pocillos 96- que contenía células a razón de 100 µl por pocillo, con dos pocillos repetidos para cada dilución. Al mismo tiempo, se estableció un control celular normal y las células se incubaron en una incubadora de CO2 (37 ± 1 ◦C) durante 96 h. Luego, se diluyeron 200 CCID50/100 µL de solución de virus a 10-1~10-3. Se descartó el medio de cultivo celular en la placa de 96-pocillos, se agregaron 150 µL de la solución de mantenimiento de virus a cada pocillo y la dilución de la solución de virus se inoculó a una concentración de 10-1~{{33} } en los pocillos de la placa de pocillos 96- (50 µl por pocillo). Cada dilución se repitió en 8 pocillos; Al mismo tiempo se estableció un control celular normal, seguido de un cultivo durante 96 h. Los cambios en el CPE celular se observaron bajo un microscopio invertido. El control celular normal no debería tener cambios citopáticos y el control positivo debería tener cambios de CPE. Los puntos finales de neutralización (diluciones séricas convertidas a logaritmos) se calcularon observando el CPE. El criterio seronegativo/positivo fue 1:12 como criterio positivo/negativo,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Ensayo de neutralización en vivo

La actividad de neutralización del suero de ratón se evaluó mediante una prueba de neutralización en vivo. El suero diluido se mezcló con SARS-CoV-2 y se incubó a 37 ◦C durante 1 h. La mezcla se añadió a una placa de pocillos 96- para infectar las células Vero E6. Después de 72- h de incubación a 37 ◦C, se observó el efecto citopático del virus (CPE) con un aumento de ×40 y se calculó el título de neutralización (el recíproco de la dilución de suero al 50 % necesaria para neutralizar la infección por virus). Todos los procedimientos anteriores se llevaron a cabo en un entorno de nivel 3 de bioseguridad.

2.11. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba t de dos muestras utilizando SPSS 26. Los valores de p menores o iguales a 0.05 se consideraron significativos. La tendencia central se midió con el título medio geométrico (GMT).

3. Resultados

3.1. Construcción de adenovirus recombinante

Se obtuvo el plásmido lanzadera de adenovirus recombinante pAdeno-CMV-S1 con inserción correcta; su diagrama de estructura se muestra en la Figura 1. El adenovirus recombinante contenía el genoma HAdV-C5 que carecía de la región E1/E3. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático del vector de adenovirus recombinante obtenido mediante la transfección del plásmido lanzadera y del plásmido del citoesqueleto en células HEK293.

3.2. Caracterización de adenovirus recombinantes

El plásmido recombinante que contiene el gen diana se identificó mediante PCR (consulte la Figura 2A para ver los resultados de la electroforesis en gel). Este fue un experimento repetido. Las secuencias del cebador fueron MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag y S1-R acaataagtagggactgggtc, y la secuenciación confirmó que la secuencia era consistente con el diseño. La expresión de SARS-CoV-2 S1 en las células se detectó mediante transferencia Western (Figura 2B) e inmunofluorescencia indirecta (Figura 2C). La coloración de la banda (~75 kDa) se detectó mediante transferencia Western y fue consistente con la posición esperada de la banda. A nivel transcripcional, la expresión in vitro de S1 se detectó mediante PT-PCR. Los resultados mostraron que la expresión del ARNm de S1 en las células HEK-293 fue significativamente mayor que en el grupo de control.

Figura 1. Construcción de vacuna de adenovirus recombinante y estrategia experimental. (A) pAdeno-CMV-S1 es un plásmido lanzadera de adenovirus recombinante que contiene el gen diana S1. pBHGlox∆E1,3Cre es el plásmido del esqueleto de adenovirus. pBHGlox∆E1,3Cre y pAdeno-CMV-S1 se extrajeron con un kit de extracción de plásmidos QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Beijing, China). Un día antes de la transfección, se pasaron células HEK293 en un matraz de cultivo celular de 25 cm2. El medio de cultivo fue DMEM que contenía FBS al 5% sin antibióticos. El segundo día, se seleccionaron entre el 60% y el 80% de las células y se añadió la solución de transfección a las células. Después de 7 días de transfección, las células se rasparon, se centrifugaron, se descartó el sobrenadante y las células se reanimaron con PBS. Las células se congelaron y descongelaron repetidamente a -80 ◦C y 37 ◦C. Después de la centrifugación, el sobrenadante contenía la solución de virus primario. La cepa de adenovirus recombinante se purificó, amplificó y obtuvo después de un procesamiento adicional y se denominó Ad-S1. La vacuna se inyectó por vía intramuscular a los ratones para realizar estudios de seguimiento. (B) La escala de tiempo representada de inmunización y extracción de sangre.

3.3. Título de adenovirus

En este experimento, se calculó un promedio de seis células positivas en cinco campos microscópicos y el virus en el pocillo se diluyó 108 veces. Según la fórmula descrita en la sección Materiales y Método, el título de adenovirus fue de 4,74 × 1011 unidades formadoras de placas (ufp)/ml (Figura 2D).

3.4. Inmunidad celular posvacunación

Durante el período de prueba, hubo cambios estadísticamente significativos en las citoquinas séricas (p menor o igual a 0.05), lo que mostró principalmente que la concentración de quimioatrayente de queratinocitos/oncogén regulado por el crecimiento humano (KC/GRO) fue disminuyeron y las concentraciones de IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } y TNF- aumentaron, mientras que la concentración de IL-6 no cambió significativamente (Figura 3).

Figura 2. Identificación de la proteína S1 HAdV-C5-SARS-CoV-2 recombinante y determinación del título de adenovirus. (A) Detección por PCR del plásmido recombinante con el gen diana S1. (B) Detección por transferencia Western de SARS-CoV-2. Se infectaron células HEK293 de crecimiento exponencial con SARS-CoV-2 durante 48 h, luego se extrajo la proteína celular y se separó mediante SDS-PAGE. La expresión del SARS-CoV-2 se confirmó mediante transferencia Western con IgG de cabra anti-conejo. (C) Microscopía de inmunofluorescencia de células HEK-293 infectadas con Ad-S1 (verde). Las células se tiñeron con 40, 6-diamidino- 2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos. Barra de escala 1000 µm. (D) Se utilizó un ensayo de placa para la medición. Micrografías que representan las diluciones 10-5, 10-6, 10-7 y 10-8 (de izquierda a derecha).

Figura 3. Niveles plasmáticos alterados inducidos por Ad-S1 de citocinas tipo 1/2, interferones tipo 1 y otras citocinas. Los resultados se detectaron extrayendo sangre de los ratones 7 días después de la primera inmunización. Los datos se presentan como diagramas de dispersión de caja y bigotes. Cada círculo representa a un solo individuo. Los valores p se calcularon utilizando una prueba t de dos muestras.

3.5. Detección de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 S1 después de la inmunización

ELISA reveló que los anticuerpos específicos del SARS-CoV-2- estaban presentes en los ratones inyectados con el primer y segundo Ad-S1, pero no en los inyectados con la cápside de adenovirus de control o la solución de PBS (Ad/PBS) (Figura 4A). Se detectaron títulos de IgG de 1:210 y 1:212 en los ratones vacunados con Ad-S1-dos semanas después de la primera y segunda inmunización, respectivamente. El título de dilución a los 28 días después de la vacunación (D28, GMT 2297,4) fue 6,1-veces mayor que el del día 14 (GMT 378,9).

Figura 4. Ad-S1 indujo títulos elevados de anticuerpos (A) y actividad de neutralización (B, C) en ratones. (A) ELISA de IgG sérica específica de SARS-CoV-2-de ratones inmunizados con Ad-S1-. (B) Análisis de las actividades de pseudovirus del suero de los ratones inmunizados con Ad-S1-. (C) Análisis de las actividades neutralizantes del suero de los ratones inmunizados con Ad-S1-

3.6. Ensayo de anticuerpos neutralizantes

La exposición al SARS-CoV-2 de células Vero E6 permitió la detección de actividad neutralizante en el suero del ratón inmunizado (Figura 4B, C). Los títulos de neutralización D14 y D28 de las células Vero E6 inmunizadas con Ad-S1-contra la exposición a virus vivos del SARS-CoV{{10}} in vitro fueron 1:24,3 y 1:26,3, respectivamente. El ensayo de pseudovirus arrojó resultados similares a los del ensayo de virus vivos, con títulos de neutralización de hasta 1:28,1 y 1:29,6 en D14 y D28, respectivamente. El título neutralizante del pseudovirus D28 (GMT 769,0) fue 2,7-veces mayor que el de D14 (GMT 283,7).

4. Discusión

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 a<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

En este estudio, construimos una vacuna de adenovirus recombinante contra el SARS-CoV-2 que contiene la subunidad S1 del SARS-CoV-2 y la designamos Ad-S1. Al igual que CanSinoBIO, cuya comercialización ha sido aprobada [28], utilizamos HAdV-C5 en esta vacuna. El adenovirus se utiliza ampliamente en la terapia génica recombinante y como vector de vacunas. Sin embargo, la tasa de seropositividad de HAdV-C5 llega al 75-80% en la población normal [29]. Esto implica que la inmunidad previa al almacenamiento contra los vectores HAdV-C5 reduce significativamente la inmunidad inducida por la vacuna. Desarrollado en la Universidad de Oxford en el Reino Unido, ChAdOx1 nCoV-19 utiliza un vector de adenovirus de chimpancé que, por el contrario, tiene una tasa de seropositividad más baja en humanos y, cuando es positivo, generalmente presenta un título de anticuerpos séricos más bajo [30]. . Por lo tanto, se pueden explorar vectores de adenovirus que puedan evadir la inmunidad preexistente para mejorar la eficacia protectora de la vacuna de adenovirus. En el presente estudio, el estado sérico de los ratones antes y después de la inmunización se determinó mediante ELISA y pruebas de neutralización y arrojó evidencia de inmunidad humoral para los candidatos a vacunas. El suero producido después de la inyección intramuscular de la vacuna en ratones protegió eficazmente a las células Vero E6 de la infección por SARS-CoV-2 in vitro (Figura 4). También detectamos una respuesta inmune más fuerte y una mejor protección en los ratones después de una segunda inmunización (Figura 4). Nuestros resultados experimentales son similares a los resultados experimentales convencionales.

A medida que continúa la investigación sobre el SARS-CoV-2, varios estudios han demostrado que la tormenta de citocinas secundaria a la infección por el SARS-CoV-2 puede afectar la producción de células T, lo que dificulta que los pacientes mantengan la inmunidad a largo plazo contra SARS-CoV-2 [31]. Por lo tanto, es necesario determinar si Ad-S1 puede inducir inmunidad mediada por células T en ratones. Nuestros resultados demostraron que las concentraciones de IFN- e IL-12 aumentaron y las concentraciones de IL-4 disminuyeron en el grupo Ad-S1, lo que indica que la vacuna indujo la supervivencia y el crecimiento de las células Th1 en los ratones. La secreción de IL-12, IL-10 y TNF por parte de las células Th1 aumentó ligeramente en el grupo experimental. Estos resultados indicaron que Ad-S1 indujo efectivamente una respuesta de células T sesgada por Th1-en los ratones [32]. El aumento de IL-5 indicó que las células Th2 también participan en la respuesta inmune y producen ciertos efectos. La concentración de KC/GRO en el grupo experimental se redujo significativamente en comparación con la del grupo de control de PBS, lo que podría deberse a la reducción de la quimiotaxis de neutrófilos que suprimió la respuesta inflamatoria y permitió controlar ligeramente los efectos secundarios de la vacuna. Esto sería más beneficioso para las personas inmunodeprimidas, como los ancianos o los pacientes sometidos a quimioterapia. Li M., et al. [29] desarrollaron una vacuna de adenovirus utilizando Ad68 como vector. Los resultados mostraron que la actividad neutralizante in vivo del SARS-CoV-2 se pudo detectar dentro de las dos semanas posteriores a la inmunización intramuscular de ratones BALB/c y luego continuó aumentando, y el título de anticuerpos de neutralización (PRNT ID50) alcanzó 957,3 a las ocho. semanas. Mientras tanto, en el estudio de Liu J., et al. [33], se desarrollaron vacunas que utilizan AdC6 y AdC68 como vectores; Tanto las respuestas de anticuerpos de unión como las de neutralización después de la inmunización se generaron 14 días después de la dosis, con un título de IgG de 7108 (título medio geométrico, GMT; AdC6) y 5489 (GMT, AdC68). El título de neutralización 50 (NT50) del ensayo de neutralización de pseudovirus fue 125 (GMT, AdC6) y 67 (GMT, AdC68).

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En el presente estudio, los ratones vacunados con Ad-S1 tuvieron títulos de IgG de 1:1010 y 1:122 detectados por ELISA dos semanas después de la primera y segunda inmunización, respectivamente. El título de dilución de ad-s1 fue 378,9 (GMT) a los 14 días después de la inoculación y 2297,4 (GMT) a los 28 días después de la inoculación. En la prueba de anticuerpos de neutralización, las células Vero E6 inmunizadas con Ad-S1 mostraron una neutralización de 1:24,3 y 1:26,3 en D14 y D28 contra la exposición al virus vivo SARS-CoV-2 in vitro, respectivamente. Los títulos de neutralización del pseudovirus en D14 y D28 fueron 283,7 (GMT) y 769,0 (GMT), respectivamente. Por tanto, la vacuna de este estudio fue más eficaz en términos de respuesta inmunitaria en el modelo de ratón.

Debido a la limitación de las condiciones experimentales, no realizamos un análisis de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISpot) de las células inmunitarias del bazo de los ratones experimentales. Además, los experimentos de protección contra ataques de SARS-CoV-2 en ratones no se pudieron realizar debido a las limitaciones del laboratorio de protección física. Sin embargo, determinamos que la vacuna tenía una alta eficacia en modelos de ratón y podría usarse como una cepa vacunal de reserva ideal. Además, la inmunogenicidad, la seguridad y la eficacia de las posibles vacunas candidatas contra el SARS-CoV-2 deben examinarse en modelos animales adicionales (p. ej., conejos, primates, mapaches, perros), ya que los modelos de ratón pueden no duplicar completamente los sistemas inmunológicos humanos. características.

planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico

5. Conclusiones

Los datos obtenidos de nuestros estudios preclínicos de la vacuna contra adenovirus demostraron que la vacuna tiene suficiente seguridad y eficacia. Por lo tanto, puede ser una vacuna profiláctica prometedora y factible contra la infección por SARS-CoV-2.

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