El SNP Rs708727 asociado a la enfermedad de Alzheimer en SLC41A1 puede aumentar el riesgo de enfermedad de Parkinson: informe del estudio eslovaco ampliado, parte 2

2.2. Análisis genéticos

Los análisis genéticos se realizaron en los SNP A1 rs11240569, rs708727 y rs823156 en la cohorte de 508 pacientes con EP (frente a 150 pacientes en el estudio piloto) y la cohorte de 472 controles (frente a 120 controles en el estudio piloto) [37]. Por lo tanto, el número de pacientes con EP y de probandos de control aumentó en este estudio 3,4- y 3,9 veces, respectivamente, en comparación con el estudio piloto.

Muchas personas experimentan pérdida de memoria a medida que envejecen, pero en las personas con enfermedad de Parkinson, los cambios en la memoria pueden ser más pronunciados. Sin embargo, no deberíamos pensar que las personas con la enfermedad de Parkinson están destinadas a sufrir un deterioro de la memoria, porque hay cosas que podemos hacer para ayudarles a mantenerla.

En primer lugar, realizar constantemente algunas actividades de entrenamiento cerebral puede ayudar a las personas con enfermedad de Parkinson a mejorar su memoria. Estas actividades pueden incluir: hacer Sudoku, jugar juegos de mesa, resolver acertijos y más. A través de estas actividades, pueden ejercitar su memoria, mejorar su función cerebral y ayudarlos a mantener su estado mental.

En segundo lugar, la dieta también tiene un impacto muy importante en la memoria de los pacientes con enfermedad de Parkinson. En la dieta podemos añadir algunos alimentos ricos en proteínas y nutrientes, como pescado, judías, frutos secos, etc. Estos alimentos pueden ayudarnos a mantenernos sanos y mejorar nuestra memoria.

Por último, el ejercicio regular también puede ayudar a las personas con enfermedad de Parkinson a mejorar su memoria. El ejercicio no sólo nos ayuda a mantenernos sanos físicamente sino, lo que es más importante, mejora nuestra función cerebral. Mediante el ejercicio regular, pueden aumentar su función cardiopulmonar, mejorar la elasticidad de sus músculos y huesos y mejorar su memoria.

En definitiva, que las personas con enfermedad de Parkinson experimenten un deterioro de la memoria depende de su estilo de vida y hábitos alimentarios, así como de si prestan atención a cosas como el entrenamiento cerebral y el ejercicio. Siempre que prestemos atención a estos aspectos, creo que la memoria de los pacientes con enfermedad de Parkinson se puede mejorar de forma eficaz. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino con muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de la carne picada proviene de una variedad de ingredientes activos que contiene, incluidos ácido carboxílico, polisacáridos, flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro a través de varios canales.

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In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) en nuestra cohorte total (casos de EP + probandos de control), aproximadamente comparable con el rango fq de la población total de alelos menores (MATPFR) informado por las bases de datos gnomAD y ExAC, de la siguiente manera: fqo (observado) vs. for (reportado) {{1 }}% ​​frente a 29-30%.

El alelo menor fq para rs708727 (G > A) en nuestra cohorte total fue mayor que MATPFR en las bases de datos de gnomAD y ExAC (fq, vs. para=40% vs. 29-30%) pero fue comparable con el alelo menor rs708727 fq informado para la población europea en la base de datos ALFA (41%). La fq del alelo menor rs823156 (A > G) en nuestra cohorte total fue del 17% y, por lo tanto, fue inferior a MATPFR en las bases de datos gnomAD y ExAC (23–30%), pero fue comparable con la fq del alelo menor rs823156 informada para la población europea en la base de datos ALFA (18%).

La frecuencia del alelo menor de rs9438393 (A > G) en la cohorte total fue del 40% y, por lo tanto, fue notablemente más alta que el MATPFR del 26-29% reportado en las bases de datos gnomAD y TOPMED, pero fue comparable con el alelo menor rs9438393 Frecuencia de alelos informada en la base de datos ALFA para la población europea (41%). El alelo menor de rs56152218 (T > C) en la cohorte total estuvo presente con una fq del 38 %, que está dentro del MATPFR del 32 al 46 % informado por las bases de datos ALSPAC, TOPMED y ALFA (población europea).

Curiosamente, en las poblaciones vietnamita, coreana y qatarí, el alelo menor es T y no C, como se observa en la población europea [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, consultado el 2 de agosto de 2021)]. Se encontró que la fq del alelo menor en rs61822602 (G > T) era del 12%. Esto es comparable con las frecuencias del alelo T reportadas por las bases de datos ALSPAC y TWINSUK (12% y 13%, respectivamente), pero es mucho mayor que la fq del alelo T reportada en la población europea en la base de datos ALFA (6%).

Todos los SNP A1 probados en nuestra EP y en las cohortes de control estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE; Tabla 4).

A continuación, calculamos los odds ratios (OR) del alelo menor y los genotipos que contienen el alelo menor para cada SNP analizado. Estos resultados se resumen en la Tabla 5. El genotipo GA en rs708727 se asoció con la EP (OR=1.42 (1.08–1.87), p=0.01) en nuestra población. Además, probamos la asociación de combinaciones genotípicas particulares para cada SNP probado con EP en modelos genéticos recesivos, dominantes y completamente sobredominantes (Tabla 6). De manera coherente con los datos anteriores, identificamos una asociación del alelo menor (A) rs708727 con la EP en modelos genéticos dominantes (GG vs. GA + AA) y completamente sobredominantes (GG + AA vs. GA) (ORD {{16} }.36 (1,05–1,77), p=0.02 y ORCOD=1.34 (1,04–1,72), p=0.02, respectivamente). Los SNP restantes no mostraron asociación con la EP en los modelos genéticos probados (Tabla 6).

También probamos la igualdad de las proporciones poblacionales de cualquier combinación genotípica compuesta de dupletes, trillizos, cuatrillizos, quintillizos o sextillizos de los SNP probados en la cohorte de EP (N {{0}}) y la cohorte de controles ( N=100) para examinar el tamaño del efecto de las interacciones entre los SNP A1 probados hacia la susceptibilidad a desarrollar EP en nuestra población. En total, se encontraron un total de 12 combinaciones genotípicas (dos dupletes, siete tripletes y tres cuatrillizos, Tabla 7) con significativamente (p < 0.05, 10 genotipos; p < 0,06, dos genotipos ) se identificaron diferentes recuentos en las cohortes de PD y de control (Tabla 7). Siguiendo los criterios de Cohen [39], que describen las diferencias en proporciones, sólo el triplete GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) de los 12 genotipos mostró la diferencia de tamaño "mediano" definida por h(2arcsin√ prp1) de Cohen. –2arcsin√ prp2) Mayor o igual a 0,5.

El valor h para los 11 genotipos restantes osciló entre 0.32 y 0.46 y, por lo tanto, estuvo dentro del intervalo h de 0.2 a 0.5, lo que define pequeñas diferencias en proporciones (Tabla 7) [39]. Por lo tanto, el triplete GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) podría ser clínicamente significativo y se deben realizar exámenes futuros de este genotipo sobre la susceptibilidad a la EP. Para rs11240569, rs708727 y rs823156, realizamos el mismo tipo de análisis con datos de origen de la cohorte de 508 pacientes con EP y la cohorte de 472 controles. Cuatro genotipos, dos dupletes (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) y dos tripletes (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AA(rs823156), (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AG(rs823156)), con recuentos significativamente (p < 0,05) diferentes en las cohortes de PD y control. La h de Cohen calculada para cada uno de los cuatro genotipos estuvo por debajo del umbral de 0,2 [39], y por tanto, la diferencia entre las proporciones poblacionales entre los grupos analizados fue, en los cuatro casos, insignificante.

El envejecimiento, seguido del género masculino, se considera el factor de riesgo más destacado para la aparición de EP idiopática [37]. En nuestro estudio piloto, la edad de aparición de la EP idiopática en la cohorte de 150 pacientes con EP no se correlacionó con la presencia de ninguna combinación genotípica para los SNP rs11240569, rs708727 y rs823156 [37]. Aquí, hemos correlacionado la edad de aparición de la EP con (1) la presencia de cada combinación genotípica para los SNP rs11240569, rs708727 y rs823156 en el grupo de 508 pacientes con EP (Figura 2), y (2) con la presencia de cada combinación genotípica para los SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 y rs61822602, en la subcohorte de pacientes con EP, seleccionados aleatoriamente de la cohorte con EP para la secuenciación del promotor A1 (Figura 3). Acerca de la edad de inicio, un análisis ANOVA unidireccional reveló que no había diferencias significativas (p < 0,05) entre las subpoblaciones genotípicas para cada uno de los SNP analizados tanto en la cohorte grande de EP como en la subcohorte de EP. pacientes. Por lo tanto, cualquier genotipo particular en los SNP probados no influye en la edad de aparición de la forma idiopática de EP. Esto está totalmente de acuerdo con la conclusión extraída de nuestro estudio piloto [37].

También hemos realizado el mismo tipo de análisis para cada uno de los SNP probados en subpoblaciones de mujeres y hombres que se derivaron de la cohorte grande (N=508) y la subcohorte (N=96 ) de pacientes con EP. Como se demuestra en las Figuras complementarias S1 a S3, no hay una asociación significativa (p <0.05) entre la edad de inicio y la presencia de cualquier combinación de genotipo particular en los SNP analizados rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218, y rs61822602 en los subgrupos divididos por género se derivó de la gran cohorte de PD (NM=306, NF=202) o de la subcohorte de PD seleccionada para la secuenciación del promotor A1 (NM {{20} }, NF=42).

2.3. Aprendizaje automático RandomForest (RF-ML)

Se probó la capacidad de todos los SNP A1 para discriminar entre pacientes con EP y controles con RF-ML. El algoritmo RF-ML se entrenó utilizando nuestros datos y se evaluó la importancia discriminativa de los SNP individuales mediante una construcción técnica, conocida como profundidad del gráfico [37,40]. Al igual que en nuestro estudio piloto [37], la capacidad predictiva de los SNP probados se visualizó y cuantificó mediante curvas ROC (características operativas del receptor) y AUC (área bajo la curva ROC), respectivamente. La capacidad discriminativa de los predictores se da dentro del intervalo de AUC desde el 100% (capacidad discriminativa máxima) hasta el 50% (capacidad discriminativa mínima); AUC < 50% corresponde a ninguna capacidad discriminativa.

El algoritmo de RF se entrenó en los siguientes modos: (1) con tres o seis (Tabla 8) SNP A1 particulares (cada SNP, tres genotipos (AMAM/AMAm/AmAm, donde AM significa alelo mayor y Am significa alelo menor), como predictor (tres o seis modelos de RF, uno para cada SNP), (2) con duplicados genotípicos de los SNP emparejados como predictores (tres modelos de RF (tres SNP) o 15 modelos de RF (seis SNP), uno para cada par de SNP; Tabla 8), (3) con tripletes genotípicos de los tres SNP como predictores (un modelo de RF (tres SNP) o 20 modelos de RF (seis SNP), uno para cada triplete de SNP; Tabla 8), (4) con cuatrillizos genotípicos de los seis SNP como predictores (15 modelos de RF, uno para cada cuatrillizo; Tabla 8), (5) con quintillizos genotípicos de los seis SNP como predictores (seis modelos de RF, uno para cada quintillizo; Tabla 8), y ( 6) con un sextillizo genotípico (un modelo de RF, Tabla 8).

Por lo tanto, cuando se utilizaron como predictores los SNP únicos, dobles, tripletes, cuatrillizos, quintillizos y sextillizos de A1, no tenían capacidad para discriminar entre los pacientes con EP y los controles (Tabla 8). Por lo tanto, según el análisis RF-ML, y de acuerdo con el estudio piloto [37], los SNP A1 no tienen potencial para servir como discriminadores entre controles y pacientes con EP y, en cuanto a la EP, no tienen valor predictivo o diagnóstico en la población eslovaca. .

3. Discusión

El locus PARK16 ha ganado atención en la comunidad científica debido a su asociación con la EP y su papel discutido en la definición de susceptibilidad a esta compleja dolencia. En 2019, informamos sobre un estudio piloto en el que analizamos la asociación de los tres SNP A1, a saber, rs11240569, rs708727 y rs823156, con la forma idiopática de EP en la población eslovaca (eslavos occidentales). En nuestro estudio no se encontró la asociación informada de rs11240569 y rs823156 con susceptibilidad a la EP principalmente en poblaciones asiáticas/orientales [37]. No se pudo confirmar ninguna asociación mediante estadísticas frecuentistas (análisis genéticos conservadores) o mediante análisis RF-ML [37].

Sin embargo, la principal limitación de nuestro estudio piloto fue el número relativamente bajo de pacientes/probandos en las cohortes de EP y control (150 y 120, respectivamente). Hicimos hincapié en que, desde un punto de vista estadístico, los datos debían interpretarse con cautela debido al pequeño tamaño de la muestra en ambas cohortes y al bajo poder estadístico de los análisis realizados [37]. Sin embargo, al utilizar el enfoque ML, que requiere tamaños de muestra considerablemente más pequeños que las estadísticas frecuentistas convencionales o el cálculo bayesiano aproximado, pudimos examinar con confianza la capacidad de determinados SNP A1 para discriminar entre pacientes con EP y controles. En todos los casos, el enfoque de ML reveló una relevancia diagnóstica y predictiva esencialmente nula de los SNP rs11240569, rs708727 y rs823156 en la población eslovaca [37].

En este estudio, hemos examinado no solo los tres SNP antes mencionados, sino también los tres SNP (rs9438393, rs56152218 y rs61822602) localizados dentro de la región promotora de A1. Estos SNP se han identificado mediante la secuenciación de 96 muestras de PD seguida del análisis RFLP de las muestras de control y la verificación RFLP de las muestras de PD secuenciadas. Nuestros análisis genéticos no han revelado esencialmente ninguna asociación de ninguno de los tres SNP recientemente estudiados con la EP. Lo mismo ocurre con rs11240569 y rs823156, que se han analizado en las subcohortes de EP y control (96/100) y también en las cohortes de 508 pacientes con EP y 472 controles. Estos resultados están completamente de acuerdo con el resultado del estudio piloto [37]. Sin embargo, en cohortes grandes, rs708727 se asocia con un mayor riesgo de EP en la población eslovaca.

Hasta donde sabemos, ningún estudio ha asociado directamente A1 SNP rs708727 con un riesgo alterado de desarrollar EP [19,37]. En nuestro estudio ampliado (en comparación con el estudio piloto [37]), el alelo menor A en rs708727 se asocia con un mayor riesgo de aparición de EP cuando se prueba en dominante [40] (ORD=1.36 (1,05– 1,77), p=0.02) o completamente sobredominante [41] (ORCOD=1.34 (1,04–1,72), p=0.02) (Tabla 5). Por tanto, la presencia del alelo menor (A) en rs708727 podría estar asociada con un mayor riesgo de desarrollar EP. Mientras que Sánchez-Mut et al. [27] y Wang et al. [42] han demostrado claramente que la presencia del alelo menor A en rs708727 altera la metilación del promotor PM20D1 (y, por tanto, su expresión) de manera dosis dependiente (cuantitativa), los modelos genéticos que mejor se ajustan en nuestro estudio. indican que la presencia de un alelo rs708727 A es suficiente para alterar la susceptibilidad a la aparición de la EP. La susceptibilidad a la EP (fenotipo), acerca de si una o dos copias del alelo menor están presentes en rs708727 (genotipo), aún no se ha aclarado en detalle.
Sánchez-Mut et al. han identificado PM20D1 (localizado dentro del locus PARK16 y que codifica el dominio peptidasa M20-que contiene proteína una enzima con actividades tanto hidrolasa como peptidasa; N-acil aminoácido graso sintasa/hidrolasa) como un rasgo cuantitativo de metilación y expresión locus (mQTL) acoplado a un haplotipo asociado al riesgo de EA, que muestra características similares a las de un potenciador y contacta con el promotor PM20D1 a través de un bucle de cromatina mediado por el factor de transcripción CTCF (unión a CCCTC) dependiente del haplotipo [27]. Al comparar muestras de controles sanos y pacientes con EA en estadio avanzado, descubrieron que PM20D1 muestra constantemente hipermetilación del promotor en pacientes con EA [27]. A1 SNP rs708727 se correlaciona con los niveles de metilación del ADN de PM20D1 en la corteza frontal y el hipocampo humanos [27], al igual que el SNP rs960603 [27]. Wang y sus colegas, en su trabajo sobre sangre periférica, han adquirido datos que confirman que PM20D1 es un mQTL mediado principalmente por el SNP A1 rs708727 asociado al riesgo de EA [42].

Además, sus datos longitudinales demuestran que la hipometilación se produce antes del inicio sintomático de la EA, posiblemente para facilitar la expresión creciente de PM20D1 para activar su función protectora [42]. El progreso de la EA se caracteriza por un nivel creciente de metilación en las islas CpG en la DMR (región metilada diferencialmente) del promotor PM20D1 en pacientes con EA, lo que en última instancia conduce a la inhibición de la transcripción y expresión de genes [27,42,43]. PM20D1 también se ha asociado con diabetes [44], obesidad [45] y esclerosis múltiple [46], y dado que está localizado dentro del locus PARK16, se supone su posible implicación/asociación con la EP [47].

A pesar de la falta de análisis de mecanismos moleculares, especulamos, a la luz de nuestros datos actuales, que la EA y la EP (y otras enfermedades neurodegenerativas menos frecuentes) comparten no sólo mecanismos fisiopatológicos "bien conocidos" (p. ej., mitofagia, retrómero y proteasoma alterados) funciones), sino también mecanismos epigenéticos, como la regulación dependiente de A1 rs708727-de la expresión de PM20D1 [27,42]. Nuestro trabajo se suma indirectamente a la necesidad de dilucidar detalladamente el papel de los N-acil aminoácidos (NAA) endógenos que son metabolizados por PM20D1 en la patobiología de la EP y otros trastornos neurodegenerativos. Ahora se sabe que los NAA y los conjugados N-acilo de neurotransmisores (NAAN) desempeñan un papel importante en la neuromodulación [48,49]. El trabajo reciente de Song et al. ha proporcionado evidencia que vincula la expresión de PM20D1 con la N-acil dopamina (NADA). Estos autores han demostrado que la eliminación de kir6.2 (una subunidad formadora de poros de los canales de K+ sensibles a ATP) conduce a una reducción del recuento de mitocondrias y una disminución de la producción de ATP a través de un aumento en los niveles de PM20D1 y de agentes que desacoplan la respiración mitocondrial. , incluido NADA, en el mesencéfalo murino [49].

NADA es un potente inhibidor de la 5-lipoxigenasa (5-LOX) y tiene una distribución limitada al cerebro, siendo los niveles más altos en el cuerpo estriado y muy bajos en otros lugares [48,50,51]. 5-LOX cataliza la síntesis de leucotrienos o 5-HpETE (5-ácido hidroperoxi eicosatetraenoico) a partir del ácido araquidónico y se ha asociado con la neurodegeneración (EA y EP) a través de su participación en la neuroinflamación [51, 52]. Por lo tanto, sugerimos que la disminución de la expresión de PM20D1, la posterior menor abundancia de NADA y el aumento de la actividad de 5-LOX contribuyen significativamente a la patología de la EP (y otras enfermedades neurodegenerativas).

Sánchez-Mut y sus colaboradores han demostrado que la sobreexpresión de PM20D1 en el hipocampo murino con EA produce una mejora en el aprendizaje, mientras que su eliminación aumenta la carga de placa amiloide [27]. Tanto la patología de tipo Lewy como la de tipo Alzheimer son importantes en la demencia relacionada con la EP [53]. Un grupo importante de pacientes con EP sufre un empeoramiento de la demencia durante la enfermedad [54]. Teniendo en cuenta estas observaciones, especulamos si la actividad ligada a rs708727-que silencia a PM20D1 contribuye a la aparición de la demencia de la EP y si el seguimiento de la actividad de PM20D1 puede servir como parámetro de pronóstico para la aparición de la demencia de la EP.

Trabajos publicados anteriormente han sugerido la participación de los transportadores de Mg2+ en la patobiología de la EP [18–22,55]. A1, al ser el actor clave en la homeostasis del Mg de las células somáticas, se ha relacionado directamente con la EP [20-22]. Las mutaciones puntuales en A1 que conducen a las sustituciones p.A350V, p.R244H y p.R285Q se han asociado supuestamente con la EP, y se supone que tanto la falta de función como la pérdida de función de las mutaciones en A1 tienen consecuencias perjudiciales en las neuronas, por lo que contribuyendo al fenotipo de la EP [20-22]. Este trabajo apunta indirectamente hacia la posibilidad de que no sólo las perturbaciones de la función central A1 (intercambio Na+/Mg2+), sino también la regulación epigenética ligada a A1-(rs708727) de la expresión (y actividad) de PM20D1, contribuyan a La patobiología de la EP.

En este estudio, hemos identificado el triplete genotípico GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) como potencialmente clínicamente significativo (h mayor o igual a 0,5). Curiosamente, rs708727 con genotipo GG forma parte del triplete. Sin embargo, a la luz de investigaciones anteriores, se esperaría que el genotipo que contiene el alelo menor A en rs708727 estuviera relacionado con un riesgo potencial de EP asociado con este triplete. Actualmente, no podemos comentar sobre ninguna interacción molecular/genética/epigenética que involucre a los SNP en el triplete GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) y, por lo tanto, sobre cualquier supuesta contribución de este triplete a una suma. del riesgo de aparición de la EP.

En nuestro estudio piloto, utilizamos RF-ML para evaluar e interpretar nuestros datos [37]. La principal ventaja del análisis de datos RF-ML es doble: (1) permite cuantificar la capacidad discriminativa de los SNP entre pacientes con EP y controles [37], y (2) requiere tamaños de muestra más bajos para la evaluación de la importancia discriminativa de los SNP individuales o sus combinaciones [37]. Además, RF-ML evita el problema del valor p que a menudo se asocia con muestras más grandes, incluso cuando están disponibles [56]. Como en nuestro informe anterior, ninguno de los SNP A1 probados ha demostrado tener el poder de discriminar entre pacientes con EP y probandos sin EP en nuestra cohorte (Tabla 8). Por lo tanto, podemos suponer que ninguno de los SNP A1 probados es adecuado para servir como discriminador de EP/no EP en la población eslovaca.

Con respecto a la asociación de A1 rs708727 con riesgo alterado de EP, el resultado de nuestro análisis RF-ML parece ser, a primera vista, contradictorio (Tablas 5 y 6 frente a Tabla 8). Jakobsdottir et al. en sus análisis de regresión logística y curva ROC mostraron que incluso las asociaciones genéticas fuertes no garantizan automáticamente una discriminación efectiva entre casos y controles [57]. A pesar de ser clasificadores deficientes, los SNP con OR significativo podrían ser muy valiosos para establecer hipótesis etiológicas [57]. En nuestro caso, A1 SNP rs708727 no tiene poder de clasificación con respecto a la EP, por lo que no tiene importancia clínica. Sin embargo, su asociación débil, pero significativa, con el riesgo alterado de EP nos permitió especular sobre la participación de rs708727 en la patobiología de la EP de manera similar o igual a como está involucrado en la EA [27].

4. Materiales y métodos

4.1. Participantes del estudio (características básicas)

En total, se incluyeron en el estudio 980 probandos (508 pacientes con EP y 472 controles, que cumplieron criterios inclusivos). La forma idiopática de la EP fue diagnosticada por neurólogos en cinco centros de diagnóstico de la EP (en Martin, Bratislava, Trencin, Zvolen y Kosice) según los criterios de diagnóstico de la EP de la MDS (Movement Disorder Society). Todos los pacientes fueron tratados con terapia anti-PD estándar. La edad media de los pacientes con EP fue de 68,4 ± 9,6 años. La edad media de aparición de la enfermedad fue de 61,7 ± 10,7 años. El caso más joven fue diagnosticado a la edad de 34 años y el caso más antiguo a los 89 años. El grupo de EP estaba formado por 202 pacientes femeninos (F) y 306 masculinos (M), por lo que la proporción F:M fue de 1:1,5.

La cohorte de control de probandos estuvo formada por pacientes externos e internos de la Clínica de Medicina y Toxicología Ocupacional (Hospital Universitario Martin (UHM)) y la Clínica de Neurología (UHM). Sólo aquellos pacientes que no habían sido diagnosticados previamente con ninguna enfermedad neurodegenerativa y neuropsiquiátrica, como diabetes mellitus u osteoporosis (todas enfermedades supuestamente asociadas con la expresión alterada de A1 y la desregulación de la función A1), se inscribieron en el grupo de estudio de control. La edad promedio de los probandos de control fue de 68,3 ± 11,6 años. El grupo de control estaba formado por 208 mujeres y 264 hombres y, por lo tanto, la proporción F: M fue de 1:1,3 en el grupo de control.

La subcohorte de pacientes con EP, en la que se secuenció la región promotora A1, constaba de 96 sujetos seleccionados al azar. La relación F:M fue de 1:1,3 (42 mujeres y 54 hombres). La edad promedio de los pacientes en la subcohorte de EP fue 67,{{10}} ± 9,5 años. La subcohorte de control estuvo compuesta por 41 mujeres y 59 hombres, por lo que la relación F:M fue de 1:1,4. La edad promedio de los probandos en la subcohorte de control fue de 59,8 ± 5,0 años.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Jessenius de la Universidad Comenius (JFM CU). La aprobación se registró bajo ID: EK 66/2019. Todos los participantes del estudio firmaron formularios de consentimiento informado.

4.2. Procesamiento de muestras

Las muestras de sangre se recogieron en tubos BD Vacutainer® tratados con EDTA (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.). El ADN genómico se aisló de muestras de sangre fresca (UHM) o congelada (otros centros de EP) utilizando el kit de purificación de ADN genómico Wizard® (Promega Corporation, Maddison, WI, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras de ADN aisladas se almacenaron a -80 ◦C.

4.3. Genotipado

La genotipificación se realizó en 358 muestras de PD y 352 muestras de control. Los resultados de estos experimentos se analizaron junto con los resultados informados previamente por Cibulka et al. [37]. Los SNP rs11240569, rs708727 y rs823156 se analizaron utilizando las sondas de genotipado TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 y C_9238453_10/rs708727 (todas Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA) de la misma manera que se informó anteriormente [37].

4.4. Secuenciación de Sanger

La región promotora se dividió en cuatro fragmentos/amplicones superpuestos, ya que era demasiado larga para una sola secuenciación. Antes de ser secuenciadas, las regiones objetivo fueron amplificadas. Los cebadores se diseñaron utilizando la herramienta en línea Primer3Plus [https://primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (consultado el 3 de mayo de 2018)]. Se verificó la presencia de múltiples productos de amplificación en cada par de cebadores mediante la herramienta de PCR en línea UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (consultado el 3 de mayo de 2018)].

Los cebadores y programas de PCR utilizados para la amplificación de los cuatro fragmentos se resumen en las Tablas complementarias S1 y S2. Las composiciones de las mezclas maestras para cada fragmento se resumen en SA3. Los fragmentos 3 y 4 tienen un alto contenido de nucleótidos G y C (67,4% y 71,9%, respectivamente). El rendimiento de la reacción se incrementó mediante la adición de 10 × GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estonia). El producto de la PCR se purificó utilizando NucleoSpinTM Gel y un kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Alemania). En el siguiente paso, el producto de la PCR purificado se diluyó a una concentración adecuada para la secuenciación previa de la PCR (SA4, SA5). Sólo se utilizaron cebadores directos (fw) en la PCR previa a la secuenciación. La mezcla de reacción también incluyó BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.) y didesoxinucleótidos.

Como resultado, obtuvimos una mezcla de productos de varios tamaños terminados en didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia. Posteriormente, los productos se purificaron utilizando el kit de limpieza de reacción de secuenciación SigmaSpin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se transfirió un volumen de 3 µl de producto purificado a una placa de pocillos 96- junto con 12 µl de formamida desionizada de alta calidad (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.). La mezcla se desnaturalizó durante 5 min a 95 ◦C en un termociclador. Los fragmentos se separaron en el 8-dispositivo microcapilar ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.). Las secuencias se exportaron y visualizaron mediante el software Chromas (Technelysium Pty Ltd., South Brisbane, Australia). Los archivos FASTA se cargaron en BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica) y se alinearon con el genoma humano de referencia (versión GRCh38.p12).

La predicción de los sitios de unión de los factores de transcripción y sus alteraciones se realizó mediante la herramienta en línea ConSite [disponible en: http://consite.genereg.net/ (consultado el 3 de septiembre de 2020)] [38]. Se cargaron secuencias con el alelo mayor y el alelo menor y se generaron espectros de los factores de transcripción (TF). El análisis se realizó sin preestablecer una especificidad mínima. Los cambios en los perfiles de unión de TF según la presencia de variantes se resumen en la Tabla 2.

4.5. Análisis RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción)

Los componentes de la mezcla de reacción y las condiciones de la PCR amplificada se resumen en SA6 y SA7. Se utilizó la herramienta in silico en línea NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (consultado el 14 de febrero de 2020)] para diseñar restricciones de los amplicones. Se eligieron las siguientes enzimas de restricción para el análisis RFLP: Hpy166II (detección de rs9438393), NIaIII (detección de rs56152218) y BmrI (detección de rs61822602). Todas las enzimas se adquirieron en New England Biolabs. Para la variante rs144056491, no pudimos diseñar un experimento RFLP porque no había ninguna enzima adecuada disponible. Después de la restricción, esperábamos que los fragmentos resumidos en SA8 formaran el rendimiento. Después de la restricción, los productos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa (GEL NIaIII y Hpy166II al 1 %; gel BmrI al 2 %) y luego se visualizaron en un instrumento PharosFX (Bio-Rad Laboratories). Se determinaron los genotipos para cada SNV.

4.6. Análisis de los datos

Los datos se exploraron y analizaron utilizando R [R Core Team (2021); R: un lenguaje y entorno para la informática estadística. Fundación R para Computación Estadística, Viena, Austria. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.0.5 (2021-03-31)]. Se realizó un estudio de asociación genética (GAS) y un análisis de potencia utilizando las bibliotecas R HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Explorando los marcadores genéticos dialélicos: el paquete HardyWeinberg. Revista de software estadístico, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: Herramientas para estadística descriptiva. Versión del paquete R 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Herramientas de epidemiología. Versión del paquete R 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Funciones básicas para análisis de potencia. Paquete R versión 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] y un código desarrollado internamente. El modelado predictivo de RandomForest se realizó con la biblioteca R randomForestSRC [Ishwaran H. y Kogalur UB (2021); Fast Unified RandomForests para supervivencia, regresión y clasificación (RF-SRC), paquete R versión 2.11.0.]. Los datos fueron visualizados por la biblioteca R beeswarm [Aron Eklund (2021); beeswarm: The Bee Swarm Plot, una alternativa al Stripchart. Versión del paquete R 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Se utilizó ANOVA unidireccional para probar la hipótesis nula de igualdad de la edad media de inicio de la población para las tres subpoblaciones de genotipos para cada SNP. Los hallazgos con un valor de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

5. Conclusiones

En resumen, nuestros datos sugieren una asociación débil, pero significativa, del A1 SNP rs708727 con la EP en modelos genéticos dominantes y sobredominantes en una población eslovaca. Ninguno de los otros SNP A1 probados (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 y rs61822602) se asociaron con la enfermedad en ninguno de los modelos genéticos probados. Los análisis RF-ML identificaron todos los SNP A1 probados como clasificadores/predictores deficientes de la EP, por lo que su uso en la práctica clínica como marcadores de diagnóstico o pronóstico sigue siendo insignificante. Sin embargo, la asociación de rs708727 con la EP nos permitió especular que el alelo menor asociado al riesgo de EP (G > A) en rs708727 contribuye a la aparición y progresión de la enfermedad a través del trastorno de la regulación epigenética de la expresión de PM20D1, el mecanismo que se sabe que desempeña un papel importante. en patobiología de la EA. Esta hipótesis debe examinarse más a fondo para hacer una afirmación concluyente. Además, se debe dilucidar una posible asociación entre la demencia asociada a la EP y rs708727.

Contribuciones de autor:

Conceptualización, MK; metodología, MK, MC, MG (Marian Grendar) y MB; software, MG (Marian Grendar); validación, MC, MB y MK; análisis formal, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS y MG (Milan Grofik); investigación, MC y MB; curación de datos, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN y EK; redacción: preparación del borrador original, MK; redacción: revisión y edición, MC, MG (Marian Grendar) y ZP; visualización, MK, MC y MG (Marian Grendar); supervisión, MK; administración de proyectos, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS y BV; adquisición de financiación, MK Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:

Este trabajo fue apoyado por la Agencia Eslovaca de Investigación y Desarrollo, número de subvención APVV-19-0222, y la Agencia de Subvenciones Científicas del Ministerio de Educación, Ciencia, Investigación y Deportes de la República Eslovaca y la Academia Eslovaca de Ciencias, número de subvención VEGA. 01/0554/19, ambos a MK

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Jessenius de la Universidad Comenius (JFM CU). La aprobación se registró con el ID: EK 66/2019.

Declaración de consentimiento informado:

Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio.

Declaración de disponibilidad de datos:

El conjunto de datos completo está contenido en el artículo. La naturaleza y el alcance de los datos incluidos permiten un metanálisis adicional. Cualquier información sobre el estudio está disponible previa solicitud al autor correspondiente.

Expresiones de gratitud:

Agradecemos a todos los participantes del estudio y a sus familiares. Extendemos nuestro agradecimiento también a Martin Marak (JFM CU) por su competente apoyo técnico al proyecto, a Jan Radvanszky y Rastislav Hekel (ambos GENETON sro) por sus útiles consejos sobre los análisis del promotor A1, y a Theresa Jones por la edición lingüística del manuscrito.

Conflictos de interés:

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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