Abstracto

La demanda de sustancias naturales con actividad antimelanogénica está aumentando debido al reciente interés en el blanqueamiento de la piel. Investigación intensiva sobre el caldo de cultivo de Streptomyces sp. SCO-736, una bacteria marina de la costa de la Antártida, ha llevado al aislamiento de un nuevo producto natural llamado asteroide (1). La estructura química se estableció mediante la interpretación de datos espectroscópicos de MS, UV y NMR. Antaroide es un macrólido de nueve miembros con fracciones de lactona y lactama. Para investigar su aplicabilidad en cosméticos para blanquear la piel, se examinó su actividad antimelanogénica en células de melanoma murino B16F10. Como resultado, el asteroide mostró fuertes actividades inhibitorias contra la síntesis de melanina y también atenuó la formación de dendritas inducida por la hormona estimulante de melanocitos (-MSH). Antaroide suprimió la expresión de ARNm de enzimas melanogénicas como tirosinasa, TRP-1 y TRP-2. Esto sugiere que puede servir como un regulador transcripcional de la melanogénesis. En conjunto, el descubrimiento de este novedoso macrólido natural de nueve miembros y su actividad antimelanogénica podría brindar nuevos conocimientos sobre el desarrollo de agentes blanqueadores de la piel.

Según estudios relevantes, la cistanche es una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente es el cistanosido, que tiene diversos efectos como antioxidante, antiinflamatorio y promotor de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana se produce por la oxidación de la tirosina catalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, inhibiendo así la producción de melanina.

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Palabras clave:Streptomyces sp., macrólido de nueve miembros, producto natural marino, inhibidor de la síntesis de melanina, agente blanqueador de la piel

INTRODUCCIÓN

La pigmentación de la piel es crucial para proteger la piel, que es la capa más externa del cuerpo. En particular, la melanina absorbe los rayos ultravioleta (UV) y extingue las especies reactivas de oxígeno dañinas, que son perjudiciales para la fisiología de los queratinocitos y melanocitos (Costin y Hearing, 2007). Además de la protección de la piel, la melanina determina el color del cabello, la piel y los ojos. Su contenido o distribución anormal puede causar problemas estéticos como albinismo, pecas y melasma (Briganti et al., 2003; Lee et al., 2015).

El uso de agentes blanqueadores de la piel con fines cosméticos está creciendo rápidamente, especialmente en Asia, donde la piel blanca y sin manchas simboliza la belleza y la nobleza. Se han desarrollado y utilizado muchas sustancias para blanquear la piel, tanto terapéutica como cosméticamente, incluidas la hidroquinona, la arbutina y el ácido kójico. Sin embargo, la exposición a largo plazo a estos agentes suele causar reacciones adversas como irritación de la piel, ocronosis y dermatitis de contacto (DeCaprio, 1999; García-Gavín et al., 2010). Por lo tanto, se requieren agentes blanqueadores de la piel más seguros y potentes (Zhu y Gao, 2008; Atanasov et al., 2015; Aydogmus-Ozturk et al., 2018).

Los investigadores están prestando cada vez más atención a los microorganismos en ambientes marinos únicos, que son fuentes fértiles de compuestos bioactivos con andamios estructurales interesantes, para descubrir nuevos metabolitos secundarios (Haefner, 2003; Fenical y Jensen, 2006).

Como parte de nuestra búsqueda de productos naturales marinos bioactivos, una bacteria que vive en agua fría, Streptomyces sp. SCO-736 ha sido aislado de los sedimentos marinos de la costa de la Antártida. Esta bacteria produjo un sesquiterpeno antártico de tipo zizaene tricíclico con un grupo fenilo que es citotóxico para las células cancerosas A549, H1299 y U87 al inducir la detención del ciclo celular (Kim et al., 2018). Además, el aislamiento guiado por HPLC-UV del caldo de cultivo de esta cepa ha producido un nuevo compuesto bioactivo, el asteroide (1, fig. 1). En este documento, informamos los detalles de su aislamiento, elucidación de la estructura y la actividad antipigmentaria del asteroide para proporcionar información para desarrollar una nueva clase de agentes para blanquear la piel.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedimientos experimentales generales

La rotación óptica se determinó utilizando un polarímetro Kruss Optronic P{{0}} (Krüss Optronic, Hamburgo, Alemania) con una celda de 5-cm. Los espectros UV se adquirieron con un espectrofotómetro UV-visible (1260 Infinity Series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) utilizando una longitud de trayectoria de 0,1 cm. Los espectros IR se midieron con un espectrómetro Varian Scimitar Series (Agilent Technologies). Los espectros de RMN se adquirieron con espectrómetros Varian Inova de 800 MHz (Agilent Technologies) utilizando dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) para Android. El análisis de espectrometría de masas de bombardeo de átomos rápidos de alta resolución (HRFABMS) se realizó utilizando un sistema JEOL JMS-AX505WA (JEOL, Tokio, Japón). Las fracciones se purificaron con una bomba de HPLC cuaternaria Waters 616 (Waters, Milford, MA, EE. UU.) y un detector de matriz de fotodiodos (PDA) Waters 996 (Waters). -La hormona estimulante de melanocitos (-MSH), la arbutina y el DMSO se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El medio de cultivo celular y los agentes fueron proporcionados por Thermo Scientific (Waltham, MA, EE. UU.).

Aislamiento de cepas y fermentación. 

La cepa de actinomicetos SCO-736 se aisló de los sedimentos marinos de la costa antártica y se identificó como miembro del género Streptomyces con un 99,7 % de similitud. Su secuencia del gen 16s rRNA se depositó en GenBank (número de acceso KY087980). Esta cepa bacteriana se cultivó en 100 2.5-L Ultra Yield Flasks, cada uno con 1 L del medio de cultivo (10 g/L de almidón soluble, 2 g/L de levadura, 4 g/L de L de peptona, 10 g/L de CaCO3, 20 g/L de KBr, 8 g/L de Fe2(SO4)3•4H2O disueltos en 750 mL de agua de mar natural, y 250 mL de agua destilada), a 25°C agitación a 150 rpm. Después de 7 días, el caldo se extrajo con acetato de etilo (EtOAc, 100 l en total) para proporcionar 3,5 g de extracto de EtOAc.

Extracción y purificación 

El extracto de EtOAc se disolvió en un pequeño volumen de metanol (MeOH) y se fraccionó mediante cromatografía en columna de vacío de sílice eluyendo con un gradiente escalonado de 10 por ciento a 100 por ciento de MeOH en cloruro de metileno. La fracción con MeOH al 10 % (618 mg) se sometió a HPLC de fase inversa con acetonitrilo acuoso al 48 % (Watchers 120 ODS-BP, 250 × 10 mm, 5 µm, 2,0 ml/min, UV=210 nm) para producir asteroide (1, 6,7 mg), con tiempos de retención de 30 min.

Antaroide (1): aceite marrón; [ ]D 21 más 19,8 (c0,45, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 225 (4,1), 245 (3,6), 310 (3,2) nm; IR (KBr) νmax 3365, 2936, 2872, 2348, 1660, 1475, 1376, 1197, 761 cm-1; 1H, 13C y 2D-RMN (800 MHz, DMSO-d6), véase la Tabla 1; HRFABMS [M más H] más m/z 362,1972 (calcd para C20H28NO5 más , 362,1962).

Cultivo de células

La línea celular B16F10 de ratones C57BL/6 se adquirió de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). Las células se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar, en medio de Eagle modificado por Dulbecco sin rojo fenol (DMEM) complementado con antibióticos (100 U/mL de penicilina A y 100 U/mL de estreptomicina) y suero fetal bovino (FBS) al 10 por ciento a 37 grados en una atmósfera humidificada que contiene 5 por ciento de CO2. Al 80 por ciento de confluencia celular, las células adherentes se separaron usando una solución de tripsina (Hyclone, South Logan, UT, EE. UU.).

Ensayo de melanina

Un día antes del experimento, las células B16F10 se sembraron en 48-placas de pocillos a 2 × 104 células/pocillo, como se describe en otro lugar (Kim et al., 2017a). Las células privadas de suero se expusieron durante 72 h a diversas concentraciones de asteroides en un medio de cultivo que contenía 0,5 por ciento de DMSO y 200 nM -MSH, se usó -MSH para inducir la síntesis de melanina. Las células tratadas únicamente con -MSH y arbutina se usaron como controles negativo y positivo, respectivamente. La melanina dentro de las células se disolvió en 200 µL de NaOH 1 M a 60 grados durante 1 h en la oscuridad, luego se evaluó el contenido total de melanina mediante mediciones de absorbancia a 405 nm con un lector de microplacas (Spectra max 190, Molecular Devices, Sunnyvale , CA, EE. UU.).

Ensayo de viabilidad celular

Se utilizó bromuro de {{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) para evaluar la viabilidad de la B16F1 0 células (Song et al., 2018). Para ensayar la reducción mitocondrial de MTT, las células se incubaron con 0,25 ml de una solución de MTT de 0,5 mg/ml en DMEM durante 2 horas a 37 grados. El colorante azul de formazán se disolvió en 300 µL de DMSO durante 30 min y se recogieron 150 µL del sobrenadante resultante para medir su absorción a 540 nm. Todas las mediciones se realizaron por triplicado. Los resultados se normalizaron con los del control negativo (células tratadas con DMSO), al tomar los valores de control como 100 por ciento, comparamos la viabilidad celular de cada concentración de asteroide.

Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción en tiempo real (RT-PCR)

Para determinar los efectos de los asteroides en la expresión del gen relacionado con la melanogénesis, adoptamos la técnica de PCR de transcripción en tiempo real. Las células B16F10 se trataron con -MSH y con o sin asteroide. Después de 24 h de incubación, se aisló el ARN total utilizando un Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.). Para determinar los niveles de ARNm de tirosinasa, el ADNc se amplificó con 1250 ng de ARN total con oligo dT (Elpis-Biotech, Seúl, Corea) usando una máquina qPCR (Applied Biosystem, Grand Island, NY, EE. UU.). Las secuencias de los cebadores de PCR fueron las siguientes. Tyrosi nase 5'- ATC GGC CAA CGA TCC CAT TT -3' (hacia delante) y 5'- TAG GTG CAT TGG CTT CTG GG -3' (hacia atrás). TRP-1 5'- CTT TCT CCC TTC CTT ACT GG-3' (hacia delante) y 5'-TCG TAC TCT TCC AAG GAT TCA-3' (hacia atrás). TRP-2 5'- TTA TAT CCT TCG AAA CCA GGA – 3' (hacia delante) y 5' – GGG AAT GGA TAT TCC GTC TTA – 3' (hacia atrás). Los parámetros de ciclado fueron 50 grados por 2 min, 95 grados por 10 min, 40 ciclos a 95 grados por 15 s y 50 grados por 1 min.

análisis estadístico

La significación estadística de las diferencias se evaluó mediante la prueba t de Student o ANOVA seguida de un análisis post-hoc de Bon Ferroni. Significativamente diferente del valor de control: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

RESULTADOS

Elucidación de la estructura química

Antaroide se aisló como un aceite marrón y su fórmula molecular se dedujo como C2{{20}}H27NO5 según el análisis del pico de iones pseudomoleculares (más)-HRFABMS en m/z 362,1972 [M más H] más Su espectro IR mostró la presencia de una amina (3,365 cm-1) ​​y un grupo cetona (1,660 cm-1). El espectro de RMN de 1H mostró 1,2-protones de benceno disustituidos [H-3 (δH 7.99, 1H, d, J=8.0 Hz), H{{21 }} (δH 7,41, 1H, día, J=8.0, 8.0 Hz), H-5 (δH 7,79, 1H, día, J{{ 33}}.0, 8.0 Hz), H-6 (δH 7,95, 1H, d, J=8.0 Hz)], un doblete [H-20 (δH 0,92, 3H, d, J=6,8 Hz)] y un singulete de metilo [H-19 (δH 2,04, 3H, s)]. Los datos espectroscópicos de 1H, 13C y HSQC revelaron dos metilos [C-19 (δC 27,9), C-20 (δC 15,7)], siete metileno [C-9 (δC 29,0) , C-10 (δC 28.5), C-12 (δC 36.3), C-13 (δC 22.6), C-14 (δC 29.1), C{{76} } (δC 26,1), C-16 (δC 31,8)], cuatro metino sp2 [C-3 (δC 129,7), C-4 (δC 125,7), C-5 (δC 135,6), C-6 (δC 120,9)], un metano sp3 [C-17 (δC 45,9)], tres carbonilos [C-1 (δC 161,1), C{{ 102}} (δC 172.2), C-18 (δC 211.8)], dos cuaternarios sp2 [C-2 (δC 116.3), C-7 (δC 136.0)], y un cuaternario carbonos sp3 [C-11 (δC 97.2)] (Tabla 1).

La interpretación de los resultados de la RMN 2D nos permitió definir la estructura del asteroide. Los picos cruzados COSY (H- 9/H-10 y H-12/H-13/H-14/H-15/H{ {8}}/H-17/H{{10}}) reveló dos sistemas de espín compuestos por dos y siete unidades de carbono, respectivamente. Se identificó un grupo acetilo en función de la señal de HMBC de largo alcance del singlete de metilo H-19 a C-18. La unión de este grupo acetilo a C-17 fue confirmada por las señales HMBC de tres enlaces de H-19 a C-17 y de H-20 a C{{19} }. Las conectividades de los grupos carbonilo C-1 y C-8 en C-2 y C-9, respectivamente, también se establecieron en función de las señales de HMBC de tres enlaces de H{ {25}} a C-1 y de H-10 a C-8. Las correlaciones HMBC de largo alcance de H-12 y H-10 a C-11 permitieron la conexión C-10/C-11/C-12 . Los picos cruzados COSY (H-3/H-4/H-5/H-6) revelaron un resto de anillo de benceno disustituido en 1,2 conectado a C{{43} } a través de NH, según los desplazamientos químicos del carbono de C-7 (δC 136,0) y C-8 (δC 172,2). Los desplazamientos químicos del carbono de C-1 (δC 161,1) y C-11 (δC 97,2) sugirieron que estos carbonos deberían unirse a través de un átomo de oxígeno en la molécula. Por último, el cambio químico de C-11 y la fórmula molecular del asteroide revelaron la unión de un grupo hidroxi en C-11. Por lo tanto, la estructura general del asteroide se determinó como se muestra en la Fig. 2.

Para determinar la estereoquímica de los asteroides, primero realizamos un experimento de dicroísmo circular electrónico (ECD). Desafortunadamente, los asteroides no mostraron ningún efecto Cotton significativo en los rangos de longitud de onda investigados (Fig. 6 complementaria). No pudimos determinar la configuración absoluta del centro estereogénico de C-17 debido a la falta de compuestos relevantes con una estereoquímica asignada en la literatura.

Bioactividades

Se han examinado varios productos naturales de fuentes marinas para aplicaciones en cosméticos (Kim et al., 2017a). Para evaluar la aplicabilidad de los asteroides como agente blanqueador, se estudiaron sus efectos sobre la melanogénesis utilizando células de melanoma murino B16F10 estimuladas con -MSH.

Antaroide mostró una potente actividad antimelanogénica, que disminuyó el contenido de melanina intracelular de las células B16F10 de manera dependiente de la dosis. Fue comparable a la de la arbutina, un conocido agente blanqueador de la piel, mientras que la liberación de melanina extracelular no se vio afectada (Fig. 3).

Las observaciones microscópicas revelaron una formación atenuada de dendritas del B16F10 activado por -MSH, lo que confirma la supresión de la activación de los melanocitos por un asteroide (Fig. 4). En el mismo experimento, la evaluación de la viabilidad celular mostró que el efecto antimelanogénico del asteroide no se debía a la citotoxicidad (Fig. 5). El mecanismo subyacente a la actividad antimelanogénica del asteroide se examinó más a fondo mediante la evaluación de la expresión del ARNm de enzimas clave para la melanogénesis, como la tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 a través de PCR en tiempo real (Fig. 6 ). Los resultados sugirieron que el asteroide puede suprimir la expresión de estas enzimas melanogénicas.

DISCUSIÓN

Los productos naturales pueden proporcionar información para desarrollar sustancias bioactivas con nuevos andamios y modos de acción. Los metabolitos secundarios de nueve miembros que poseen fracciones de lactona y lactama nunca se han informado previamente en productos naturales de heterociclo de tamaño mediano. Los productos naturales que contienen lactonas o lactamas de tamaño mediano han sido objetivos desafiantes en los campos sintéticos durante mucho tiempo (Shiina, 2007; Ferraz et al., 2008). En particular, solo se ha informado de un pequeño número de productos naturales de lactona o lactama de nueve miembros, como halicolactonas (Niwa et al., 1989), topsentolides (Luo et al., 2006) y antimicinas (van Tamelen et al. , 1961). Se han aislado lactonas, halicolactonas y topsentolides de nueve miembros de esponjas marinas, mientras que se aislaron dilactonas y antimicinas de nueve miembros de Streptomyces sp. Además, el desarrollo de la metodología de tales compuestos ha enfrentado dificultades debido a factores cinéticos y termodinámicos desfavorables en comparación con los de los parientes de lactona más grandes (Dräger et al., 1996; Parenty et al., 2013). La copresencia de fracciones de lactona y lactama en el sistema de anillo se ha observado solo en azálidos de 15-miembros, que se prepararon sintéticamente a partir de eritromicina (Mutak, 2007). Dado el número limitado de productos naturales de nueve miembros con restos de lactona y lactama informados hasta ahora, el asteroide es un ejemplo sin precedentes de esta clase de compuestos.

La melanina se sintetiza a partir de L-tirosina mediante enzimas melanogénicas como la tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 (Lee et al., 2013, 2015). Dado que la tirosinasa es clave en la inhibición de la melanogénesis en los melanocitos, sus inhibidores se consideraron candidatos prometedores como agentes blanqueadores de la piel en cosméticos (Pillaiyar et al., 2017). Sin embargo, los inhibidores de la tirosinasa como la hidroquinona, el rododendro o las cetonas de frambuesa pueden causar efectos adversos como la leucodermia al afectar la integridad de los melanocitos (Kim et al., 2016, 2017b, 2019). Por lo tanto, se requieren nuevos agentes blanqueadores de la piel con un nuevo modo de acción y nuevos andamios. Muchos estudios recientes han informado de sustancias naturales que muestran actividad antimelanogénica a través de la regulación transcripcional de las enzimas melanogénicas (Kim et al., 2017a). El presente estudio reveló que la actividad antimelanogénica de los asteroides funciona al modular los niveles de ARNm de tirosinasa, TRP-1 y TRP-2, lo que indica su potencial como agente blanqueador de la piel, lo que justifica una mayor investigación en el futuro.

CONFLICTO DE INTERESES

No existen conflictos de interés que declarar.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiada por el Ministerio de Ciencia y TIC bajo la subvención NRF-2019R1F1A1059033 (a Yang I), 2018R1A5A2025286 (a Lim KM), 2017R1D1A1B03028172 (a Nam SJ).

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