Efectos antienvejecimiento e inhibición de la tirosinasa del extracto butanólico de la flor de la fístula de casia, parte 1

Abstracto

Fondo: Los productos naturales elaborados a partir de fuentes vegetales se han utilizado en una variedad de aplicaciones cosméticas como fuente de nutrición y como agente blanqueador. Las flores de Cassia fistula L, familia Fabaceae, se han utilizado como medicina tradicional para enfermedades de la piel y cicatrización de heridas y se ha informado que poseen propiedades antioxidantes. Se investigó el efecto antienvejecimiento del extracto de flor de C. fistula en fibroblastos de piel humana.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y puede eliminar las especies reactivas de oxígeno, prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Métodos: Se completó la extracción con butanol de las flores de C. fistula y se clasificaron los compuestos activos. La citotoxicidad de los fibroblastos se evaluó mediante un ensayo SRB para seleccionar dosis no tóxicas para experimentos adicionales. Luego se midió la síntesis de colágeno y ácido hialurónico (HA) utilizando el kit de colágeno y ELISA, respectivamente. Además, también se evaluó la actividad enzimática, incluida la colagenasa, matrixmeloproteinasa-2 (MMP-2) y tirosinasa.

Resultados: Se encontró que el extracto de flores no afectó el crecimiento de las células de fibroblastos de la piel (IC50 > 200 ug/mL). Los resultados mostraron que el extracto de flores aumentó significativamente la síntesis de colágeno y HA de manera dependiente de la dosis. El extracto de flor (50–200 ug/mL) también inhibió significativamente la actividad de colagenasa y MMP-2. Además, este extracto de flor podría inhibir la actividad de la tirosinasa que provoca la hiperpigmentación, que induce el envejecimiento de la piel.

Conclusiones: El extracto de flor de C. fistula mostró un efecto preventivo cuando se usó con fines antienvejecimiento en fibroblastos de piel humana y puede ser una opción adecuada para productos cosméticos que tienen como objetivo proporcionar efectos blanqueadores y que están designados como productos para el cuidado de la piel facial antienvejecimiento. .

Palabras clave: Colagenasa, Síntesis de colágeno, Glicosaminoglicano, Ácido hialurónico, Metaloproteinasa de matriz

Fondo

El envejecimiento de la piel es una progresión bioquímica complicada que resulta de muchos factores intrínsecos y extrínsecos individuales, como la edad, las hormonas y la exposición a la luz ultravioleta [1]. La progresión se produce en las capas epidérmica y dérmica y se relaciona principalmente con la degradación de la matriz extracelular (MEC) [2]. Las enzimas implicadas en la degradación de la MEC son las metaloproteinasas de matriz (MMP), como las gelatinasas (MMP-2) y la colagenasa [3]. La piel pierde su resistencia a la tracción debido al efecto de la degradación de la ECM por parte de las MMP. En este proceso, se producen las arrugas de la piel y también surgen marcadamente la aspereza y la sequedad junto con ciertas anomalías pigmentarias como la hipopigmentación o la hiperpigmentación [2, 4]. Para el tratamiento de la hiperpigmentación, se han investigado los inhibidores de tirosinasa. La tirosinasa es una enzima limitante de la velocidad que convierte la tirosina en melanina [5]. Los inhibidores de tirosina juegan un papel importante como agentes aclarantes de la piel [6] mientras que la síntesis de ácido hialurónico (HA) regula la hidratación de la piel y la aparición de arrugas. HA, un glicosaminoglicano no sulfatado (GAG), se compone de unidades repetitivas de disacáridos que incluyen ácido D-glucurónico y N-acetil-Dglucosamina [7]. HA también regula la reparación de tejidos, incluida la mejora de la respuesta del sistema inmunitario mediante la activación de células inflamatorias y en respuesta a la lesión de fibroblastos [8-10].

Los productos naturales elaborados a partir de fuentes vegetales como Glycyrrhiza glabra [11] o té verde [12] se han utilizado en aplicaciones cosméticas como fuente de nutrición y como agente blanqueador. Una cantidad significativa de evidencia ha señalado los efectos beneficiosos de los fitoquímicos de extractos de plantas administrados por vía oral o tópica, especialmente en la mejora de las condiciones de la piel. Algunos ejemplos de los efectos beneficiosos son que se puede reducir el envejecimiento de la piel y la inflamación de la piel. C. fistula (lluvia dorada), familia Fabaceae, se encuentra en numerosos países asiáticos como Tailandia, China, Myanmar e India. En estudios anteriores, se descubrió que el extracto de flor de C. fistula posee propiedades antioxidantes, anticancerígenas, antibacterianas, antifúngicas y antidiabéticas [13, 14]. Se sabe que el efecto de la fístula de C. en la medicina ayurvédica está implicado en el tratamiento de diversos trastornos, como enfermedades de la piel, lepra, hematemesis, prurito y diabetes [15, 16]. Varias partes de C. fistula han mostrado propiedades farmacológicas [17]. Las flores, las semillas, los frutos y la pulpa se han utilizado para tratar enfermedades de la piel, incluida la lepra [18]. La pulpa ha sido reconocida por sus propiedades antidiabéticas [15] y se ha utilizado en un tónico que se ha aplicado en tratamientos de gota y reumatismo [19]. Las hojas y las vainas maduras se han utilizado tradicionalmente como laxantes [20, 21]. También se ha informado que los fitoquímicos fenólicos y flavonoides de C. fistula son útiles en el tratamiento de enfermedades de la piel [14]. Por lo tanto, en este estudio, estamos interesados ​​en las funciones del extracto de flor de C. fistula en aplicaciones cosmecéuticas. Se han examinado los efectos preventivos de la degradación de ECM junto con las enzimas del envejecimiento de la piel que incluyen actividades de colagenasa y MMP-2, así como tirosinasa. Además, se ha determinado la síntesis de colágeno y HA.

Métodos

Sustancias químicas y reactivos

El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), la gelatina DQ y la penicilina-estreptomicina se suministraron de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). El suero bovino fetal (FBS) fue suministrado por Thermo Scientific (EE. UU.). El kit de tinción de colágeno Sirius Red/Fast Green se adquirió de Chondrex, Inc. (Redmond, WA, EE. UU.). El reactivo de sulforhodamina B, el ácido hialurónico y la tirosinasa de hongo se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

Materiales vegetales

Las flores de C. fistula se obtuvieron de Lampang Herb Conservation, provincia de Lampang, Tailandia. Wannaree Charoensup, botánico del herbario de la Flora de Tailandia, Facultad de Farmacia, Universidad de Chiang Mai, Tailandia, certificó un número de espécimen de comprobante (023197).

Preparación del extracto de flor de Cassia fístula

Las flores de C. fistula se secaron en una habitación aireada y luego se molieron finamente 500 g de flores secas hasta obtener un polvo. Después de eso, el polvo se empapó en etanol al 50 por ciento y luego se agitó a 70 rpm durante 24 h. Después de 24 h, las muestras se filtraron a través de papel de filtro para separar el residuo. El residuo se remojó en etanol al 50 por ciento y se agitó a 70 rpm durante 24 hy este paso se repitió 2 veces. Las muestras filtradas se combinaron y evaporaron mediante un evaporador rotatorio al vacío (BUCHI, Suiza) para obtener las fracciones de agua. Se añadió hexano a la fracción de agua en una proporción de hexano de 2:1. Las muestras se agitaron y se dejaron separar durante 30 min. Las muestras se separaron en dos fracciones, que eran fracciones de hexano y agua. Luego, se recogió la fracción de agua y se añadió 10 por ciento de carbón vegetal durante un período de 30 min con agitación suave a temperatura ambiente. Las muestras se filtraron a través de papel filtro y celite para separar el carbón vegetal. Las muestras se mezclaron con butanol saturado en una proporción de butanol saturado de 2:1 y se permitió que las muestras se separaran durante un período de 12 h y este paso se repitió 3 veces. Las muestras se separaron en dos fracciones, que incluían fracciones de agua y butanol. Se añadió más agua a las fracciones de butanol hasta un volumen igual y se permitió que estas fracciones se evaporaran mediante el uso de un evaporador de vacío rotatorio. Las muestras evaporadas se liofilizaron para obtener el polvo de extracto de flor de C. fistula.

Cuantificación del contenido fenólico total en extracto de flor de C. fistula usando espectrofotómetro UV-visible

El contenido de fenoles totales en el extracto de flor de C. fistula se determinó mediante el ensayo de Folin-Ciocalteu. Brevemente, 0.4 ml de extracto de flor de C. fistula se mezcló con 0.3 ml de reactivo de Folin-Ciocalteau al 10 por ciento y se incubó en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante 3 min. . Luego, se agregaron 0.3 ml de solución de carbonato de sodio y la solución se incubó adicionalmente en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. La absorbancia se evaluó a 765 nm usando un espectrofotómetro UV-visible. Se calculó la concentración del contenido fenólico total y se comparó con una curva estándar para ácido gálico (GA) a 0–20 ug/mL. El contenido fenólico total se informó como miligramos de equivalentes de GA por gramo de C. fistula. extracto de flor (mg GAE/g extracto).

Cuantificación de compuestos fenólicos en extracto de flor de C. fistula mediante análisis HPLC

Se analizaron varios tipos de compuestos fenólicos en extractos de flores de C. fistula mediante análisis HPLC y luego se compararon con ácido gálico estándar, catequinas, ácido protocatequiico, ácido vanílico, ácido clorogénico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Los extractos de flores se disolvieron en etanol al 50 por ciento y se evaluaron más mediante HPLC (Agilent Technologies, CA, EE. UU.) utilizando una columna C18 de fase inversa (WATER, MA, EE. UU.). La fase móvil consistía en metanol (A) y 0.1 por ciento de ácido trifluoroacético (TFA) en agua (B) con condiciones de gradiente. El caudal se fijó en 1,0 ml/min y la longitud de onda de detección se registró en 280 con un detector UV. Los niveles de concentración de los compuestos fenólicos se calcularon y compararon con la curva estándar considerando las concentraciones estándar y las áreas de los picos (mg/g de extracto).

Cuantificación del contenido total de flavonoides en extracto de flor de C. fistula mediante un ensayo colorimétrico

El contenido total de flavonoides se determinó mediante un ensayo colorimétrico de cloruro de aluminio modificado (AlCl3) como se describió previamente [22]. Brevemente, 0.25 mL de extracto de flor se mezcló con 0.125 mL de nitrito de sodio al 5 por ciento (NaNO2) y la solución se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Luego, 0.125 mL de AlCl3 al 10 por ciento se mezcló en la mezcla y se mantuvo en la oscuridad durante 5 min. Posteriormente, se añadió 1 mL de hidróxido de sodio (NaOH) y la solución se incubó durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia se midió a 510 nm usando un espectrofotómetro UV-visible. El contenido total de flavonoides se calculó y comparó con los valores estándar de catequina y se expresó como mg de equivalente de catequina por gramo de extracto (mg CE/g de extracto).

Culturas celulares

Se aislaron asépticamente fibroblastos primarios de piel humana de una cicatriz abdominal después de un procedimiento quirúrgico que involucró un parto por cesárea en la sala de cirugía del Hospital CM Maharaj, Universidad de Chiang Mai (Chiang Mai, Tailandia) (Código de estudio: BIO-2558-03549 aprobado por Medical Comité de Ética de la Investigación, Universidad de Chiang Mai). Se eliminó la grasa del material de partida y se remojó en DMEM que contenía antipenicilina y estreptomicina. Después de eso, la piel se sumergió en DMEM que contenía proteasa al 1 por ciento (Dispase, Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.) durante 48 horas a 4 grados. Se eliminaron las capas epidérmicas y se aislaron los fibroblastos normales de la dermis. Los fibroblastos se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10 por ciento, L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 µg/ml. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 por ciento a 37 grados.

Ensayo de viabilidad celular

El ensayo de viabilidad celular del extracto de flor de C. fistula contra las células de fibroblastos de la piel se midió usando un ensayo de sulforhodamina B (SRB) como se describió previamente [23]. Brevemente, las células (8x103 células/pocillo) se sembraron en una placa de 96-pocillos y se incubaron a 37 grados, 5 por ciento de CO2 durante 24 h. Después de eso, las células se trataron con o sin varias concentraciones (0–200 ug/mL) de extracto de flor de C. fistula durante 48 h. Después de 48 h, se añadió a las células ácido tricloroacético (TCA) al 10 por ciento (p/v), y luego las células se incubaron a 4 grados durante 1 h. Se eliminó el medio y se enjuagaron las células con agua del grifo a baja velocidad. Se añadió solución de SRB al 0,057 por ciento (p/v) (100 μl) a cada pocillo y las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se eliminó la solución de SRB y luego se lavaron las células 4 veces con ácido acético al 1 por ciento (v/v) y se dejaron secar a temperatura ambiente. El tinte se disolvió con solución de base Tris 10 mM (pH 10,5) y la absorbancia se midió a 510 nm utilizando un lector de microplacas.

Ensayo de síntesis de colágeno

El colágeno intracelular total en las células de fibroblastos se determinó usando el kit de tinción de colágeno Sirius Red/Fast Green (Chondrex, Inc, Redmond, WA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron células de fibroblastos de piel en placas de 24 pocillos durante 24 ha 37 grados, 5 por ciento de CO2. Después de eso, las células se pretrataron con medio DMEM sin suero durante 24 h. Se retiró el medio y luego se incubaron las células con o sin extracto de flor de C. fistula (0-150 ug/mL) durante 48 h. Después de 48 h, se retiró el medio de cultivo. Luego, las células se lavaron con PBS y se fijaron con fijador Kahle durante 10 min. Se eliminó el fijador y se lavaron las células con PBS. Se añadió la solución de colorante Sirius Red/Fast Green a cada pocillo y las muestras se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se eliminó el tinte y las células se lavaron cuatro veces con agua desionizada o hasta que el líquido se volvió incoloro. Finalmente, se añadió el tampón de extracción y se midió la absorbancia a 540 nm y 605 nm utilizando un espectrofotómetro UV-visible.

Ensayo de actividad de colagenasa

La actividad de colagenasa se midió usando un ensayo de gelatina DQ™ fluorogénico modificado como se ha descrito previamente [24]. Brevemente, se agregaron varias concentraciones de extracto de flor de C. fistula (0–200 ug/ml) a placas de 96 pocillos. Se añadió una U/ml de colagenasa en cada pocillo (100 μL/pocillo). Posteriormente se agregaron 15 ug/mL de gelatina (gelatina DQ) y se incubaron las mezclas por 10 min. La tasa de proteólisis se determinó midiendo la absorbancia a intervalos de 2 min durante 20 min utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm. La actividad enzimática se estimó examinando la pendiente de regresión lineal entre el tiempo y la absorbancia durante un período de 2-6 min.

Ensayo de actividad de MMP-2

La actividad de MMP{{0}} se determinó mediante zimografía de gelatina como se describió previamente [25]. Las células de fibroblastos se cultivaron en medio DMEM sin suero durante 24 h. Posteriormente se recolectó el sobrenadante del cultivo. El sobrenadante del cultivo se sometió a geles de poliacrilamida al 10 por ciento que contenían 0,1 por ciento p/v de gelatina en condiciones no reductoras. Los geles se lavaron dos veces con 2,5 por ciento v/v de Triton X-100 durante 30 min a temperatura ambiente para eliminar el SDS. La losa de gel se cortó en rebanadas que correspondían a los carriles y luego las rebanadas se colocaron en diferentes tanques y se incubaron con un tampón activador (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) que contenía varias concentraciones de C Extracto de flor de fístula (0–200 ug/ml) a 37 grados durante 18 h. Después de eso, se lavó una tira de los geles y se tiñó con Coomassie Brillant Blue R (0,1 por ciento p/v) y luego se destiñó en metanol al 30 por ciento y ácido acético al 10 por ciento. La actividad de MMP-2 aparecía como una banda clara sobre un fondo azul. Las bandas de digestión se cuantificaron mediante el programa Image J.

Ensayo de síntesis de ácido hialurónico (HA) por ELISA

El efecto del extracto de flor de C. fistula sobre la síntesis de HA se determinó utilizando un kit ELISA como se describió anteriormente [26]. Las células de fibroblastos (5,0 × 104 células/pocillo) se sembraron en 24-placas de pocillos durante 24 ha 37 grados, 5 por ciento de CO2. Las células se pretrataron en medio sin suero durante 6 h y luego se trataron con o sin varias concentraciones de extracto de flor de C. fistula (0–200 ug/mL) durante 48 h. Se recogió el medio de cultivo y se midió la síntesis de HA mediante ELISA. La absorbancia se midió a 450 y 570 nm utilizando un lector de microplacas. Se calculó la concentración de HA en el sobrenadante cultivado obtenido de las células de fibroblastos tratadas y se comparó con la curva estándar de HA.

Ensayo de inhibición de tirosinasa

El ensayo de inhibición de la tirosinasa se determinó como se describió anteriormente [27]. Se agregaron varias concentraciones de extracto de flor de C. fistula a una placa de 96-pocillos. La reacción se llevó a cabo en un tampón de sodio (pH 6,4) que contenía 100 U/mL de tirosinasa de hongo. Se añadió sustrato L-DOPA (1 mM) a la mezcla de reacción y luego se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Se midió el cambio de absorbancia a 490 nm cada 1,5 min durante 15 min utilizando un lector de microplacas. El porcentaje de inhibición de la tirosinasa se calculó mediante la siguiente fórmula:

Ensayo de actividad antioxidante

La actividad antioxidante del extracto de flor de C. fistula se determinó utilizando la actividad de radicales libres de 1, 1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), como se describió previamente [28]. Se prepararon varias concentraciones del extracto de flor (0–100 ug/mL) en metanol. Se añadió 1 mL de 0,002 por ciento de DPPH a 1 mL de la solución de extracto de flores y la mezcla se mantuvo en la oscuridad durante 30 min. La absorbancia se midió a 517 nm utilizando un espectrofotómetro. El porcentaje de inhibición se calculó y comparó con la vitamina E estándar (1–100 ug/mL) utilizando la siguiente fórmula:

La actividad antioxidante de los extractos de flores de C. fistula se confirmó mediante el ensayo ABTS, como se describió anteriormente [29]. Se preparó el catión radical ABTS [2, 2′-azino-bis (etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico)] mezclando solución madre de ABTS 7 mM con persulfato de potasio 2,45 mM (K2S2O8) (1/1, v/v). La mezcla se incubó en la oscuridad durante 12 a 16 h hasta que se completó la reacción. El ensayo se realizó en 990 μL de solución ABTS y 10 μL de extracto de flor (0–4 ug/mL). Después de 6 min, la absorbancia se registró inmediatamente a 734 nm usando un espectrofotómetro. El porcentaje de inhibición de la actividad ABTS del extracto floral se calculó utilizando la siguiente ecuación:

análisis estadístico

Todos los datos se presentan como valores de media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se analizó mediante el software Prism versión 6.0 utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de Dunnett. La significación estadística se determinó en * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0,001 o **** p < 0,0001.

Resultados

Caracterización fitoquímica del extracto de flor de C. fistula

Después del paso de liofilización de las muestras, el extracto de flor de C. fistula se pesó y se sometió a estudios fitoquímicos y biológicos. 18.0Se obtuvieron 8 g de extracto de flor de C. fistula a partir de 500 g de materia prima y el porcentaje de rendimiento del extracto de flor fue de 3,62. La huella dactilar de HPLC de los extractos de flores de C. fistula se determinó mediante análisis de HPLC (Fig. 1). El perfil de HPLC que mostró el pico de los compuestos fenólicos se marcó en términos de los componentes individuales en cada tiempo de retención. La caracterización de los compuestos fenólicos del extracto de flor de C. fistula se muestra en la Tabla 1. El contenido fenólico total en el extracto de flor fue de 275,32 ± 14,21 mg GAE/g de extracto. Se encontró que los derivados del ácido hidroxibenzoico, incluido el ácido vainílico y el ácido protocatequiico, eran {{20}}.95 ± 0.09 y 2.56 ± 0. 42 mg/g de extracto, respectivamente, mientras que el ácido gálico se registró en {{30}}.60 ± 0.02 mg/g de extracto. Los derivados del ácido hidroxicinámico, incluidos el ácido cumárico, el ácido ferúlico y el ácido clorogénico, se detectaron a 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 y 0,83 ± 0,03 mg/g de extracto, respectivamente. El contenido de flavonoides fue de 27,62 ± 3,56 mg CE/g de extracto. La catequina, como derivado del flavonol, se midió a 1,10 ± 0,00 mg/ g de extracto.

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