La transmisión alterada de norepinefrina después de que el aprendizaje espacial afecta la consolidación de la memoria mediada por el sueño en ratas

El uso terapéutico de fármacos noradrenérgicos hace que la evaluación de sus efectos sobre la cognición sea una prioridad. La norepinefrina (NE) es un neuromodulador importante para una variedad de procesos cognitivos y puede contribuir de manera importante a la consolidación de la memoria mediada por el sueño. La transmisión NE fluctúa con el estado conductual y/o cerebral e influye en la actividad neuronal asociada. Aquí, evaluamos los efectos de la transmisión alterada de NE después de conocer una tarea dependiente del hipocampo sobre la actividad neuronal y la memoria espacial en ratas macho adultas.

Cada vez más estudios demuestran que la noradrenalina está estrechamente relacionada con la memoria. La norepinefrina es un neurotransmisor que desempeña funciones importantes en el cuerpo, una de las cuales es promover la formación y el almacenamiento de la memoria.

La función principal de la epinefrina es estimular el sistema nervioso y mejorar la concentración y el estado de alerta. Se trata de características muy relacionadas con la memoria. Cuando nos encontramos en una situación estresante, los niveles de adrenalina aumentan, poniendo al cerebro en un estado de alerta máxima y facilitando el recuerdo de información importante.

Además, la epinefrina puede tener efectos a largo plazo sobre la formación de la memoria. Investigaciones recientes han descubierto que cuando los recuerdos se activan repetidamente, los niveles de epinefrina aumentan, lo que ayuda a mejorar la preservación y la persistencia de la memoria.

Además de los efectos anteriores, la epinefrina también puede afectar la formación y el almacenamiento de recuerdos al afectar la interacción entre las neuronas del cerebro. Este efecto puede promover la formación y preservación de recuerdos al regular la conectividad de las redes neuronales.

En resumen, la epinefrina tiene una relación importante con la memoria. Debemos mantener una actitud positiva y centrarnos en ejercitar nuestro cuerpo y cerebro para aumentar los niveles de adrenalina, mejorando así nuestra memoria y capacidades cognitivas. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino que tiene muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de la carne picada proviene de los diversos ingredientes activos que contiene, incluidos ácidos, polisacáridos, flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de varias maneras.

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Administramos clonidina (0.05 mg/kg, ip; n= 12 ratas) o propranolol (10 mg/kg, ip; n= 11) después de cada una de las siete sesiones de aprendizaje diarias en un 8-laberinto radial del brazo. En comparación con el grupo de solución salina (n= 9), las ratas tratadas con medicamentos mostraron tasas de aprendizaje más bajas. Para evaluar los efectos de los fármacos sobre la actividad cortical y del hipocampo, registramos el EEG prefrontal y los potenciales de campo locales del subcampo CA1 del hipocampo dorsal durante 2 h después de cada sesión de aprendizaje o administración de fármacos. Ambos fármacos redujeron significativamente el número de ondas del hipocampo durante al menos 2 h. Una puntuación del sueño basada en EEG reveló que la clonidina aceleraba el inicio del sueño y prolongaba la vigilia tranquila.

El propranolol aumentó la vigilia activa a expensas del sueño con movimientos oculares no rápidos (NREM). La clonidina redujo la aparición de oscilaciones lentas (SO) y husos del sueño durante el sueño NREM y alteró el acoplamiento temporal entre SO y los husos del sueño. Por tanto, la alteración farmacológica de la transmisión de NE produjo un estado cerebral subóptimo para la consolidación de la memoria. Nuestros resultados sugieren que la NE post-aprendizaje contribuye a la eficiencia de la comunicación hipocámpica-cortical subyacente a la consolidación de la memoria.

El uso clínico de fármacos noradrenérgicos evalúa sus efectos sobre funciones cognitivas de gran importancia1,2. La clonidina y el propranolol se encuentran entre los fármacos más prescritos. La clonidina se utiliza como antihipertensivo y analgésico, pero también se prescribe para la medicación de los trastornos del sueño y, desde hace poco, para el tratamiento del trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y la enfermedad de Parkinson1,3,4. El propranolol se utiliza para el tratamiento de varias afecciones cardiovasculares y de ansiedad5.

A pesar de los obvios beneficios para la salud, la alteración farmacológica de los niveles de norepinefrina (NE) puede, como efecto secundario, perjudicar las capacidades cognitivas de los pacientes. El papel esencial de la transmisión de NE para el procesamiento consciente (o "en línea") de la información está bien establecido2,6, 7. Estudios anteriores han enfatizado la importancia de la NE también durante estados inconscientes (o "buenos") como el sueño8–10, cuando tienen lugar las modificaciones moleculares, sinápticas y de circuitos inducidas por el aprendizaje11. Durante el sueño posterior al aprendizaje, inicialmente, los rastros de memoria lábil se estabilizan mediante la reactivación de representaciones neuronales que codifican la memoria en el hipocampo (HPC) y posteriormente se integran en la neocorteza para su almacenamiento a largo plazo12.

Se ha demostrado que la alternancia farmacológica del nivel de NE después del aprendizaje afectó la consolidación de la memoria en animales13–18 y humanos9,10,19,20. Además, los estudios de farmacología conductual son consistentes con un papel facilitador de la NE para la plasticidad sináptica21-25. A pesar de la amplia evidencia proporcionada por la psicofarmacología sobre el papel de la EN en la codificación y consolidación de la memoria, la dinámica posterior al aprendizaje de la transmisión de la EN no se ha caracterizado sistemáticamente. Estudios recientes que monitorean la liberación de NE con una alta resolución temporal en ratones que se comportan espontáneamente han refinado aún más trabajos anteriores y han propuesto un papel de la liberación de NE para la continuidad del sueño con movimientos oculares no rápidos (NREM) y la consolidación de la memoria mediada por el sueño NREM26,27

Las oscilaciones lentas neocorticales (~1 Hz), los husos del sueño talamocorticales (10-16 Hz) y las ondulaciones del hipocampo (~150 Hz) son las características distintivas del sueño NREM y han sido identificadas como las oscilaciones clave que permiten el sueño a nivel de sistemas dependientes. consolidación de la memoria28. El impacto de la NE en la actividad coordinada temporalmente dentro de una red cortico-hipocámpica que respalda la memoria aún no se comprende suficientemente11. La medición por microdiálisis de la liberación prefrontal de NE en la rata detectó un aumento transitorio ~2 h después de la discriminación de olores, mientras que el bloqueo de los adrenorreceptores prefrontales después del aprendizaje provocó un déficit de memoria29. En el HPC dorsal, se requiere la activación de los adrenorreceptores para la consolidación eficiente de la memoria emocional y espacial30,31. Tanto los receptores 1- como los receptores adrenérgicos participan en la generación de husos del sueño y ondas del hipocampo26,32,33. Anteriormente, hemos documentado una actividad elevada de las neuronas noradrenérgicas del Locus Coeruleus (LC) durante el sueño NREM después del aprendizaje34 y su coordinación disparando con SO35. En nuestro estudio reciente, demostramos que en ratas anestesiadas la activación fásica de LC moduló la dinámica de la población cortical en la escala temporal de un solo ciclo de SO. Finalmente, la alteración de los patrones naturalistas de actividad de LC durante el sueño NREM condujo a un déficit de memoria37,38.

En el presente estudio, vinculamos una deficiencia del aprendizaje espacial con una actividad neuronal alterada dentro de la red que respalda la memoria. Para alterar la transmisión de NE, utilizamos clonidina y propranolol, dos fármacos clínicamente relevantes. La clonidina suprime la activación de las neuronas LC-NE mediante la activación de los 2-adrenoreceptores y reduce la liberación de NE desde las terminales LC39. El propranolol bloquea la transmisión de NE uniéndose a los receptores adrenérgicos y después de un tratamiento repetido a dosis moderadas (< 40 mg/kg) inhibits the LC activity40,41. We report that the alteration of NE transmission during the post-acquisition period impaired spatial learning. The reduction of SO, sleep spindles, and hippocampal ripples together with the appearance of high voltage spike-and-wave patterns (HVS) was indicative of a pharmacologically induced switch to a brain state that was likely suboptimal for memory consolidation. Our results further support the view that NE transmission during NREM sleep importantly contributes to information processing within the thalamocortical and hippocampal-cortical networks, which are thought to mediate systems-level memory consolidation.

Resultados

Los resultados se obtuvieron de ratas Sprague-Dawley macho adultas (300-400 g) (n=38) divididas aleatoriamente en tres condiciones farmacológicas (clonidina, propranolol y solución salina). Las condiciones para cada rata y la inclusión/exclusión de datos se enumeran en la Tabla complementaria S1.

La clonidina y el propranolol después del aprendizaje causan déficit de memoria espacial.

Entrenamos a un total de 32 ratas en una tarea de memoria espacial durante siete sesiones diarias (Fig. 1a; consulte Métodos complementarios para obtener más detalles). A veintiséis ratas se les implantaron electrodos crónicos para monitorear el EEG frontal y los potenciales de campo locales (LFP) en el hipocampo (ver Métodos para más detalles). Otras 6 ratas estaban intactas (no implantadas) pero siguieron el mismo protocolo de entrenamiento/fármaco. Es importante destacar que no hubo diferencias en la tasa de aprendizaje entre las ratas implantadas y no implantadas (Figura complementaria S1). Inmediatamente después de cada sesión de aprendizaje, las ratas recibieron clonidina (0.05 mg/kg, ip; n=12), propranolol (10 mg/kg, ip; n=11 ), o solución salina (1 ml/kg, ip; n=9). En la primera sesión de aprendizaje (libre de drogas), no hubo diferencias entre los grupos en ninguna variable de comportamiento (Tabla complementaria S1). En el curso del aprendizaje, todas las ratas entraron activamente en diferentes brazos del laberinto (Fig. 1b) y recogieron todas las recompensas casi en cada prueba (Fig. 1c); este patrón de comportamiento no indicó diferencias entre grupos en la actividad locomotora general o la motivación alimentaria. La mayoría de las variables de comportamiento reflejaron la dinámica de aprendizaje. La precisión del desempeño de la tarea fue aumentando gradualmente (medidas repetidas ANOVA, F (3.7,106.6)=12.0, p<0.0001; Fig. 1d) with the between-group difference approaching a significance level (F (2,29)=3.33, p=0.05). The overall number of errors was significantly higher in the drug-treated rats (Fig. 1e). There was a significant effect of repetition (F (5,145)=11.0, p<0.001) and between-group difference by the number of errors (F(2,29)=7.34, p=0.003). The post-hoc comparisons confirmed a higher number of errors in the drug-treated groups (clonidine: p=0.031, propranolol: p=0.002; Bonferroni post-hoc comparisons vs. saline). Notably, propranolol-treated rats made the most errors during the first trial (Fig. 1f); the latter was indicative of a memory retrieval defect. To further explore the nature of spatial memory deficit, we split the errors into working memory (WM, re-entering the maze arm within a trial) and reference memory (RM, entering unbaited maze arm) errors. There was a significant between-group difference by both WM (F (2, 29)=8.0, p=0.002) and RM (F (2, 29)=5.0, p=0.014). The posthoc comparisons showed that drug-treated rats committed significantly more RM errors (Fig. 1g). Besides, the propranolol-treated rats also made more WM errors (Fig. 1g). Despite obvious spatial memory deficit at the early stages of learning, all rats reached a similar performance level by the end of the learning period (Fig. 1d,e). The trial time was decreasing (F (3.5, 102.4)=16.1, p<0.0001), yet equally in all groups (time: F (2,29)=0.43, p=656). Finally, we used the K-means cluster analysis to split rats according to their learning speed (see Methods for details). Indeed, individual rats learned the task at different rates (Fig. 1h). Remarkably, the proportion of 'slow' learners was much higher among the drug-treated rats (Fig. 1i).

La clonidina y el propranolol suprimen las ondas del hipocampo.

Evaluamos los efectos de la clonidina y el propranolol sobre las ondas del hipocampo como elementos clave de la consolidación de la memoria12. Un análisis retrospectivo reveló que en 14 de 26 ratas inicialmente implantadas y entrenadas en el laberinto, la detección de ondas no fue fiable debido a diversos fallos técnicos. Por lo tanto, para aumentar el tamaño de la muestra, se registraron el EEG y las LFP del hipocampo de 6 ratas adicionales, que fueron tratadas con medicamentos, pero no probadas en el laberinto (Figura complementaria S1). Por lo tanto, los efectos de los fármacos sobre las ondas del hipocampo se probaron en 24 ratas (clonidina, n=8; propranolol, n=9 y solución salina, n=7; Tabla complementaria S1). Ambos fármacos redujeron significativamente la tasa de ondulación durante al menos 2 h después de la inyección (F(2, 23)=13.27, p=0.0002; Fig. 2a-d). La clasificación del comportamiento de las ratas en vigilia activa (AW), vigilia tranquila (QW) y sueño NREM (ver Métodos para más detalles) reveló que el efecto más pronunciado de ambos fármacos se produjo durante el sueño NREM en comparación con los episodios AW y QW (Tabla 1). Es decir, en comparación con el grupo de solución salina (n=7), el grado de supresión de la onda durante el sueño NREM varió del 40,1% al 91,3% después de la clonidina (n=8) y del 2,3% al 86 ,6% después de la inyección de propranolol (n=9). Aparte de una sorprendente disminución en la tasa de ondulación, no se revelaron efectos del fármaco sobre las propiedades intrínsecas de la ondulación (amplitud: F(2, 23)=1. 12, p=0.34; potencia: F(2, 23)=3.3, p=0.056; frecuencia intrarizado: (F(2, 23){{ 45}}.40,p=0.11), excepto por una duración de onda más larga después de la clonidina (F(2, 23)=11.47, p=0.0004; Fig. 2d-f).

Efectos de la clonidina y el propranolol sobre el estado de comportamiento y las oscilaciones EEG asociadas al sueño. Después de excluir los datos de EEG no válidos (n{{0}} ratas), los análisis basados ​​en EEG se realizaron utilizando un total de 21 conjuntos de datos (clonidina, n=6; propranolol, n{{4} }, y solución salina, n=6; Tabla complementaria S1). Además de los efectos sobre la actividad de la población del hipocampo, ambas drogas afectaron el patrón de comportamiento espontáneo. Hubo una diferencia entre los grupos en el tiempo total dedicado a cada estado de comportamiento (AW: F(2, 20)=4.09, p=0.034; QW:F(2, 20){{ 16}}.84, p=0.021; NREM: F(2, 20)=4.66, p=0.023). Específicamente, durante el período de observación de 2 h posterior a la inyección, la clonidina prolongó la QW mientras que el propranolol prolongó la AW y acortó el sueño NREM (Figura complementaria S2). Ninguna droga afectó la duración promedio de la época en ninguno de los estados de comportamiento (F (2, 20)  2,57, p  0,10 para todos). Un leve efecto sedante de la clonidina se reflejó en un inicio más rápido del sueño (Figura complementaria S2).

Además, el EEG prefrontal se vio afectado de manera específica del fármaco (Fig. 3a-c). Específicamente, la clonidina aumentó la potencia sigma (10–16 Hz) durante AW y QW mientras la reducía durante el sueño NREM (Fig. 3d-f). Además, durante el sueño NREM en ratas tratadas con medicamentos, el delta (< 2 Hz) power was decreased and the power within the 5–7 Hz frequency range was increased due to the appearance of HVS (Fig. 3f). Te observed changes in the EEG power spectrum reflected drug-induced modulation of the oscillatory events like SO and sleep spindles (Figs. 3a–c and 4). In clonidine-treated rats, the SO was less frequent (Table 1) and of smaller amplitude (Supplementary Figure S3). There was no effect on the SO (half-wave) duration (F(2, 20)=2.55, p=0.11). The effect of clonidine on SO was almost immediate and lasted at least for 2 h (Fig. 4d). In clonidine-treated rats, the spindles were more frequent during AW and QW, while their occurrence was decreased during NREM sleep (Table 1). Notably, the effect of clonidine was delayed (Fig. 4h). Te spindle power was significantly decreased by clonidine (Supplementary Figure S3). No change was detected in the spindle length (F(2, 20)=0.08, p=0.92) or the intra-spindle frequency (F(2, 20)=1.09, p=0.36). Te clonidine-induced effects persisted across repeated drug treatments (Supplementary Figure S3). The SO and sleep spindles were unaffected by propranolol (Fig. 4d,h, and Supplementary Figure S3).

A continuación, evaluamos el efecto del fármaco sobre el acoplamiento temporal entre SO y los husos del sueño, un fenómeno bien establecido que se ha sugerido como un mecanismo de coordinación de la red subyacente a la consolidación fina42–44. Con este fin, seleccionamos episodios de sueño NREM y extrajimos los husos que ocurren dentro de ± 1,5 alrededor del pico negativo de SO. En general, aproximadamente 1/3 de los husillos estaban acoplados de manera SO (F(2, 20)=1.03, p=0.38); sin embargo, el huso que se agrupa alrededor del pico negativo SO se dividió entre grupos (Fig. 4i-l). En ratas tratadas con solución salina y propranolol, los husos se produjeron preferentemente a lo largo de la fase ascendente de SO alcanzando el máximo ms después del pico SO negativo, mientras que en las ratas tratadas con clonidina, los husos se agruparon alrededor del pico SO negativo (Fig. 4l).

Finalmente, la administración de clonidina promovió HVS, oscilaciones transitorias de alta amplitud que rara vez ocurren en condiciones libres de medicamentos (Tabla 1 y Figura complementaria S4). El primer HVS apareció tan rápido como 8,4 ± 1,0 min (rango: 5,4 – 11,3 min) después de la inyección de clonidina, que fue mucho antes que después de la solución salina (24,6 ± 2,3 min) (rango: 16,6 – 30,7 min). o propranolol (27,6 ± 6,2 min) (rango: 7,7 – 62,2 min).

Sorprendentemente, en 5 de 6 (83,3%) ratas tratadas con clonidina y en 5 de 9 (55,5%), ratas tratadas con propranolol, los HVS se detectaron durante el estado AW, mientras que los HVS estuvieron ausentes durante el AW en 5 de 6 de solución salina. -ratas tratadas. En ratas tratadas con clonidina, la tasa HVS fue mayor durante la primera hora posterior a la inyección y este efecto se mantuvo a lo largo de los días (Figura complementaria S4). Además, la clonidina aumentó la duración de HVS (Figura complementaria S4) y disminuyó la frecuencia entre HVS (F(2, 20)=7.94, p=0.003). La potencia de HVS no se vio afectada por la clonidina (F(2, 20)=2.28, p=0.13). No hubo efectos detectables del propranolol en el HVS (Figura complementaria S4).

Discusión

En el presente estudio, demostramos que la administración repetida de clonidina (0.05 mg/kg, ip) y propranolol (10 mg/kg, ip) después de la exposición diaria a una tarea de laberinto radial de 8-brazo deterioro de la consolidación de la memoria espacial en ratas macho adultas. La deficiencia de la memoria espacial en las ratas tratadas con fármacos fue evidente en un mayor número de errores en MT y RM. Estudios anteriores señalaron un efecto beneficioso del sueño NREM sobre la MT, posiblemente debido a una mayor actividad SO y a la potenciación de las redes prefrontales-autonómicas45,46. De hecho, la actividad parasimpática aumenta durante el sueño NREM y es probable que promueva la liberación de NE del LC a través de entradas vagales45. Por lo tanto, el acoplamiento color-SO durante el sueño NREM35 podría respaldar el rendimiento de la MT dependiente prefrontal del día siguiente45. Nuestros resultados respaldan indirectamente esta hipótesis, ya que la supresión farmacológica de la actividad LC-NE durante el período posterior al aprendizaje puede haber afectado la función prefrontal que es esencial para la capacidad de la MT. La menor precisión de la memoria espacial que se reflejó en los errores de RM indicó el efecto de las drogas en la comunicación cortical del hipocampo mediada por ondas, un componente clave de la consolidación a nivel de sistemas28. Finalmente, el déficit de memoria más fuerte en las primeras etapas del aprendizaje indicó la importancia de la transmisión de NE para el procesamiento fino de la información recién recibida8-10.

Una tasa de aprendizaje más baja en la mayoría de las ratas tratadas con medicamentos probablemente estuvo relacionada con una actividad cerebral alterada asociada al sueño. De hecho, la alteración farmacológica de la transmisión de NE afectó la dinámica neuronal asociada al sueño dentro de las redes talamocorticales y del hipocampo que están implicadas en la consolidación de la memoria a nivel de sistemas28. Específicamente, ambos fármacos redujeron drásticamente la aparición de ondas del hipocampo, que se cree que median en la estabilización de los conjuntos de células que codifican la memoria12,47. Nuestros resultados mostraron que el mecanismo generador de ondas requiere un nivel óptimo de NE, mientras que tanto la actividad LC-NE mejorada como disminuida es desfavorable para las ondulaciones. Por lo tanto, la supresión de la onda expansiva inducida por las drogas durante el período posterior al aprendizaje podría explicar el déficit de memoria espacial. Este resultado es consistente con un defecto de aprendizaje producido por la supresión de ondulaciones eléctricas48,49. Hasta donde sabemos, los efectos noradrenérgicos sobre las ondas del hipocampo aún no se han caracterizado en animales comportamentales. Además de su efecto sobre las ondas del hipocampo, la clonidina, pero no el propranolol, suprimió el SO y los husos del sueño, lo que concuerda con la literatura existente50,51; también alteró el acoplamiento SO-husillo.

Aunque un período de observación relativamente corto (~2 h) no permitió la caracterización del ciclo de sueño/vigilia, los efectos de los fármacos en el EEG prefrontal fueron en general consistentes con la literatura existente50,51. Observamos efectos específicos de los fármacos sobre el patrón de sueño/vigilia y el espectro de potencia del EEG. Es decir, la clonidina causó una ligera sedación al acelerar el inicio del sueño y prolongar la QW, mientras que el propranolol aumentó la AW a expensas del sueño NREM. Ambos fármacos disminuyeron la potencia del EEG en un rango bajo (<2 Hz) frequency range and increased 5–7 Hz power during NREM sleep due to the appearance of the HVSs; clonidine also reduced the sigma (10–16 Hz) power. The effects of clonidine were overall more pronounced, lasted for at least 2 h, and were consistent across daily injections. Of note, the aforementioned effects were observed during the dark (active) phase of the rat circadian cycle, while the drug-induced effects may differ during the light (inactive) phase as well as during the extended post-administration period.

Estudios farmacológicos anteriores han demostrado repetidamente que la modulación de la transmisión de NE después del aprendizaje afectaba la fuerza de la memoria13–15,18,29,52,53. La mayor actividad de LC-NE durante los estados de vigilancia ha impulsado investigaciones sobre su papel en el procesamiento de información en línea6,7, mientras que el papel de la modulación noradrenérgica de las redes cerebrales durante estados de baja vigilancia, como el sueño, ha permanecido fuera de foco durante mucho tiempo. Varios estudios destacaron la importancia de que la NE actúe a través de los adrenorreceptores30,31 para la consolidación de la memoria dependiente del hipocampo10,37,38,54,55. Está bien establecido que la NE promueve la plasticidad sináptica a largo plazo21–25 que ocurre con frecuencia. En nuestro estudio anterior, informamos que la calma relativa de las neuronas LC-NE durante el sueño NREM fue interrumpida por episodios de actividad transitoria, que era más probable que ocurrieran después del aprendizaje. La alteración optogenética de la actividad LC durante el sueño NREM afectó el desempeño de la rata en una tarea de memoria dependiente del hipocampo. Dos estudios recientes que midieron la liberación de NE cortical demostraron el acoplamiento del huso LC en la escala temporal infralenta.

Además de los aumentos repentinos de actividad noradrenérgica posteriores al aprendizaje29,34, una participación coordinada temporalmente de las neuronas LC-NE puede influir en las redes ofine. Aunque se desconoce el mecanismo exacto que gobierna la dinámica de la actividad de LC durante el sueño, existen relaciones temporales entre el nivel de NE y las oscilaciones asociadas al sueño. La tasa de alimentación de las neuronas LC-NE aumenta durante el sueño y disminuye antes del inicio del huso57. Anteriormente hemos demostrado un acoplamiento temporal entre la activación de la neurona LC-NE y una fase de SO35.

En nuestro estudio reciente en ratas bajo anestesia con uretano, demostramos que la activación fásica de LC prolongaba el estado cortical de excitabilidad mejorada y aumentaba la tasa de activación de las neuronas prefrontales36. Anteriormente informamos que la estimulación eléctrica de LC activada por ondas produjo un defecto de memoria espacial, probablemente debido a la interferencia con el patrón de actividad endógena de LC. En nuestro presente estudio, la supresión de la liberación de NE inducida por clonidina afectó la red de generación del huso y probablemente interrumpió el acoplamiento LC-huso. A pesar del origen cortical del SO, las entradas subcorticales del tálamo58 y los núcleos neuromoduladores59, incluido el LC36,60, afectan la dinámica espaciotemporal del SO. La modulación de la dinámica del SO mediada por NE se ve corroborada aún más por los presentes hallazgos. Específicamente, demostramos que la clonidina suprimió la generación de SO, redujo la amplitud de SO y afectó el acoplamiento de SO-huso. Se cree que los episodios de acoplamiento SO-huso indican la activación del contenido de aprendizaje, y la precisión del acoplamiento predice la fuerza de reactivación que es beneficiosa para la memoria61-63. Por lo tanto, un acoplamiento temporal interregional, que es un elemento clave de la consolidación a nivel de sistemas, puede requerir un nivel de NE óptimo. La fuerza del acoplamiento SO-huso y huso-ondulación puede depender del patrón de activación de las neuronas LC-NE y del momento de liberación de NE. La alteración temporal y espacial de la transmisión NE puede resultar en déficits de memoria y procesamiento menos eficientes. Existe una necesidad apremiante de explorar más a fondo las implicaciones funcionales de esta relación temporal finamente sintonizada entre la activación neuronal LC-NE y las oscilaciones asociadas al sueño. Lo más importante es que aún no se han determinado los desencadenantes de un estallido coordinado de actividad neuromoduladora durante el sueño.

En general, nuestros resultados sugieren que se requiere un nivel óptimo de NE para el procesamiento eficiente de la información en la red. La evidencia experimental acumulada y nuestros hallazgos actuales respaldan la opinión de que la liberación de NE durante los estados finos promueve la consolidación tanto a nivel sináptico como a nivel de sistemas8,11. La alteración de la transmisión de NE afectó esencialmente todas las oscilaciones talamocorticales y del hipocampo implicadas en la consolidación de la memoria a nivel de sistemas. Las amplias proyecciones de las neuronas LC-NE en todo el cerebro64 proporcionan múltiples formas para que la NE influya en la actividad coordinada dentro de las redes que sustentan la memoria, incluidas las talamocorticales, prefrontal y límbico donde se originan el SO, los husos del sueño y las ondas12,65,66. Los estudios futuros explorarán con más detalle los mecanismos noradrenérgicos que subyacen a la aparición, el mantenimiento y la reactivación de una red a gran escala que respalda la memoria.

A pesar de los diferentes mecanismos de acción, se ha demostrado que ambos fármacos reducen la actividad de la LC. En particular, el efecto inhibidor de la clonidina in vitro fue más fuerte en las neuronas LC-NE que se proyectan en el hipocampo versus en las prefrontales68. La clonidina suprime principalmente la liberación presináptica de NE a través de los 2-adrenorreceptores y el propranolol bloquea la transmisión de NE a través de los receptores adrenérgicos. Además, el propranolol puede inhibir la recaptación de NE, potenciar la transmisión de NE en los 1-adrenoreceptores y disminuir la transmisión dopaminérgica debido a la inhibición de la síntesis de catecolaminas69; también puede afectar la transmisión serotoninérgica debido a su afinidad por los receptores 5-HT centrales70. Los efectos convergentes de dos fármacos noradrenérgicos clínicamente relevantes, a pesar de actuar sobre diferentes receptores adrenérgicos, sugieren que la transmisión de NE farmacológicamente alterada durante el período posterior al aprendizaje puede interferir con la red de soporte de la memoria y causar un efecto secundario cognitivo del uso terapéutico de estos fármacos.

Métodos

Utilizamos 38 ratas macho Sprague-Dawley (300 - 400 g, Charles Rivers Laboratories, Sulzfeld, Alemania). La instalación para animales tenía condiciones ambientalmente controladas: ciclo de luz/oscuridad de 12 h (luces apagadas a las 8:00 a. m.), temperatura de 20 a 23 grados y humedad de 40 a 60 %. Las ratas se alojaron en parejas o individualmente, y tuvieron acceso ad libitum a comida y agua, excepto por restricción de comida (~15 g de pellets de comida por rata por día) durante el experimento de aprendizaje. El peso de la rata se controló diariamente para garantizar que no estuviera por debajo del 85% del peso de la rata en estado libre. Todos los experimentos se realizaron en pleno cumplimiento de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo, la Ley alemana de bienestar animal (TierSchG) y la Ordenanza sobre bienestar animal de animales de laboratorio (TierSchVersV). El estudio fue revisado por el comité regional de bienestar animal según el artículo 15 de la ley alemana sobre bienestar animal (Kommission nach §15 des Tierschutzgesetzes), la comisión de ética (artículo 15 TierSchG) y aprobado por la autoridad estatal (Regierungspräsidium, Tübingen, Baden-Württemberg). , Alemania, Referat 35, Veterinärwesen). El presente estudio se realiza según las pautas ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Cirugía y registros electrofisiológicos. Los procedimientos quirúrgicos y de registro se han descrito en detalle en otra parte 38,71. Brevemente, una rata anestesiada con isoflurano (5% para inducción, ~2% para mantenimiento) se fijó en un marco estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) con un ángulo de cabeza ajustado a cero grados. Se inyectó por vía subcutánea un anestésico local (Lidocard 2%, B. Braun, Melsungen, Alemania) antes de las craneotomías para la inserción de los electrodos. Para el electroencefalograma (EEG), se fijaron dos tornillos de acero inoxidable (0.86 mm de diámetro) sobre la corteza prefrontal y el cerebelo. Se montaron dos electrodos individuales de platino-iridio (FHC Inc., Bowdoin, ME) pegados con una distancia de 100 a 200 µm entre las puntas en un disco móvil casero y se implantaron en el HPC dorsal ( AP=-3.5 mm, L=2.0 mm, DV=2.0 mm). La monitorización en línea de la actividad neuronal aseguró una localización precisa del área CA1 del HPC dorsal durante la implantación del electrodo. El accionamiento móvil permitió un ajuste adicional de la profundidad del electrodo para un registro óptimo de la ondulación durante el entrenamiento en el laberinto. Para la electromiografía (EMG), se insertó un electrodo de alambre de plata en el músculo del cuello. Se pegó al cráneo un marco de plástico impreso en 3D conectado a una malla de cobre para proteger los cables de los electrodos y aislarlos del ruido eléctrico. Se controlaron la temperatura corporal (~37 grados), la frecuencia cardíaca y la oxigenación de la sangre (más del 90%). Durante 5 a 7 días de recuperación posquirúrgica, las ratas fueron tratadas con un antibiótico (10 mg/kg, ip, Baytril, Bayer) y un analgésico (5 mg/kg, ip, Rymadil, Zoetis).

Después de la recuperación posquirúrgica, las ratas se habituaron a la caja para dormir (plexiglás negro, 20×20×80 cm) y a un procedimiento de conexión de cables. El implante se conectó al sistema de adquisición Neuralynx Digital Lynx (Neuralynx,Bozeman, MT) a través de una platina de cabeza de canal 32- (Neuralynx, Bozeman, MT) y un adaptador personalizado (SSD10-SS- GS, Omnitic, Minneapolis, MN). Se digitalizaron señales extracelulares de banda ancha (0,1 Hz-8 kHz) de electrodos EEG y HPC a 32 kHz. La colocación de los electrodos en el HPC se optimizó para la detección de ondas al menos 24 horas antes de que comenzara el registro. Cada sesión de registro comenzó al mismo tiempo para cada animal y duró 2 h. Este período de observación se seleccionó basándose en evidencia previa de que la fase inicial de consolidación fina depende de la EN8. La grabación se realizó con poca luz y durante la fase activa (oscura) del ritmo circadiano, que es la más óptima para entrenar ratas.

Tarea de memoria espacial.

Se utilizó la misma tarea de laberinto y el mismo protocolo de entrenamiento que se describe en detalle en otra parte 38. Las ratas fueron entrenadas en un laberinto radial elevado de ocho brazos (Fig. 1a). Brazos de laberinto (66 cm de largo × 10 cm de ancho) con un pequeño hoyo (1 cm de diámetro) al final para la recompensa de comida (chocolate con leche) extendido desde una plataforma central (30 cm de diámetro). Se fijaron dos grandes señales visuales en las cortinas negras que rodeaban el laberinto. Durante el intervalo entre ensayos, se colocó una rata sobre un soporte elevado. El comportamiento de las ratas fue monitoreado por video. Después de la habituación y el preentrenamiento (Métodos complementarios), se cebaron 3 de 8 brazos del laberinto; Las ubicaciones de las recompensas se asignaron aleatoriamente para cada rata y se mantuvieron igual durante todas las sesiones de entrenamiento (3 pruebas por día durante 7 días). Una prueba comenzó colocando una rata en la plataforma central y duró hasta que se recogieron las 3 recompensas o transcurrieron 5 minutos. La superficie del laberinto se limpió después de cada prueba para minimizar las señales olfativas. Se registraron y analizaron las siguientes variables de comportamiento: número de brazos del laberinto visitados, tiempo de prueba, precisión de la elección (calculada como una relación entre el número total de brazos visitados con cebo y), errores de la memoria de trabajo (WM) (número de reingresos a los brazos visitados). , errores de memoria de referencia (RM) (entradas en brazos sin cebo).

inyecciones de drogas

El polvo de clonidina y propranolol (Sigma Aldrich, Burlington, MA) se disolvió en solución salina y se inyectó por vía intraperitoneal (ip) en un volumen de 1 ml/kg inmediatamente después de cada sesión de laberinto (clonidina:0.05 mg/kg, ip; propranolol: 10 mg/kg, ip). Las ratas de control recibieron solución salina (1 ml/kg, ip). La clonidina suprime la transmisión de NE72 y en una dosis de 0,05 mg/kg (ip) se ha demostrado en ratas que reduce la actividad de LC al 60% del nivel inicial67. Propranolol, un antagonista de los receptores adrenérgicos, después de un tratamiento repetido a una dosis moderada (<40 mg/ kg) inhibits the LC activity40,41. Besides, propranolol in a dose of 10 mg/kg (i.p.) was shown to modulate NEmediated excitability of the hippocampal neurons73 while it did not affect rat spontaneous behavior74–76. The half-life of clonidine may greatly vary between 6 and 23 h depending on the dosage, chronic use, and metabolism level75,77. Typically, the plasma peak levels are reached 60–90 min after clonidine administration. The plasma half-life of propranolol is 3 to 6 h with a peak of 1–3 h after ingestion76. The elimination half-life of propranolol is approximately 8 h (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Propranolol). This, according to the pharmacokinetics of both drugs, the drug concentration was close to the highest during the observation period of up to 2 h post-injection. Importantly, both drugs are effectively washed out within less than 24 hours.

Perfusión e histología.

Las ratas fueron sacrificadas (100 mg/kg ip, Narcoren, Merial) y perfundidas transcardialmente con solución salina al 0,9% seguida de paraformaldehído al 4%. Los cerebros se cortaron (50 µm) utilizando un microtomo de congelación horizontal (Microm HM 440E, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA). Para verificar la colocación de los electrodos, se examinaron secciones de cerebro teñidas con Nissl bajo el microscopio (Axiovision, Zeiss, Oberkochen, Alemania).

Detección de eventos.

El SO, los husos del sueño y las ondas del hipocampo se detectaron como se describió anteriormente en otro lugar71,78. La señal de EEG se redujo a 1 kHz y se filtró de paso de banda (0.3 – 4 Hz). Para la detección de SO, se extrajeron los cruces por cero del EEG filtrado que se produjeron dentro de una ventana de tiempo de 0.4 a 1-. Se asignaron dos cruces por cero consecutivos de negativo a positivo con una amplitud de pico negativa inferior a 100 μV y una amplitud de pico a pico de negativo a positivo superior a 120 μV. como así. Para la detección del huso, se rectificó y suavizó el EEG filtrado de paso de banda (10–16 Hz). Los husos se detectaron mediante una amplitud de señal que excedía un umbral de 1,5 desviaciones estándar (SD) de la señal media durante las épocas de sueño NREM durante 0.4—2,0 s. Se fusionaron los husos que se produjeron en menos de 50 ms. Los HVS se detectaron utilizando el mismo algoritmo con parámetros ajustados (paso de banda: 5–7 Hz, umbral: 2,5 SD, min/max: 0,7 s/3 s). Se fusionaron dos HVS que ocurrieron en menos de 200 ms. Para evitar la doble detección, se identificaron husos de sueño en épocas libres de HVS. Para la detección de ondas, HPC LFP fue filtrado, rectificado y suavizado de paso de banda (120–250 Hz). Las ondas se detectaron mediante una amplitud de señal que excedía un umbral de 3 a 5 DE durante 0,025 a 0,5 s. Para todos los eventos, las compensaciones y las compensaciones se definieron como cruces por cero ascendentes y descendentes, respectivamente, utilizando un umbral de 1 SD. La potencia oscilatoria se calculó como la integral de la envolvente de la señal transformada de Hilbert entre el evento activado y compensado. El acoplamiento temporal SO-huso se evaluó como se describe en otra parte43. El pico negativo de SO se utilizó como evento de referencia (t=0), se extrajeron los picos y valles de los husos que ocurrieron dentro de ± 1,5 s y se generó el histograma de correlación de eventos. El recuento de contenedores se convirtió a la tasa de eventos, se transformó en z y se promedió el grupo.

Puntuación del sueño y análisis espectral de potencia de EEG. La puntuación del sueño se basó en una clasificación asistida visual para épocas consecutivas de las señales EEG y EMG79. El EEG libre de artefactos se clasificó en vigilia activa (AW, EEG rápido de baja amplitud y EMG alta), vigilia tranquila (QW, EEG rápido de baja amplitud y EMG baja) y NREM (EEG lento de alta amplitud y EMG baja). ). Las épocas de sueño REM durante el registro de 2 h fueron raras y no se analizaron. Los espectros de potencia del EEG se calcularon para cada estado de comportamiento utilizando Matlab (Mathworks, EE. UU.) y la caja de herramientas FieldTrip 80. La señal de EEG se segmentó en {{10}} épocas con una0.5-s superposición. Se aplicó la Transformación Rápida de Fourier a segmentos de datos ahusados ​​de Hanning para calcular el espectro de amplitud de un solo lado. Para separar los componentes fractales y oscilatorios en el espectro de potencia del EEG, utilizamos el procedimiento de análisis autoespectral de remuestreo irregular. Las gráficas de tiempo-frecuencia se generaron utilizando una ventana cónica deslizante de Hanning y una duración de 3 ciclos dependiente de la frecuencia. Se utilizó el rango de frecuencia de 0.05 a 20 Hz (en pasos de 0,1 Hz) para SO, husos de sueño y HVS, y de 50 a 300 Hz (en pasos de 0,05 Hz y 9 ciclos) para las ondas del hipocampo.

Diseño experimental y análisis estadístico.

Se entrenó a treinta y dos ratas en el laberinto, de las cuales a 19 se les implantaron electrodos y se las trató con clonidina (n=16), propranolol (n=11) o solución salina (n{{4}). }) después de cada sesión de aprendizaje. A otras 9 ratas se les implantaron electrodos y se utilizaron únicamente para electrofisiología. Las variables de comportamiento fueron promediadas por sesión y sometidas al análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) con la sesión de aprendizaje como factor repetido y el tratamiento farmacológico como factor grupal. Se aplicó la corrección de Greenhouse-Geisser cuando se violó el supuesto de esfericidad. Se utilizó el análisis de conglomerados de K-medias para revelar la variabilidad entre sujetos en la tasa de aprendizaje. Específicamente, presentamos la precisión de la elección (como se define en la sección Método de la tarea de memoria espacial) para todas las sesiones de aprendizaje y dividimos la serie temporal en dos grupos que se diferencian por la dinámica de aprendizaje. Luego calculamos la proporción de ratas en cada grupo para cada grupo experimental. Las variables derivadas de señales electrofisiológicas como inicio del sueño, duración de la época, tasa de eventos, etc., se sometieron a un ANOVA de una vía con el tratamiento farmacológico como factor de grupo seguido, cuando correspondía, de las pruebas posthoc de Bonferroni. La tasa de eventos posteriores a la inyección se comparó utilizando el ANOVA de medidas repetidas con una ventana de tiempo de 1 h y entre tratamientos farmacológicos repetidos. Se utilizó la prueba de muestras pareadas para revelar la diferencia entre grupos en los histogramas peri-evento. La significancia estadística (valor) se estableció en p=0.05. Para el análisis estadístico se utilizó IBM SPSS Statistics (v.22). Para la visualización de resultados se utilizaron los paquetes de software Matlab (R2014a) y Adobe Illustrator®.

Disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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