Una vacuna de ARNm provoca respuestas inmunitarias antitumorales dependientes de STING

Abstracto

Las vacunas de ARN formuladas con lípidos se han utilizado ampliamente para la prevención y el tratamiento de enfermedades, pero aún no se han delineado su mecanismo de acción y los componentes individuales que contribuyen a dichas acciones. Aquí, mostramos que una vacuna terapéutica contra el cáncer compuesta por un núcleo de protamina/ARNm y una cubierta lipídica es muy potente para promover respuestas de células T CD8+ citotóxicas y mediar la inmunidad antitumoral. Mecánicamente, tanto el núcleo del ARNm como la cubierta lipídica son necesarios para estimular completamente la expresión de interferones tipo I y citocinas inflamatorias en las células dendríticas. La estimulación de la expresión de interferón-b depende exclusivamente de STING, y la actividad antitumoral de la vacuna de ARNm está significativamente comprometida en ratones con un gen Sting defectuoso. Por tanto, la vacuna de ARNm provoca inmunidad antitumoral dependiente de STING.

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1. Introducción

El rápido desarrollo y la aplicación mundial de vacunas de ARNm para la prevención de la infección por SARS-CoV-2 han demostrado el poder de los medicamentos basados ​​en ARNm en la atención sanitaria1,2. Debido a su gran peso molecular y carga negativa, las moléculas de ARNm deben empaquetarse en vehículos de administración para poder ingresar de manera efectiva a las células de los mamíferos. El envasado en vehículos de administración de tamaño nanométrico también tiene la ventaja de proteger las moléculas de ARNm de la degradación enzimática. Se han desarrollado múltiples plataformas de administración para adaptarse a este propósito, como nanopartículas lipídicas4, lipopoliplex (LPP)5, liposoma-protamina-ARN (LPR)6, ARN lipoplex (ARN-LPX)7 y partículas de vacuna similares a virus (VLVP). )8. Si bien cada plataforma tiene su propia estructura y composición únicas, la mayoría de los vehículos contienen una molécula de lípido iónico que facilita el empaquetado del ARNm y el escape de las moléculas de ARNm de los endosomas. Con el éxito de las vacunas profilácticas, existe una comprensión general de que las terapias de ARNm pueden usarse para tratar quizás la mayoría, si no todos, los tipos de enfermedades9e12. De hecho, las vacunas terapéuticas contra el cáncer basadas en ARNm se han estudiado durante muchos años13,14. Los avances recientes en los ensayos clínicos también han demostrado su potencial de aplicación en pacientes con cáncer seleccionados15-17. A diferencia de las vacunas peptídicas contra el cáncer que se preparan con moléculas adyuvantes18-20, las partículas de la vacuna de ARNm también pueden servir como autoadyuvantes21.

Por ejemplo, una vacuna contra el cáncer basada en ARNm de dos componentes que contiene ARNm libre y complejado con protamina también puede activar la señalización del receptor tipo peaje 7 (TLR7)22. Sin embargo, con la creciente preocupación por la toxicidad inmune innata aguda del ARNm desnudo, la mayoría de los investigadores y las empresas están utilizando ARN modificado para evitar el reconocimiento innato por parte de los TLR23. En consecuencia, los componentes lipídicos desempeñan un papel importante en la mejora de la actividad adyuvante en la partícula de la vacuna de ARNm, preferentemente activando la señalización no TLR. Un estudio reciente sobre el ARN-LPX cargado negativamente, formulado con lípidos y constituido con liposoma de 1,2-dioctadecenil-3-trimetilamonio (DOTMA, un lípido catiónico)/dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE, un lípido auxiliar) reveló activación del eje de la interleucina 1 (IL1)-antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1ra) en la regulación de la secreción de citocinas proinflamatorias, y el papel esencial de activación de la vía del inflamasoma de dos pasos en los monocitos24. Curiosamente, otra investigación reciente sobre el BNT162b2 basado en LNP preparado con ALC-0315 (un lípido ionizado), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, un lípido auxiliar) , el polietilenglicol-2000-N, N-di tetradecilacetamida (PEG2000-DTA) y el colesterol mostraron el papel clave de activar la señalización MDA5 dependiente del interferón tipo I, pero no los TLR o el inflamasoma, en la estimulación de ambos. inmunidad innata y adaptativa de la vacuna COVID-1925. Estos estudios apuntan a la posibilidad de que las plataformas de administración compuestas por moléculas de lípidos variables puedan depender de diferentes vías de transducción de señales para la actividad de la vacuna. Por tanto, es importante investigar a fondo la función de moléculas clave y sus combinaciones para mejorar aún más la terapéutica del ARNm.

En el estudio actual, organizamos experimentos para analizar el papel funcional de los componentes individuales en una vacuna terapéutica contra el cáncer. La partícula de vacuna de ARNm (MVP) está compuesta por un núcleo de protamina/ARNm que está encapsulado en una cubierta lipídica que consta de un lípido catiónico, un lípido auxiliar, un lípido pegilado y colesterol (Fig. 1A). Se ha demostrado que la inclusión de lípidos cargados puede facilitar la entrega dirigida de ARN26, y la dioleoiletilfosfatidilcolina (EDOPC) y el dioleoil-3-trimetilamonio propano (DOTAP) son dos de los lípidos catiónicos que se han probado para este propósito5,27. Examinamos la estimulación de la expresión de interferón-b (IFN-b), IL-1b y factor de necrosis tumoral a (TNF-a) por el núcleo del ARNm, el vehículo libre de ARNm y el MVP completo, y correlacionaron tales actividades con el TLR7, la señalización antiviral mitocondrial (MAVS, también conocida como IPS-1), el estimulador de genes IFN (STING) y el adaptador que contiene el dominio TIR que induce la señalización de IFN-b (TRIF). Posteriormente, investigamos el papel de la protamina en el núcleo y los lípidos catiónicos en la cubierta en la estimulación de la expresión de IFN-b y TNF-a. Finalmente, comparamos las respuestas inmunes antitumorales del MVP en ratones de tipo salvaje y con genes desactivados.

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2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamina (DOPE) (850725 ), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) (890890), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (850375) se adquirieron de Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, Alabama, EE.UU.). El colesterol (C8667) se obtuvo de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE. UU.). Los reactivos se disolvieron en etanol a una concentración de 2 mg/ml para DSPE-PEG2k, 10 mg/ml para colesterol y DOPC, y 20 mg/ml para EDOPC, DOPE y DOTAP, respectivamente. El sulfato de protamina (P4020) se obtuvo de Sigma Aldrich. Las moléculas de ARNm que codifican ovoalbúmina (OVA-ARNm) (L-7210), eGFP (eGFP ARNm) (L-7201) y luciferasa (Luc-ARNm) (L-7204) se adquirieron de TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, EE. UU.). El agua libre de RNasa (W0805-010) se obtuvo de GeneDEPOT (Baker, TX, EE. UU.). El agonista de TLR7 imiquimod (tlrimq) y el agonista de Sting 20 30 -cGAMP (tlrl-nacga23) fueron productos de Invivogen (San Diego, CA, EE. UU.). Lipofectamine 2000 (11668019) y el kit de ensayo de ARN Quant-iT™ RiboGreen™ (R11490) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Se adquirió GM-CSF de ratón recombinante (554586) de BD Biosciences (San Diego, CA, EE. UU.). 500 Cóctel inhibidor del transportador de proteínas (00-4980-93) era un producto de Invitrogen. El kit Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) se adquirió de BD Biosciences. El kit de aislamiento de células T de ratón EasySep™ (19851) se obtuvo de STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Los siguientes anticuerpos se adquirieron de BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) y anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64-PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643), y anti-CD103-PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) y anti-IFN-g-PE (554412) eran de BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) se adquirió de ImmuDex (Fairfax, VA, EE. UU.). Los kits ELISA para IL-1b (EM2IL1B) y TNF-a (BMS607-3) se adquirieron de Invitrogen, y los kits ELISA para CCL5 (DY478) e IFN-b (DY8234) se obtuvieron de R&D Systems. , Inc. (Minneapolis, MN, EE. UU.). Anticuerpos para análisis de transferencia Western, incluidos anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-actina (4970) y anti-GAPDH (5174) se adquirieron en Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE. UU.).

Figura 1 Preparación y caracterización de partículas de ARNm. (A) Vista esquemática de la preparación de partículas de vacuna. (B) La electroforesis en gel de agarosa muestra que las moléculas de ARNm se retuvieron en el pocillo de carga de muestras en muestras preparadas con ARNm/protamina en una proporción de 1:1 a 1:2. (CeF) Caracterización de partículas de vacuna de ARNm (MVP) según porcentaje de encapsulación, índice de polidispersidad, potencial zeta y tamaño. (G) Imágenes TEM representativas de partículas MVP2, barra de escala Z 50 nm. (H) Porcentaje de expresión de eGFP después de que las células DC2.4 se trataran con eGFP-MVP durante 16 h. (I) Imágenes fluorescentes de células DC2.4 que expresan eGFP, barra de escala Z 400 mm. (J) Análisis cuantitativo de bioluminiscencia en BMDC tratados con MVP encapsulados con ARNm que codifica luciferasa durante 16 h. (K) Cambios en la viabilidad de las BMDC tratadas con PBS, vehículo sin ARNm, núcleo de ARNm/protamina o MVP2 encapsulado en ARNm. Las concentraciones de tratamiento fueron equivalentes a ARNm. Los datos se presentan como media SEM (n Z 3). *P < 0,05; **P<0,01.

2.2. Líneas celulares y cultivo celular.

La línea celular dendrítica murina DC2.4 se obtuvo de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivó en RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 %. La línea celular de melanoma murino B16-OVA se adquirió del Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, EE. UU.). Se cultivaron células B16-OVA en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. La línea celular de adenocarcinoma de colon murino MC38 se adquirió de ATCC. Las células se diseñaron con expresión de OVA y se cultivaron en DMEM con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. El cultivo celular se mantuvo a 37 C con 5% de CO2.

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2.3. Preparación de partículas de vacuna de ARNm.

Todas las partículas de la vacuna de ARNm se prepararon utilizando el instrumento de microfluidos NanoAssemblr Benchtop de Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) mezclando la fase orgánica y la fase acuosa. Para preparar la fase orgánica, se disolvieron EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), colesterol (10 mg/ml) y bis-DSPE-PEG2k (2 mg/ml) en etanol y se mezclaron a 34ºC. :30:35:1 M con un caudal de 9 ml/min. Para preparar el núcleo de ARNm de la fase acuosa, el ARNm se mezcló con sulfato de protamina a 1:1 (p/p) en el instrumento de microfluidos a un caudal de 9 ml/min. Después de 20 minutos de incubación a 20 °C, el núcleo de ARNm de la fase acuosa se mezcló con la fase orgánica para generar partículas de vacuna de ARNm. Después de 20 minutos, la suspensión de partículas de vacuna se transfirió a un filtro ultracentrífugo Amicon (MWCO 30 kDa) y se añadió 9-volumen de agua de grado molecular para diluir la concentración de etanol del 25 % al 2,5 %. Luego, la suspensión de partículas se concentró mediante centrifugación a 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) a 4 C. Se añadió un volumen igual de 2 PBS al producto concentrado para ajustar la presión osmótica.

2.4. Ensayo de retardo en gel

El núcleo de ARNm/protamina se analizó primero mediante retardo en gel. Brevemente, se cargó un núcleo de ARNm/protamina que contenía 0.5 mg de ARNm en el pocillo de un gel de agarosa al 1 % en solución de 1 TBE y se realizó electroforesis a 120 V durante 30 minutos (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hércules, CA). Las bandas de ARN se tiñeron con Gelred (Biotium, Hayward, CA) y se detectaron con un sistema GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Caracterización de partículas de vacuna de ARNm.

La distribución de tamaño y el potencial zeta se midieron con Zetasizer de dispersión dinámica de luz (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, EE. UU.). La tasa de encapsulación se determinó utilizando un kit de ensayo de ARN Quant-iT™ RiboGreen™. Brevemente, se diluyó una muestra de partículas de vacuna que contenía 0.5 mg de ARNm con un tampón TriseEDTA (TriseHCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, pH 7,5) con o sin Triton-X100 al 2 % en un 0. {10}}placa de pocillos. Después de 10 minutos de incubación a 37 C, se añadió RiboGreen a cada pocillo y se midió la intensidad fluorescente. La eficiencia de encapsulación se calculó como se muestra en la ecuación. (1): La microscopía electrónica de transmisión (TEM) de las partículas de la vacuna se realizó siguiendo un procedimiento descrito previamente9.

2.6. animales

Todas las operaciones con animales fueron aprobadas por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Hospital Metodista de Houston (número de protocolo AUP06200042). Los ratones se alojaron en un entorno que cumplía completamente con los estándares regulatorios del Instituto Nacional de Salud y de la Asociación Estadounidense de Cuidado de Animales de Laboratorio. Se adquirieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje y ratones modificados genéticamente, incluidos ratones Tlr7/, Sting/, Mavs/ y Trif/, de Jackson Laboratory.

2.7. Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea murina (BMDC)

Las células de la médula ósea se eliminaron del fémur y la tibia con RPMI 1640 completo. Los glóbulos rojos se lisaron con un tampón de lisis ACK y las células inmaduras de la médula ósea se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 20 ng/ml de GM-CSF murino recombinante durante 10 días a 37 C con 5% de CO2. El medio de cultivo celular se renovó los días 3, 6 y 8, y las células dendríticas no adherentes se recogieron el día 10.

2.8. Medición de citocinas y quimiocinas.

Se sembraron BMDC en una placa de 24-pocillos a una densidad de 5  105 células/pocillo. Después de 1 h de asentamiento, las células se trataron con 1 mg/ml de imiquimod, 20 mg/ml de 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml de equivalente de ARNm) o controles. Se recogieron medios de cultivo celular 24 h después y se midieron los niveles de TNF-a, CCL5, IFN-b e IL-1b utilizando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) siguiendo los procedimientos sugeridos por el fabricante.

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2.9. Análisis sobre transfección de DC, maduración y estimulación de DC.

Para analizar la eficiencia de la transfección de DC in vitro, se sembraron células DC2.4 a razón de 2,5 105 células/pocillo en una placa de 24-pocillos. Las células se trataron con partículas encapsuladas de ARNm que codifican eGFP o luciferasa a una concentración final de 1 mg de ARNm/ml. Las células se recogieron 24 h después, se lavaron con FBS al 2 % en solución de PBS y luego se resuspendieron en la misma solución antes de aplicarlas para el análisis de citometría de flujo con un citómetro de flujo BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, San José, CA). . Para medir la maduración de las DC y la presentación de antígenos in vitro, se sembraron BMDC a razón de 2,5  105 células/pocillo en una placa de 24-pocillos y se trataron con 1 mg/ml de OVA-MVP durante 24 h. Las BMDC se tiñeron durante 30 minutos con anticuerpos específicos para CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 y CD86 para la maduración de DC y anti-H-2Kb (SIINFEKL) para la presentación de antígenos. Para determinar la potencia estimulante in vivo, se vacunaron ratones C57BL/6J una vez con 10 mg de OVA-MVP por ratón en la almohadilla plantar y se recolectaron LN poplíteos drenantes 24, 48 y los siguientes marcadores de superficie celular: CD11c, MHC I, CD11b, B220. , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Análisis de citometría de flujo sobre la activación y proliferación de células T.

Para medir la activación de las células T in vivo, los ratones se vacunaron una vez con 10 mg de OVA-MVP y se aislaron LN poplíteos a las 24 o 48 h. Las células T se tiñeron con los siguientes anticuerpos: CD45, CD3, CD4, CD8 y CD69. Para detectar células T específicas de antígeno, se recolectaron tumores, bazo y ganglios linfáticos poplíteos 5 días después de la segunda vacunación. Los tejidos se procesaron para generar suspensiones unicelulares y las células se tiñeron con anticuerpos específicos de células T y dextrámero OVA257e264-MHCI siguiendo las instrucciones del fabricante. Para medir el nivel de IFN-g intracelular, se estimularon 2  106 esplenocitos o células aisladas de LN poplíteos y tumores con 10 mg/ml de péptido OVA257e264 en medio RPMI 1640 completo suplementado con 55 mmol/L de b-mercaptoetanol y 1 inhibidor del transportador de proteínas. cóctel durante 18 h. Las células se recogieron y se tiñeron con anticuerpos específicos de células T. Después de la fijación y permeabilización con el kit Cytofix/Cytoperm, las células se tiñeron con anticuerpo anti-IFN-g y se aplicaron para su análisis en un citómetro de flujo BD LSR II (BD Biosciences). Para medir la proliferación de células T, se aislaron células T del bazo de ratones transgénicos OT-I utilizando un kit de aislamiento de células T de ratón. Se tiñeron con 1 mmol/l de CFSE en RPMI 1640 que contenía 200 mg/ml de BSA durante 10 minutos a 37 °C. Las células T marcadas con CFSE se lavaron dos veces con 5 volúmenes de RPMI 1640 completo frío. Mientras tanto, las BMDC maduras se trataron con MVP encapsulado en ARNm de OVA de 2 mg/ml durante 24 h antes del aislamiento de células T. Una vez que las células T estuvieron listas, las BMDC y las células T se cultivaron conjuntamente en una proporción de 1:5 (DC: T) durante 72 h. Las células se recogieron y se tiñeron con anticuerpos de superficie para células T, se probó la proliferación utilizando un citómetro de flujo BD LSR II (BD Biosciences) y se analizó. Todos los resultados de la citometría de flujo se analizaron con el software FlowJo v10 (Ashland, OH, EE. UU.).

2.11. Seguimiento de la expresión de proteínas en ratones vivos

Los ratones BALB/c fueron tratados mediante inyección intra-almohadilla con 10 mg de MVP encapsulado en ARNm de Luc. Se les inyectó por vía intraperitoneal 30 mg de RediJect D-luciferina por ratón 6, 12, 24 o 48 h después, y se midió la bioluminiscencia con el sistema de imágenes Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, EE.UU.).

2.12. ensayo ELISpot

Las placas de filtro IP se enjuagaron previamente con 50 ml de etanol al 35 % y se lavaron minuciosamente 3 veces con PBS antes de que el etanol se evaporara. Posteriormente, las placas se recubrieron con anticuerpos de captura anti-IFN-g a 4°C durante la noche. Las placas se bloquearon con medio completo RPMI 1640 que contenía b-mercaptoetanol 55 mmol/l durante 2 h a 37 °C. Se sembraron células (1  105 esplenocitos, 1  105 células de LN poplítea) en cada pocillo y se estimulado durante 36 h con 10 mg/ml de péptido OVA257e264. Se descartaron los medios y las células se lavaron 4 veces con PBST (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%) y dos veces con PBS. Después del lavado final, se añadió un anticuerpo de detección anti-IFN-g y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Las placas se lavaron 4 veces con PBST y dos veces con PBS, se añadió avidina-HRP y se incubaron durante otros 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, las placas se lavaron nuevamente con PBST y PBS como se describió anteriormente, y se aplicaron 50 ml de sustrato AEC y se observó la reacción puntual. Cuando las manchas se hicieron visibles, se detuvo la reacción desechando el sustrato de AEC y lavándolo con agua bidestilada 5 veces. Después de secarlas al aire durante la noche, las placas se escanearon y analizaron utilizando el analizador ELISpot CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, EE. UU.).

2.13. Análisis de Western Blot

Se recolectaron BMDC derivadas de ratones Mavs KO o Sting KO de tipo salvaje y las células se lisaron en tampón de lisis celular RIPA suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. La concentración de proteínas en el lisado celular se midió con un kit de ensayo de proteínas BCA. Las muestras de proteínas se separaron con electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). La expresión de MAVS y STING se detectó después de que la membrana se incubara con un anticuerpo anti-MAVS o anti-STING a una dilución de 1:2000, seguido de inmunodetección con SuperSignal West Pico y sustrato quimioluminiscente femto. Para medir la activación de la vía STING, los BMDC derivados de ratones de tipo salvaje se trataron con vehículo o MVP encapsulado en ARNm de OVA a la concentración indicada durante 2 h. Las células se lisaron y se procedieron al análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-TBK1 y antifosfo-TBK1 a una dilución 1:2000.

2.14. Ensayo antitumoral

Se generaron modelos de tumores murinos inoculando 2  105 células B16-células de melanoma OVA o 5  105 MC38-células OVA por ratón por vía subcutánea en el flanco izquierdo de 6 a {{5} } ratones hembra C57BL/6J de una semana de edad. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento y se trataron dos veces separados por 7 días con 10 mg de OVA MVP o controles en la almohadilla plantar. El crecimiento del tumor se controló cada 2 días. El volumen del tumor se calculó según la ecuación. (2):

Los ratones fueron sacrificados 5 días después de la segunda vacunación y se registró el peso de los tejidos tumorales.

2.15. análisis estadístico

Todos los resultados se presentan como SEM medio. Las estadísticas se evaluaron con una prueba ANOVA unidireccional utilizando la corrección de Tukey para la comparación de múltiples grupos y una prueba t de dos colas no apareada para la comparación de dos grupos. Los datos se analizaron con el software GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 se consideró estadísticamente significativo (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Resultados

3.1. MVP media la expresión robusta de ARNm en células dendríticas (DC)

Preparamos partículas de vacuna núcleo-cubierta en un enfoque de microfluidos de dos pasos (Fig. 1A) y evaluamos sistemáticamente componentes individuales en la nanopartícula para ensamblar una partícula de vacuna con alta estabilidad, alta absorción celular y alto potencial de expresión en CD. La electroforesis en gel reveló que se podía formar un núcleo de ARNm estable una vez que la relación entre ARNm y protamina fuera de 1 o inferior (Fig. 1B). Utilizando el ARNm que codifica eGFP como marcador sustituto, encontramos que una composición de lípidos en una proporción molar de 34% EDOPC/30% DOPE/35% colesterol/1% DSPEPEG2k proporcionó una tasa de encapsulación ideal y la mejor eficiencia de expresión (Tabla 1, Información de respaldo Fig. S1AeS1D). La alteración de la relación de carga no cambió significativamente la tasa de encapsulación, el índice de polidispersidad o la carga superficial de las partículas (Tabla 2, Fig. 1CeE); sin embargo, el tamaño de las partículas resultantes tenía entre 70 y 80 nm de diámetro cuando la proporción estaba entre 12 y 16, en comparación con un diámetro de 120 a 130 nm una vez que la proporción estaba fuera del rango (Fig. 1F y G). La mejor expresión se detectó en células DC2.4 tratadas con MVP2 que tenían una relación de carga de 12 (Fig. 1H y I). Se observó un patrón similar cuando se prepararon partículas con ARNm que codifica luciferasa y se detectó una expresión dependiente de la dosis (Fig. 1J). Las partículas encapsuladas en ARNm demostraron una estabilidad deseable ya que no perdieron actividad después de la liofilización o la congelación-descongelación (Fig. S1E y S1F). Además, no hubo citotoxicidad después de que las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) se trataran con el núcleo de ARNm solo, una partícula vehículo preparada sin moléculas de ARNm o MVP2 que contiene ARNm (Fig. 1K). Por tanto, MVP2 mostró el mejor potencial de expresión. Se utilizó para todos los experimentos posteriores del estudio y se etiquetó como MVP en el resto del texto. Las partículas de MVP podrían administrar eficazmente moléculas de ARNm in vivo, y no hubo toxicidad detectable del MVP encapsulado en ARNm según los cambios de peso corporal (Fig. S1GeS1I).

3.2. MVP induce eficazmente la presentación de antígenos y la activación de células T in vitro e in vivo

Preparamos el núcleo de ARNm, el vehículo libre de ARNm y el MVP encapsulado en ARNm de OVA, y los aplicamos para probar la maduración de DC y la presentación de antígeno (Fig. 2A). Los BMDC tratados con MVP mostraron una sobreexpresión dependiente de la dosis de marcadores de maduración de DC, incluidos CD40, CD80 y CD86 (Fig. 2BeD). El tratamiento con el vehículo libre de ARNm o con MVP encapsulado en ARNm desencadenó la sobreexpresión de MHC I (Fig. 2E), lo que indica que el efecto se asoció con el vehículo en lugar del complejo de ARNm. Además, el tratamiento con MVP dio como resultado la visualización en la superficie celular del complejo epítopo del antígeno-MHC I OVA257e264 (SIINFEKL-MHC I) que se detectó con un anticuerpo anti-SIINFEKL-MHCI (Fig. 2F), lo que demuestra un procesamiento y presentación de antígenos efectivos por parte de BMDC. . Además, la coincubación de BMDC tratadas con MVP con B3Z, una línea de células T CD8þ que reconocía específicamente el epítopo OVA257e264, o células T aisladas del bazo de un ratón OT-I que expresaba una célula T específica de OVA257e264- receptor, desencadenó la secreción de IL-2, un resultado que no se observó en células T coincubadas con CD tratadas con vehículo solo o con el núcleo de ARNm/protamina solo (Fig. 2G). El análisis de citometría de flujo detectó un 32,5% de células T CD8+ proliferativas después de la coincubación con MVP (Fig. 2H y I). También se aplicaron partículas de MVP encapsuladas en ARNm de OVA para tratar ratones mediante inyección intradérmica. El examen de las células en los ganglios linfáticos de drenaje reveló un aumento constante en la expresión de CD86 entre las DC clásicas (CD8+ DC, CD11b+ DC, CD103+ DC) y las DC plasmocitoides (pDC) durante las primeras 48 h, lo que indica estimulación de las DC. maduración (Fig. 2J). El tratamiento también promovió el enriquecimiento de células T CD8þ en los ganglios linfáticos, con un aumento significativo en la población de células T CD69þCD8þ (Fig. 2K y L), lo que indica la activación de las células T por el tratamiento. Para determinar la activación de las células T, recolectamos células en los ganglios linfáticos de drenaje 3, 5 o 7 días después del tratamiento con MVP y realizamos análisis ELISpot después de que las células fueron expuestas al péptido antígeno OVA257e264 (Información de respaldo, figura S2). El tratamiento con MVP desencadenó un gran salto en las células secretoras de IFN-g durante ese tiempo, con una actividad máxima el día 5 (Fig. 2M). Estos resultados demostraron una sólida estimulación de DC, presentación de antígenos y activación de células T después del tratamiento con MVP.

Tabla 1 Composición de nanopartículas encapsuladas con ARNm que codifica eGFP.

Tabla 2Composición de lípidos y relación de carga de MVP.partículas.

3.3. MVP provoca una potente inmunidad antitumoral en modelos murinos de tumor colorrectal y melanoma

Se aplicó MVP para tratar ratones con cáncer de colon MC38 y melanoma B16. En ambos modelos, el tratamiento con MVP encapsulado en ARNm de OVA bloqueó completamente dos veces el crecimiento del tumor por vía subcutánea; en comparación, el tratamiento con MVP encapsulado en ARNm de eGFP o vehículo solo no tuvo ningún efecto inhibidor detectable sobre el crecimiento del tumor (Fig. 3AeD, Información de respaldo, Fig. S3). De acuerdo con el patrón de cambio de CD4 a CD8 en los ganglios linfáticos (Fig. 2), observamos un aumento en la proporción de células T CD8+/CD4+ en tumores de ratones tratados con MVP encapsulado en ARNm de OVA (Fig. 3E). Además, detectamos niveles elevados de células T IFN-g+CD8+ en el bazo, los ganglios linfáticos y los tumores en ratones tratados con MVP encapsulado en ARNm de OVA, pero no con vehículo solo o MVP encapsulado en ARNm de GFP (Fig. 3FeH, Información de respaldo). Figura S4). Además, hubo un aumento significativo en las células T CD8+ positivas para dextrámero OVA257e264-MHCI en tumores del grupo de tratamiento con MVP encapsulado en ARNm de OVA, lo que indica proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno (Fig. 3I). El ensayo ELISpot con células aisladas del bazo y los ganglios linfáticos proporcionó mayor apoyo a la activación de las células T (Fig. 3JeM).

3.4. MVP estimula las respuestas inmunes innatas activando la señalización dependiente de STING

Aplicamos un núcleo de ARNm, un vehículo libre de ARNm y un MVP encapsulado en ARNm para tratar las BMDC con el fin de identificar factores y vías clave responsables de la estimulación del IFN tipo I y la expresión de citocinas inflamatorias. Curiosamente, MVP fue tan potente como el imiquimod, agonista de Tlr7, para desencadenar la secreción de IFN-b, y el vehículo solo también mostró actividad para promover la secreción de IFN-b, aunque su potencia no fue tan alta como la de MVP; sin embargo, el núcleo de ARNm por sí solo fue ineficaz para estimular la secreción de IFN-b (Fig. 4A). El resultado implicaba que se necesitaban tanto el ARNm como los componentes del vehículo para maximizar la expresión de IFN-b. Mientras tanto, imiquimod y vehículo mostraron una actividad similar en la promoción de la expresión de TNF-a e IL-1b, mientras que MVP fue mucho más potente que cualquiera de ellos (Fig. 4B y C). La expresión de CCL5, una citocina comúnmente asociada con factores reguladores de NF-kB e IFN, se estimuló igualmente en células tratadas con imiquimod, vehículo solo o MVP (Fig. 4D). TLR7, MAVS, STING y TRIF son factores clave en las principales vías de transducción de señales que median las respuestas celulares al ARN viral y al ADN dañado28e30. Generamos BMDC a partir de ratones con desactivación genética (KO) de Tlr7, Mavs, Sting o Trif y tratamos células con núcleo de ARNm, vehículo libre de ARNm o MVP encapsulado en ARNm para examinar la expresión de IFN-b y TNF-a.

Figura 2 Estimulación de respuestas inmunes por MVP. (A) Vista esquemática del núcleo de ARNm/protamina, vehículo libre de ARNm y MVP completo. (BeD) Maduración de BMDC después de ser tratados con OVA-MVP durante 24 h. (E y F) Expresión de MHC I y complejo de epítopo del antígeno OVA257e264-MHC I en BMDC después de ser tratados con OVA-MVP durante 24 h. (G) Nivel de IL-2 de BMDC tratadas co-incubadas con células T B3Z u OT-I. (H e I) Análisis de citometría de flujo de células T proliferativas. Se muestran cromatogramas representativos de células T. (J) Maduración de DC después del tratamiento con MVP in vivo. Se trataron ratones C57BL/6J con OVA-MVP y se analizaron las CD en los ganglios linfáticos poplíteos. (K y L) Análisis de población de células T. Se trataron ratones C57BL/6J con vehículo u OVA-MVP, y las células T en los ganglios linfáticos poplíteos se analizaron con citometría de flujo. (M) ensayo ELISpot. Se trataron ratones C57BL/6J con OVA-MVP y se recogieron ganglios linfáticos en los momentos indicados. Se aplicaron células aisladas para la medición de células que expresan IFN-g. Los datos se presentan como media SEM (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, no significativo.

Figura 3 Actividad antitumoral de MVP. (A) Inhibición del crecimiento del tumor MC38-OVA. Se inocularon ratones hembra C57BL/6J por vía subcutánea con células tumorales 5  105 MC38-OVA/ratón el día 0 y se trataron con control de PBS, control de vehículo, GFP-MVP u OVA-MVP el día 0 Días 3 y 10. (B) Inhibición del crecimiento del tumor B16-OVA. Se inocularon ratones hembra C57BL/6J por vía subcutánea con células tumorales 2  105 B16-OVA/ratón el día 0 y se trataron con control de PBS, control de vehículo, GFP-MVP u OVA-MVP. los días 3 y 10. (C y D) Imagen y peso de los tumores B16-OVA el día 17. (E) Población de células T en tumores de ratones postratamiento. (FeH) Células T IFN-gþCD8þ en bazos, ganglios linfáticos (LN) y tumores de ratones postratamiento. (I) Células T CD8þ específicas de OVA en tumores de ratones postratamiento. (JeM) Imágenes y análisis cuantitativo del ensayo ELISpot de células esplénicas y LN de ratones postratamiento. Los datos se presentan como media SEM (n Z 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.

El estado de KO de Mavs y Sting en BMDC se confirmó con análisis de transferencia Western (Información de respaldo, figura S5A). Sorprendentemente, Sting KO eliminó la actividad estimulante sobre la secreción de IFN-b tanto del vehículo solo como de MVP (Fig. 4E), lo que indica que MVP activó la expresión de IFN tipo I a través de STING. Para respaldar la idea, detectamos la fosforilación de la quinasa 1 de unión al tanque (TBK1) (Fig. S5B), una quinasa que se asocia comúnmente con la actividad STING31. Además, esta vía era independiente de la señalización de TLR7, ya que la expresión de IFN-b no se vio comprometida en las células tratadas con imiquimod (Fig. 4E). En comparación, Trif o Mavs KO tuvieron un impacto mínimo en la expresión de IFN-b promovida por MVP. Como se esperaba, el imiquimod fue ineficaz para estimular la secreción de IFN-b en BMDC derivadas de Tlr7 KO; sin embargo, Tlr7 KO tuvo un impacto negativo en el efecto estimulante de MVP (Fig. 4E). Curiosamente, se observó un perfil diferente en la secreción de TNF-a de los mismos tratamientos. La eliminación de Sting, Trif o Tlr7 tuvo un impacto mínimo o nulo en la expresión de citoquinas estimuladas por MVP. La eliminación de Mavs, por otro lado, redujo drásticamente los niveles de TNF-a en las células tratadas con vehículo solo o con MVP (Fig. 4F). El resultado indica que MAVS es un regulador clave de la expresión de TNF-a en las CD tras el tratamiento con MVP.

3.5. MVP estimula las vías STING y MAVS para promover la secreción de IFN-I y citocinas inflamatorias

Para identificar los componentes en el vehículo responsables de la estimulación de la señalización STING y MAVS, preparamos vehículos y MVP reemplazando u omitiendo componentes clave y los aplicamos para tratar los BMDC. El GMP-AMP cíclico (cGAMP) agonista de Sting sirvió como control positivo para estimular la secreción de IFN-b. Reemplazar el lípido catiónico EDOPC en el vehículo con otro lípido cargado positivamente, DOTAP, eliminó por completo la secreción de IFN-b. En comparación, el efecto estimulante del vehículo y MVP se mantuvo con o sin protamina, y dicha actividad estimulante dependía de un gen Sting intacto (Fig. 4G). Curiosamente, los BMDC tratados con componentes individuales de la cubierta lipídica, incluido EDOPC, no promovieron una fuerte secreción de IFN-b (Información de respaldo, figura S6). Por lo tanto, EDOPC fue esencial para la activación de STING y su actividad depende de la formación de una nanopartícula lipídica (es decir, vehículo o MVP). También se aplicaron vehículo y MVP preparados con EDOPC o DOTAP para tratar BMDCS derivados de ratones KO Mavs y de tipo salvaje, y se determinaron los niveles de TNF en medios de crecimiento celular. Como se esperaba, reemplazar EDOPC con DOTAP o DOPC eliminó el esfuerzo de estimulación del vehículo y MVP. Además, el nivel de TNF-a se redujo significativamente en las células Mavs KO en comparación con las células de tipo salvaje, pero no disminuyó (Fig. 4H), lo que indica que factores adicionales podrían estar involucrados en la mediación de la expresión de TNF-a estimulada por MVP.

3.6. La vía STING es esencial para las respuestas inmunes antitumorales mediadas por MVP

Tanto los ratones de tipo salvaje como los knockout se trataron con MVP encapsulado en ARNm de OVA y se examinaron la maduración de las CD y la proliferación de células T. Sting KO redujo significativamente el porcentaje de células CD80þ y CD86þ DC y células T CD69þ (Fig. 5AeD). El ensayo ELISpot reveló células productoras de IFN-g significativamente reducidas en el bazo y los ganglios linfáticos de ratones Sting KO en comparación con ratones de tipo salvaje después de que fueron tratados con la misma dosis de MVP (Fig. 5EeH). El impacto de Mavs KO fue mínimo, ya que no se monitorearon diferencias en las células T de memoria CD44þCD8þ, las células T CD8þ positivas para dextrámero OVA257e264-MHCI o el número de células productoras de IFN-g en los ganglios linfáticos en comparación con las células salvajes. ratones tipo (Fig. 5IeL). El resultado refuerza la idea de que factores adicionales además de MAVS pueden estar involucrados en la expresión de citocinas inflamatorias estimuladas por MVP. Se aplicaron ratones tanto de tipo salvaje como Sting KO para inocular tumores B16-OVA, y los ratones se trataron con control de PBS o MVP encapsulado en ARNm de OVA. El análisis de citometría de flujo en muestras de ganglios linfáticos y tumores recolectadas de ratones vacunados reveló una cantidad significativamente reducida de células T CD8+ productoras de IFN-g en los ratones Sting KO (Fig. 6A y B). Como resultado, el crecimiento del tumor se inhibió completamente en ratones de tipo salvaje tratados con MVP, en comparación con solo una inhibición parcial en los ratones Sting KO (Fig. 6C).

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4. Discusión

En el estudio actual, hemos examinado sistemáticamente las funciones funcionales de los componentes individuales del MVP en la estimulación de las respuestas inmunes antitumorales. Nuestro estudio basado en células ha demostrado claramente que tanto las moléculas de ARNm como el vehículo libre de ARN en MVP son necesarios para su plena actividad en la promoción de la expresión de IFN-b y una serie de citoquinas inflamatorias, incluidas IL-1b y TNF. -a en células dendríticas. Se ha demostrado que dichas citocinas desempeñan funciones esenciales en la activación de las células dendríticas y la inmunidad antitumoral mediada por vacunas20. Nuestro estudio también ha revelado que la estimulación de la producción de citoquinas depende de una serie de vías clave de transducción de señales involucradas en la detección inmune innata, incluidas aquellas mediadas por STING y MAVS. Si bien STING es esencial para la expresión de IFN-b, MAVS participa principalmente en la regulación de la expresión de TNF-a (Fig. 6D). La importancia de la señalización de STING en la inmunidad antitumoral mediada por MVP se demuestra aún más por la reducción de la actividad de las células T y, en consecuencia, la inhibición comprometida del crecimiento tumoral en ratones Sting KO. Este resultado está en línea con otros informes de que la activación de STING determina la inmunidad antitumoral mediada por células T citotóxicas32. MAVS es un intermediario clave en la señalización del receptor RIG-I (RLR) en respuesta a una infección viral. La activación de esta vía conduce a una cascada de respuestas inflamatorias33. Es intrigante que la actividad de las células T no se vea comprometida en los ratones Mavs KO, dado que la señalización de MAVS claramente desempeña un papel importante en la regulación de la expresión de citocinas inflamatorias, incluido el TNF-a. Una posible razón es que la estimulación de dichas citoquinas por parte de MVP está mediada por múltiples vías, y la interrupción de la vía MAVS no reduce la expresión de citocinas a un nivel lo suficientemente bajo como para causar un impacto significativo. Alternativamente, la pérdida de señalización MAVS se compensa con otras vías. Se necesitan más estudios para identificar estas vías y comprender mejor el mecanismo de acción de la vacuna MVP. Aunque TLR7 se ha asociado tradicionalmente con terapias de ARNm21, la señalización de TLR7 no parece desempeñar un papel importante en la mediación de la actividad de MVP. La aplicación de moléculas de ARNm completamente metiladas en el estudio actual puede haber hecho que la señalización de TLR7 sea menos relevante. Está bien demostrado que la metilación del ARN suprime el reconocimiento por parte de los TLR23. TRIF es una proteína adaptadora clave para la señalización TLR3/7/828. La eliminación de Trif tampoco afecta la actividad de MVP, lo que refuerza la idea de que los TLR anteriores, incluido el TLR7, no desempeñan un papel importante en la mediación de las respuestas celulares a MVP. Se han aplicado múltiples agonistas de Sting en el desarrollo de vacunas contra el cáncer, incluidos dinucleótidos cíclicos y compuestos moleculares pequeños y grandes34-37. Estos agonistas de Sting deben añadirse como adyuvantes externos durante la preparación de la vacuna, lo que añade otra capa de complejidad a la composición de la vacuna. Además, el agonista de Sting añadido externamente puede causar efectos adversos indeseables una vez que se separa del complejo de ARNm. En comparación, nuestro MVP sirve como autoadyuvante y funciona en el contexto de una vacuna contra el cáncer, ya que ninguno de los componentes individuales de la vacuna, incluido EDOPC, puede promover la expresión de citocinas. Curiosamente, el fosfolípido catiónico EDOPC no se puede reemplazar con el no fosfolípido DOTAP, que también está cargado positivamente. Es intrigante especular sobre el posible mecanismo de la diferencia entre estos dos lípidos catiónicos. Sin embargo, se ha documentado que otras propiedades de un componente de una molécula lipídica, como la hidrofobicidad, pueden tener un profundo impacto en la función general de una nanopartícula y su eficacia en la liberación de ácidos nucleicos38. Por tanto, se debe tener cuidado al seleccionar las moléculas adecuadas para preparar una vacuna de ARNm completamente funcional. En resumen, hemos desarrollado una potente vacuna terapéutica contra el cáncer basada en ARNm y hemos asignado componentes individuales de la vacuna con su funcionalidad. Su mecanismo de acción es bastante diferente al de otras plataformas de ARNm utilizadas para intervenciones profilácticas y terapéuticas. El conocimiento derivado del estudio actual definitivamente guiará el desarrollo futuro de terapias de ARNm adicionales.

Figura 4 Promoción de respuestas inmunes innatas por MVP. (AeD) BMDC tratados con 1 mg/ml de imiquimod, 1 mg/ml de núcleo equivalente a ARNm, vehículo o MVP durante 24 h. Los niveles de IFN-b, TNF-a, IL-1b y CCL5 se midieron con ELISA. (E y F) Expresión de IFN-b y TNF-a de BMDC derivadas de ratones de tipo salvaje y con genes knockout (KO). Las BMDC se trataron con los reactivos indicados durante 24 h. El IFN-b y el TNF-a se midieron con ELISA. (G) IFN-b en BMDC derivados de ratones de tipo salvaje y con inactivación de Sting. Las BMDC se trataron con 20 mg/ml de cGAMP, 1 mg/ml de núcleo equivalente a ARNm, vehículo o MVP durante 24 h. Vehículo (DOTAP): preparado reemplazando EDOPC por DOTAP; vehículo (sin protamina): preparado omitiendo la protamina. ND: no detectable. (H) TNF-a en BMDC derivados de ratones knockout para Mavs y de tipo salvaje. Las BMDC se trataron con 1 mg/ml de núcleo, vehículo o MVP equivalente a ARNm durante 24 h. Vehículo (DOTAP): preparado reemplazando EDOPC por DOTAP; Vehículo (DOPC): preparado reemplazando EDOPC por DOPC. Los datos se presentan como media SEM (n Z 3). ***P<0.005; ****P < 0,001; ns, no significativo.

Figura 5 Respuestas inmunes antitumorales en ratones knockout para Sting y Mavs. (AeD) Disminución de la activación de células T y DC en ratones Sting knockout. Tanto los ratones de tipo salvaje como los de Sting knockout se trataron con MVP encapsulado en ARNm de OVA y se recolectaron ganglios linfáticos 48 h después para medir las células DC y T. (EeH) Células T que expresan IFN-g reducidas en el bazo y los ganglios linfáticos de ratones knockout para Sting. Se muestran tanto imágenes de manchas como análisis cuantitativos. (IeL) No hay impacto en la actividad de las células T en ratones knockout para Mavs. Tanto los ratones de tipo salvaje como los ratones knockout para Mavs se trataron con control de PBS o MVP encapsulado en ARNm de OVA, y los ganglios linfáticos se recolectaron 48 h después para medir las células T de memoria CD44+CD8+ (I), OVA257e264-CD8+ con dextrámero MHCI positivo. Células T (J) y número de células productoras de IFN-g (K y L). Los datos se presentan como media SEM (n Z 3 o 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, no significativo.

Figura 6 Inmunidad antitumoral dependiente de picadura. (A y B) Análisis de células T que expresan IFN-g en ganglios linfáticos y tejidos tumorales después de que ratones de tipo salvaje y Sting knockout portadores de tumores B16-OVA se trataran con MVP encapsulado en ARNm de OVA. Los ratones se trataron los días 3 y 10, y los ganglios linfáticos y los tumores se recogieron el día 15. Las células individuales se analizaron con citometría de flujo. (C) Inhibición del crecimiento tumoral en ratones de tipo salvaje y con inactivación de Sting. Los ratones fueron tratados con control de PBS o MVP los días 3 y 10. Los datos se presentan como media SEM (n Z 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, no significativo. (D) Vista esquemática de la estimulación por MVP de las vías de transducción de señales que conducen a la producción de citoquinas en las CD. Si bien la estimulación de la expresión de IFN-b está mediada exclusivamente por STING, existen múltiples factores, incluido MAVS, que median la expresión de TNF-a e IL-1b.

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