esIdioma
Inicio / Conocimiento / Contenido

Conocimiento

Alteraciones en la traducción de proteínas y los procesos catabólicos del ácido carboxílico en la enfermedad renal diabética

Jul 05, 2024

Abstracto: Enfermedad renal diabética (ERD)sigue siendo la principal causa deenfermedad renal terminala pesar de décadas de estudio. Alteraciones en elglomérulo y túbulos renalesambos contribuyen a lapatogenia de la DKDaunque la mayoría de los esfuerzos de investigación se han centrado en el glomérulo. Intentamos examinar la firma de expresión diferencial de la DKD humana en el glomérulo y el túbulo proximal y corroborar nuestros hallazgos en el modelo de diabetes en ratón db/db. Un análisis de red de transcriptograma de datos de RNAseq de glomérulo humano microdiseccionado con láser (LMD) y túbulo proximal de DKD ynefrectomía de referenciaLas muestras revelaron vías enriquecidas que incluyen receptores similares a la rodopsina, señalización olfativa y ribosomas (traducción de proteínas) en el túbulo proximal de muestras de biopsia de DKD humana. La vía de traducción también se enriqueció en el glomérulo. Mayor traducción enriñón diabéticos se validó utilizando perfiles polirribosomales en el modelo de diabetes en ratón db/db. Utilizando la secuenciación de ARN nuclear único (RNA-Seq) de riñones de ratones db/db, priorizamos vías adicionales identificadas en la DKD humana. La vía superpuesta superior identificada en los grupos de túbulos proximales de snRNAseq murino y el túbulo proximal de LMD humanocompartimento fue el catabolismo del ácido carboxílico. Utilizando cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas, también se descubrió que la vía del catabolismo de los ácidos grasos estaba desregulada en el modelo de ratón db/db. El metabolito acetil-CoA se reguló negativamente en ratones db/db, alineándose con la expresión diferencial humana de los genes ACOX1 y ACACB. En resumen, nuestros hallazgos demuestran que las alteraciones tubulares proximales en la traducción de proteínas ycatabolismo del ácido carboxílicoson características clave tanto en el ser humano como en elDKD murino. 



Palabras clave:firma de expresión genética; secuenciación de ARN nuclear único;metabolómica; perfil ribosómico

1

NUEVAS HIERBAS PARARIÑON DIABÉTICO


1. Introducción

La diabetes mellitus (DM) afecta a más de 400 millones de personas en todo el mundo [1] y a más de 30 millones en los EE. UU. [2]. La enfermedad renal diabética (DKD) es una de las complicaciones más graves de la DM, afecta a 19 millones de personas en los Estados Unidos [3] y es la principal causa deenfermedad renal terminal(ERT) [4]. La DKD se considera clásicamente una enfermedad glomerular; sin embargo, centrarse únicamente en la patología glomerular como el sitio principal de la lesión pasa por alto alteraciones biológicas clave en el compartimento tubulointersticial que contribuyen a la fisiopatología de la ERD [5]. De hecho, el pronóstico y la progresión de la DKD frecuentemente son paralelos a la atrofia tubular y la extensión de la enfermedad intersticial [6,7]. Más relevante en este punto es la evidencia de que apuntar al túbulo proximal con inhibidores de SGLT2 ralentiza la progresión de la ERD [8].

Es cierto que los mecanismos celulares que conducen al desarrollo y progresión de la ERD son complejos. El entorno diabético se caracteriza por anomalías metabólicas, inflamación, estrés oxidativo y alteraciones en la homeostasis de las proteínas. Todos estos trastornos contribuyen al estrés celular y al desarrollo de la ERD. Cada vez hay más pruebas de que la traducción alterada, el paso fundamental en la expresión genética que crea proteínas funcionales, es importante tanto para responder como para contribuir al estrés celular [9,10]. Las alteraciones en la traducción contribuyen a desequilibrios en la homeostasis de las proteínas y afectan la salud y las enfermedades humanas [11-14].

El interrogatorio de muestras de biopsia de riñón humano utiliza de forma rutinaria microscopía óptica, microscopía electrónica de transmisión e inmunorreacciones para permitir al patólogo realizar un diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, estas herramientas de diagnóstico tienen limitaciones a la hora de descubrir los mecanismos moleculares subyacentes a la enfermedad renal, incluida la EDR. En consecuencia, históricamente se han utilizado modelos animales de DM para estudiar los mecanismos fisiopatológicos de la ERD; sin embargo, ninguno de estos modelos simula adecuadamente la DKD humana [15]. Aunque los esfuerzos recientes para aplicar técnicas de interrogación molecular más avanzadas a muestras de biopsia de riñón humano son alentadores [16], creemos que el uso de modelos animales en paralelo con tejido de riñón humano sigue siendo un enfoque experimental importante para proporcionar información única sobre los fundamentos moleculares de la ERC.

Intentamos examinar la firma de expresión diferencial de la DKD humana en el glomérulo y el túbulo proximal. Nuestra hipótesis es que la firma transcriptómica del túbulo proximal, además de la del glomérulo, también determina los resultados de la DKD. Abordamos esta hipótesis interrogando muestras de biopsia de riñón humano con microdisección láser de regiones glomerulares y tubulares proximales para identificar vías asociadas con la ERD y su progresión. A continuación, se corroboraron vías clave en un modelo de ratón diabético utilizando un enfoque multimodal de secuenciación de ARN nuclear único (RNA-Seq), perfiles polirribosómicos y metabolómica. Además de los trastornos en la traducción de proteínas, nuestros hallazgos respaldan el papel potencial del metabolismo del ácido carboxílico como factor clave en la progresión de la enfermedad renal diabética.

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2. Materiales y métodos

2.1. Sujetos humanos

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana (IRB no. 190657223). Se obtuvieron veintisiete muestras de riñón del Kidney Precision Medicine Project Consortium y de la Biopsy Biobank Cohort of Indiana [17]. Las biopsias de riñón fueron biopsias de indicación de proteinuria o disminución de la función renal en sujetos con diabetes mellitus. Se adquirieron dieciocho muestras de adultos con enfermedad renal diabética y sin una segunda lesión glomerular. Nueve muestras de referencia sin evidencia histológica de DKD se adquirieron de parénquima no neoplásico de muestras de nefrectomía o de donantes fallecidos. Las variables clínicas e histopatológicas se extrajeron de la historia clínica electrónica. La tasa de filtración glomerular estimada (eGFR) inicial se definió como el valor más cercano a la fecha de la biopsia, a menos que una disminución del 20% o más en eGFR precipitara la derivación de la biopsia. En este escenario, se estableció como punto de referencia para los cálculos de progresión una TFGe dentro del año anterior a la biopsia y antes de la disminución del 20%.


2.2. Microdisección láser de tejido renal humano y secuenciación de ARN

Se cortaron criosecciones de 12 µm de espesor a partir de bloques de tejido congelados conservados en un medio de temperatura de corte óptima, se adhirieron a portaobjetos de membrana de sulfuro de polifenileno (PPS) y se procesaron utilizando un protocolo de tinción rápida como se describió anteriormente [18,19]. Se diseccionó un área mínima de 500,000 µm2 para los compartimentos glomerular y tubular proximal utilizando el láser UV pulsado en el Leica LMD6500 y un objetivo de 20 aumentos. El tejido disecado se recogió en un tubo estéril libre de ARNasa que contenía tampón de extracción de ARN y el ARN se aisló de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, ThermoFisher, Waltham, MA, EE. UU.). La calidad del ARN se determinó utilizando un bioanalizador Agilent 2100.

La secuenciación se realizó en el Centro de Genómica Médica de la Universidad de Indiana. El ARN ribosómico se agotó utilizando el protocolo del kit RiboGone-Mammalian (Cat #634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, EE. UU.). Se utilizó el protocolo v2 del kit SMARTer Universal Low Input RNA (Cat #634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) para la síntesis de ADNc y la construcción de bibliotecas. La secuenciación se realizó con una configuración de extremos emparejados de 2 × 75 pb en Illumina HiSeq 4000 usando el kit HiSeq 3000/4000 PE SBS, y los datos secuenciados se asignaron al genoma hg38 usando STAR. Se asignaron lecturas de secuenciación asignadas de forma única a los genes del genoma de referencia hg38 utilizando Rsubread featureCounts [20, 21].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY



2.3. Aprobaciones de estudios con animales

Todos los protocolos para animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad de Indiana y cumplen con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Para la secuenciación masiva de ARN, perfiles polirribosomales y metabolómica, se obtuvieron ratones machos de la cepa C57BL/6J (#000664, control de fondo/ratones C57) y B6.BKS–Leprdb/J (#000697, ratones db) del Laboratorio Jackson ( Bar Harbor, ME, EE. UU.). Los ratones tenían entre 9 y 12 semanas y pesaban ~ 30 g (ratones C57) o 40 a 50 g (ratones db). Se sacrificaron los ratones y se recogieron los riñones (n=4 o 5 por grupo).


2.4. Aislamiento de tejido renal de ratón y secuenciación masiva de ARN

Los riñones se congelaron rápidamente y se extrajo el ARN utilizando un kit QIAGEN RNeasy Plus Midi con una columna de eliminación de ADN genómico. La calidad del ARN se determinó utilizando un bioanalizador Agilent 2100. Para la construcción de la biblioteca se utilizó el kit de preparación de bibliotecas de ARNm trenzado Illumina TruSeq. La secuenciación se realizó con una configuración de extremos emparejados de 2 × 75 pb en Illumina HiSeq 4000 usando el kit HiSeq 3000/4000 PE SBS, y los datos secuenciados se asignaron al genoma mm10 usando STAR. Se asignaron lecturas de secuenciación mapeadas de forma única a los genes del genoma de referencia mm10 utilizando la función Rsubread Counts.



2.5. Aislamiento de tejido renal de ratón y secuenciación de ARN nuclear único

Se evaluaron ratones de 5, 8, 11, 16 y 20 semanas (n=5 en total, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Se utilizaron heterocigotos de la misma cepa como controles de fondo (n=3). La albúmina en orina se midió con un kit ELISA de albúmina de ratón (Byl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, EE. UU.) y la creatinina en orina se midió con un kit de ensayo de creatinina QuantiChrom (Bioassay System, DICT-500, Hayward , California, EE. UU.). En el hielo, se añadió una porción de cada riñón a 1 ml de tampón de lisis Nuclei EZ suplementado con un 2 % de inhibidor de proteasa (Thermofisher) y un 1 % de superasa (Thermofisher). Después de la trituración, se añadió 1 ml de tampón y el tejido se homogeneizó utilizando el triturador de tejidos KONTES Dounce (Kimble Chase, Rockwood, TN, EE. UU.). El homogeneizado se mezcló suavemente con 2 ml de tampón y se incubó en hielo durante 5 minutos. El homogeneizado se filtró a través de un colador de 40 µm y se trató con tampón de lisis suplementado con 1% de Superbase, luego se filtró nuevamente a través de un30 µm colador, y posteriormente resuspendido en PBS suplementado con 2% de BSA y 1%Superase. Luego esta suspensión se filtró a través de un filtro de 5µm filtro y la concentraciónse ajustó a 1–3 millones de núcleos/ml antes de enviarlo para secuenciación.
La secuenciación del ARN 30 nuclear único se realizó en el Centro de Genómica Médica de la Universidad de Indiana utilizando el sistema unicelular Chromium versión 3 (10× Genomics, San Francisco, CA, EE. UU.) y el Secuenciador NovaSeq6000 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Se utilizó Cell Ranger 4.0 para generar archivos FASTQ específicos de la muestra y las lecturas se alinearon con el genoma de referencia mm10 usando STAR. Se utilizó Seurat v 3.0.1 para integrar muestras utilizando las siguientes métricas de control de calidad: recuentos de genes incluidos entre 200 y 3000 y porcentaje de genes mitocondriales inferiores al 50 %. En total, se retuvieron 58.405 células para análisis posteriores. Se realizaron preprocesamiento estándar, selección de características, reducción de dimensiones (20 componentes principales), identificación de anclajes entre muestras e integración.realizado según los métodos de anclaje Seurat v3.Los grupos se anotaron en función demarcadores de expresión genética comunes [22] y usando Kidney Cell Explorer [23]. 

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY


2.6. Aislamiento de tejidos renales de ratón y perfiles polirribosomales

Se sacrificaron ratones de control de fondo y db a las 9 y 12 semanas de edad. La perfusión cardíaca a través del ventrículo izquierdo se realizó con 6 ml de cicloheximida (100 µg/ml en PBS). Los riñones recolectados se colocaron inmediatamente en un tampón de lisis que consistía en Triton X-100 al 1%, desoxicolato al 0,1%, Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, tableta de cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche, Penzberg). , Alemania), cicloheximida 50 µg/ml y RNAsin (dilución 1:500). Los tejidos se homogeneizaron a 4 ◦C utilizando un homogeneizador de tejidos Precellys (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, Francia). Los homogeneizados de tejido se incubaron en hielo durante 10 minutos y luego se centrifugaron a 9600 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se añadió a la parte superior de un gradiente de sacarosa generado por BioComp Gradient Master (10% de sacarosaencima de 50% de sacarosa en Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl 5 mM2y 50 mg/mlcicloheximida) y se centrifugó a 284,000× g durante 2 h a las 4◦C. Los gradientes fueron cosechados.desde arriba en una cosechadora Biocomp (Biocomp Instruments, Fredericton, NB, Canadá),y el contenido de ARN de las fracciones ribosómicas eluidas se controló continuamente con UVabsorbancia a 254 nm.



2.7. Metabolómica

Para evaluar las firmas metabolómicas, se prepararon muestras de control de fondo y ratones db (n=5 por grupo) utilizando el sistema automatizado MicroLab STAR® (Hamilton Company, Reno, NV, EE. UU.). El análisis metabolómico se realizó en Metabolon Inc. Brevemente, los tejidos renales congelados se procesaron siguiendo el método de extracción estándar de Metabolon según el protocolo de la empresa. Los extractos se analizaron en una cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) Waters ACQUITY con una columna C18 (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1,7 µm) y un sistema Thermo Scientific Q-Exactive de alta resolución/precisión. espectrómetro de masas interconectado con una fuente de ionización por electropulverización calentada (HESI-II) y un analizador de masas Orbitrap operado a una resolución de masa de 35,000.

Los datos sin procesar se extrajeron, se identificaron los picos y se procesaron el control de calidad utilizando el hardware y software de Metabolon (Durham, NC, EE. UU.). Los picos se cuantificaron utilizando el área bajo la curva. Los análisis estadísticos estándar con la prueba t de dos muestras de Welch se realizaron en ArrayStudio en datos transformados logarítmicamente.




2.8. Expresión genética diferencial, análisis de vías y estadísticas

Los datos de expresión de LMD humano y de tejido renal de ratón a partir de la secuenciación de ARN se normalizaron por cuantiles y la expresión diferencial se determinó mediante una prueba exacta en edgeR con valores de p < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos después del error falso de Benjamini-Hochberg. Corrección de pruebas múltiples de tasa de descubrimiento (FDR). Para las muestras de riñón de ratón que se sometieron a secuenciación de ARNsn, la expresión diferencial se determinó mediante una prueba de suma de rangos de Wilcoxon con valores de p ajustados por Bonferroni < 0.05 considerados estadísticamente significativos. Sin embargo, en el manuscrito se proporcionan valores de p sin corregir. Los datos de expresión génica se investigaron en busca de vías enriquecidas en Gene Ontology, Kegg y Reactome utilizando un análisis de red de transcriptograma como se describió anteriormente [19, 24-26]. Brevemente, todos los genes codificadores de proteínas, independientemente del valor p, están ordenados por redes de interacción proteína-proteína. Se utilizó un algoritmo de Monte Carlo para agrupar genes según funciones biológicas compartidas. La significancia se determina utilizando una prueba t de Welch de dos colas después de 500 permutaciones aleatorias para estimar la tasa de descubrimiento falso con valores de p <0,05 considerados estadísticamente significativos. Dado que solo se expresa un subconjunto de genes en una célula determinada para los datos de snRNA-seq, el método del transcriptograma no es factible para este tipo de datos. El análisis de la ruta para snRNA-seq implicó el enriquecimiento de genes expresados ​​diferencialmente en Gene Ontology, Kegg y Reactome según la prueba exacta de Fisher, sin tener en cuenta las interacciones de la red proteína-proteína. Todos los grupos de células tubulares proximales en todos los puntos temporales se fusionaron para identificar genes enriquecidos entre los ratones control y db. El grupo de podocitos individuales también se fusionó en distintos puntos temporales. Este método también se aplicó a los datos de RNA-seq humanos al evaluar la superposición con el conjunto de datos de snRNA-seq. Se utilizaron valores de p corregidos por FDR para las vías para identificar la superposición entre subsegmentos coincidentes. PAM (partición alrededormedoids) se utilizó para agrupar muestras de diabéticos humanos de acuerdo con los genes implicados en cada vía superpuesta. Las características clínicas diferenciales se determinaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon entre grupos agrupados.














También podría gustarte