Efectos antienvejecimiento del extracto de cultivo de callos de Leontopodium Alpinum (Edelweiss) a través de perfiles de transcriptoma, parte 3

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3.4. Evaluación In Vitro del Extracto LACCE Asociado al Efecto Hidratante

Examinamos el efecto humectante de LACCE en las células HaCaT usando la expresión de Aquaporin 3 (AQP3), que codifica la proteína transportadora de agua y glicerol expresada en las células de la piel, mediante RT-PCR en tiempo real (Figura 3C). En comparación con el control negativo, el gen AQP3 aumentó significativamente mediante la adición del extracto LACCE.beneficios y efectos secundarios de la cistanche tubulosaCuriosamente, a medida que aumentaba la concentración del extracto de LACCE, la expresión de AQP3 aumentaba gradualmente de 3,19 (0,1 por ciento de LACCE) a 4,5 (1 por ciento de LACCE).

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3.5.Evaluación in vitro del extracto de LACCE como agente antiarrugas

Probamos el efecto antiarrugas de LACCE utilizando un gen marcador que codifica la metaloproteinasa de matriz-2(MMP-2), que promueve el crecimiento celular, mediante RT-PCR en tiempo real (Figura 3D). La irradiación UVB aumentó significativamente la expresión de MMP-2en comparación con el control negativo sin irradiación UVB (cambio de veces 0.67 con un valor inferior a 0.05). La expresión de MMP-2 se reguló a la baja mediante la adición de LACCE frente a la radiación UVB. En general, la expresión de MMP-2 disminuyó gradualmente a medida que aumentaba la concentración de LACCE. La expresión de MMP-2 en condiciones normales sin radiación UVB fue comparable a la del LACCE al 0,5 por ciento con radiación UVB.

3.6.Evaluación clínica de LACCE sobre el lifting facial y la mejora de las arrugas periorbitales, la elasticidad de la piel, la densidad dérmica y el grosor de la piel

Para examinar el efecto de LACCE in vivo, llevamos a cabo una evaluación clínica de LACCE asociada con el estiramiento facial y la mejora de las arrugas periorbitales, la elasticidad de la piel, la densidad dérmica y el grosor de la piel. Para esto, 21 voluntarias, que se dividieron en 12 de 40 años y nueve de 50 años, participaron en la evaluación clínica durante cuatro semanas.

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En primer lugar, examinamos el efecto de LACCE sobre las arrugas periorbitarias utilizando el sistema de alta resolución PRIMOS. Se analizaron dos parámetros de rugosidad diferentes, la rugosidad media (Ra) (Figura 4A) y la rugosidad cuadrática media (Rq) (Figura 4B). Cuatro semanas después del tratamiento con LACCE y el placebo, los valores de Ra y Rq disminuyeron en ambas muestras.extracto de cistanche tubulosa,Sin embargo, la tasa de disminución de los valores de Ra y Rq fue mucho mayor en la muestra tratada con LACCE que en la muestra tratada con placebo (Tabla 2). Por ejemplo, la tasa de disminución del valor de Ra fue del 3,654 % y del 6,118 % a las dos y cuatro semanas, respectivamente, con significación estadística (p<0.05). similarly,="" the="" decrease="" rate="" for="" the="" rq="" value="" was="" 3.583%and="" 6.189%="" at="" two="" and="" four="" weeks,="" respectively,="" with="" statistical="" significance=""><0.05). moreover,="" the="" ratio="" of="" volunteers="" who="" displayed="" a="" reduction="" in="" the="" roughness="" parameters="" for="" the="" lacce-treated="" sample="" was="" much="" higher="" than="" that="" for="" the="" placebo-treated="" sample.="" for="" example,="" at="" four="" weeks,="" the="" ratios="" of="" volunteers="" showing="" a="" decrease="" in="" ra="" and="" rq="" values="" were="" 90.476%="" in="" the="" lacce-treated="" sample="" and="" 57.142%="" in="" the="" placebo-treated="">

Figura 4. Pruebas clínicas in vivo de LACCE para el estiramiento facial y la mejora de las arrugas periorbitarias, la elasticidad de la piel, la densidad dérmica y el grosor de la piel. Los valores de Ra (A) y Rq (B) se midieron con el sistema de alta resolución PRIMO en tres puntos de tiempo diferentes para observar el efecto de arrugas periorbitales de LACCE (1 por ciento). Se midieron los valores de elasticidad bruta (R2)(C), elasticidad neta (R5)(D) y elasticidad biológica (R7)(E) para observar la elasticidad de la piel con LACCE. Medición de la densidad dérmica (F) y del espesor de la piel (G). Medida de R en la comisura de la boca (H). Antes/después: probabilidad p (medidas repetidas ANOVA, significativo:*p<><><0.001).lacce lacebo="" b:="" probability="" p(repeated="" measures="" anova,="" significant∶="" 十="" p=""><>

Examinamos el efecto de LACCE en la elasticidad de la piel de las mejillas utilizando Cutometer. Se midieron tres parámetros diferentes, elasticidad bruta (R2), elasticidad neta (R5) y elasticidad biológica (R2)(R7) (Figura 4C-E). Los valores R2, R5 y R7 para las condiciones tratadas con LACCE y con placebo aumentaron durante las cuatro semanas.Reseñas de cistanche tubulosa,Por ejemplo, el valor de R2 para la muestra tratada con LACCE aumentó de 0.728 a 0.752, mientras que el valor de R2 para la muestra tratada con placebo aumentó de 0.74{ {10}} a 0,752 (Figura 4C). Además, la tasa de aumento en la muestra tratada con LACCE fue mucho mayor que en la muestra tratada con placebo (Tabla 3). Por ejemplo, las tasas de aumento en la muestra tratada con LACCE fueron 3,296 (R2), 5,816 (R5) y 6,756 (R7), mientras que las tasas de aumento en la muestra tratada con placebo fueron 1,621 (R2), 2,895 (R5), y 3.378(R7) a las cuatro semanas. Sin embargo, no hubo diferencia en la proporción de voluntarios que mostraron un aumento en la elasticidad de la piel entre las dos muestras.

Examinamos el efecto de LACCE sobre la densidad dérmica y el grosor de la piel usando Dermascan-C. Ambas muestras mostraron un aumento en la densidad dérmica y el grosor de la piel cuatro semanas después del tratamiento (Figura 4F,G). Por ejemplo, la densidad dérmica en la muestra tratada con LACCE aumentó de 26,708 a 28,168, mientras que la de la muestra tratada con placebo aumentó de 26.936 a 28.168 (Figura 4F). La tasa de aumento de la densidad dérmica fue mucho mayor en la muestra de LACCE (5,466 por ciento) que en la muestra tratada con placebo (3,118 por ciento) cuatro semanas después del tratamiento (Tabla 4). Una vez más, la tasa de aumento del grosor de la piel fue mucho mayor en la muestra de LACCE (10,192 por ciento) que en la muestra tratada con placebo (4,829 por ciento) cuatro semanas después del tratamiento. Curiosamente, muchos voluntarios mostraron un fuerte aumento en la densidad dérmica (90,476 %) y el grosor de la piel (100 %) después de cuatro semanas de tratamiento con LACCE.

Examinamos el efecto de LACCE en el estiramiento facial en la comisura de la boca mediante el análisis de Moireé. Tanto las muestras tratadas con LACCE como las tratadas con placebo mostraron una reducción en el estiramiento facial (Figura 4H); sin embargo, la tasa de disminución del estiramiento facial fue mucho mayor en la muestra de LACCE (2.541 por ciento) que en la muestra de placebo (0.437 por ciento) a las cuatro semanas de tratamiento. La proporción de voluntarios que mostró una disminución en el estiramiento facial fue mayor con LACCE (85,714 por ciento) que con el placebo (57,142 por ciento).

3.7.Análisis del transcriptoma de células HaCaT en respuesta a LACCE por RNA-Seq

Aunque el extracto de LACCE mostró varios efectos positivos como agente cosmético, podría ser digno de mención examinar el cambio en el transcriptoma humano en respuesta a LACCE. Para esto, usamos extracto de LACCE al 1 por ciento en lugar de una concentración más baja porque asumimos que el posible efecto de una concentración baja de LACCE en las células de queratinocitos podría ser pequeño. Las células HaCaT se trataron con LACCE (tratamiento) al 1 por ciento, mientras que las células HaCaT de control se trataron con agua estéril. Se aplicaron tres réplicas biológicas para RNA-Seg. El número de lecturas de secuencia varió de 32.776.672 a 42.640,000(Tabla 5). Más del 90 por ciento de las lecturas en las seis muestras se mapearon en las transcripciones de referencia humanas que contenían 159 998 transcripciones (Figura 5A). Para el análisis de la expresión génica, calculamos los fragmentos por kilobase de los valores de transcripción por millón (FPKM). Como se muestra en la Figura 5B, los valores de FPKM de las tres muestras tratadas fueron más altos que los de las tres muestras de control. Después de eliminar las transcripciones redundantes, solo se expresaron 11 290 transcripciones de 68 158 transcripciones en células de queratinocitos humanos (Tabla S1).

Figura 5. Resultados del mapeo, distribución de fragmentos por kilobase de valores de transcripción por millón (FPKM) y visualización de genes expresados ​​diferencialmente. (A) Una porción de lecturas mapeadas (naranja) y no mapeadas (gris) en el transcriptoma de referencia humano. (B) Diagrama de caja que muestra la distribución de los valores de FPKM en cada biblioteca. (C) Diagrama de volcán que muestra la distribución de log1o (adj) y log2 (FC) para todos los genes expresados. Pad y FCindican el valor p ajustado y el cambio de pliegue, respectivamente. Diez DEG identificados se indican con puntos azules (genes regulados a la baja, Down), rojos (genes regulados al alza, Up) y grises (genes no expresados ​​significativamente, NS).

Aunque usamos una concentración más alta de LACCE (1 por ciento) que era 10 veces más alta que el LACCE normal (0.1 por ciento) usado para cosméticos, el transcriptoma de las células de queratinocitos humanos no cambió significativamente en respuesta al tratamiento con LACCE. como se muestra en la gráfica del volcán (Tabla S1 y Figura 5C).cistancheSegún el valor p ajustado de menos de 0.001 y log2 (cambio de pliegue) de más de 1, identificamos un total de 10 genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) en LACCE (Tabla 6). De los 10 DEG,

los cuatro genes regulados a la baja eran genes que codificaban un inhibidor de la unión al ADN 3, el dominio repetido de anquirina 1, el dominio BTB relacionado con Rho que contiene 3 y el N5 ribosomal 18S. Los seis genes regulados eran genes que codificaban la anhidrasa carbónica 2, la proteína 3 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, la queratina 15, la proteína 3 que interactúa con BCL2-, la proteína 1 de unión al factor de crecimiento de fibroblastos y el transCript4 inducible por daños en el ADN.

3.8. Roles funcionales de genes regulados al alza en respuesta a LACCE

El impacto de LACCE en el transcriptoma de queratinocitos fue más leve que otros tratamientos de estrés. Para obtener una descripción funcional de los genes regulados al alza y a la baja, llevamos a cabo un análisis de enriquecimiento de GO. Sin embargo, no obtuvimos resultados significativos para los términos GO enriquecidos debido a una pequeña cantidad de genes expresados ​​​​diferencialmente. Por lo tanto, aumentamos el número de genes expresados ​​diferencialmente al aplicar un valor p ajustado de menos de 0.05 y log2 (cambio de pliegue) de más de 0,5. Como resultado, identificamos 22 genes regulados al alza y 13 genes regulados a la baja (Tabla S1). El análisis de enriquecimiento GO identificó 36 términos GO enriquecidos compuestos por 21 términos GO (proceso biológico), dos términos GO (función molecular) y 13 términos GO (componente celular) en genes regulados al alza (Tabla S2). Por el contrario, solo se identificaron 12 términos GO enriquecidos para el proceso biológico en 13 genes regulados a la baja (Tabla S2).

De acuerdo con el proceso biológico, los genes involucrados en la queratinización, la cornificación, la muerte celular programada, la organización de las uniones celulares, la regulación positiva del proceso de desarrollo y el establecimiento de una barrera cutánea estaban altamente regulados (Figura 6A).agua de cistanchePara la función molecular, el constituyente estructural del citoesqueleto y la actividad de la molécula estructural se expresaron altamente (Tabla S2). En el caso del componente celular, los genes en el filamento intermedio, el exosoma extracelular y el filamento de queratina se expresaron en gran medida (Figura 6B). De 12 términos GO para 13 genes regulados a la baja, los genes relacionados con la respuesta al ion zinc, la regulación de la osificación y la regulación negativa del proceso biológico estaban frecuentemente regulados a la baja.

Figura 6. La estructura jerárquica de los términos GO enriquecidos identificados para genes humanos regulados positivamente en respuesta a LACCE. Los gráficos acíclicos dirigidos (DAG) visualizan la estructura jerárquica de los términos GO enriquecidos identificados para genes regulados al alza tras el tratamiento con LACCE según el proceso biológico (A) y el componente celular (B). Cada término GO se indica con un color de cuadro diferente basado en el valor p. La información detallada de los términos GO identificados se puede encontrar en la Tabla S2.

4. Discusión

Los cosméticos se definen clásicamente como cualquier producto preparado que se puede aplicar al cuerpo humano, incluida la cara, la piel, el cabello, la boca y los ojos, para cambiar o fortalecer la apariencia del cuerpo humano [21]. Además, los cosméticos se utilizan para la limpieza, la fragancia y la protección. La mayoría de los cosméticos están compuestos por compuestos químicos que pueden derivarse de fuentes naturales o sintéticas [22].

En este estudio, examinamos los posibles efectos de LACCE como compuesto natural para cosméticos a través de diversos ensayos in vitro e in vivo. Varios resultados de ensayos in vitro mostraron la fuerte actividad antioxidante de LACCE en respuesta al tratamiento con UVB. Curiosamente, el efecto del antioxidante LACCEasan se correlacionó con la concentración de LACCE. La actividad antioxidante de LACCE (1 por ciento) fue comparable a la de NAC o mucho mayor que la de la vitamina C. LACCE contiene una mayor cantidad de ácido clorogénico, ácido 3,5-dicafeoilquínico, ácido leontopódico B y ácido leontopódico A que cultivos de callos de edelweiss normales, como se muestra en un estudio anterior [4]. En particular, un estudio previo que identificó dos ácidos leontopódicos de edelweiss demostró el papel funcional de LACCE como agente antioxidante [23].

La expresión de dos genes inflamatorios fue suprimida por el tratamiento con LACCE, lo que sugiere el posible papel de LACCE en la actividad antiinflamatoria, como se mostró anteriormente [7,24]. Curiosamente, no hubo una diferencia significativa en el efecto antiinflamatorio entre las diferentes concentraciones de LACCE, lo que indica que el 1 por ciento de LACCE podría ser suficiente para su aplicación como agente antiinflamatorio en cosméticos. Por el contrario, las expresiones de AQP3 y MMP2 requeridas para humectar y arrugar, respectivamente, cambiaron drásticamente después del tratamiento con diferentes concentraciones de LACCE.

Una prueba clínica es el paso más importante para usar el extracto de plantas como fuente cosmética. En este estudio, examinamos los efectos in vivo de LACCE con 21 voluntarios. La aplicación de LACCE en la cara y los tejidos de la piel mostró aumentos significativos en cuatro factores diferentes (mejorías en las arrugas periorbitarias, elasticidad de la piel, densidad dérmica y grosor de la piel) en comparación con el placebo. En particular, el uso constante de LACCE mejoró significativamente los tejidos de la cara y la piel. Aunque los extractos de edelweiss se conocen como fuente para cosméticos, este es el primer informe que demuestra la aplicación exitosa de LACCE como material cosmético.

Para evaluar extractos de plantas como fuente cosmética o medicinal in vitro, el examen de la expresión de genes marcadores es un enfoque experimental popular. Sin embargo, la aplicación de solo genes seleccionados para el análisis de expresión génica tiene varias limitaciones. El rápido desarrollo reciente de la secuenciación de próxima generación facilita el análisis de la expresión génica en todo el genoma. En este estudio, utilizamos RNA-Seq para examinar los cambios en todo el transcriptoma en las células de queratinocitos humanos en respuesta a LACCE. Nuestros resultados mostraron que al menos el 16,56 por ciento de los genes humanos se expresaron en células de queratinocitos, lo que indica la expresión específica de tejidos de genes humanos. LACCE indujo la expresión de numerosos genes; sin embargo, el cambio global en el transcriptoma humano por LACCE fue leve en comparación con otras condiciones de estrés. Este resultado asegura la seguridad de LACCE para su aplicación en tejidos humanos.

El análisis de enriquecimiento reveló que los genes regulados al alza que codifican la queratina 5 (KRT5), KRT19, KRT6A, KRT15, ​​KRT14, KRT17 y la unión de placoglobina (JUP) estaban involucrados en la queratinización y la cornificación. Los queratinocitos epidérmicos juegan un papel importante como barrera contra diversos factores ambientales [25]. Específicamente, las células epidérmicas diferenciadas terminales se convierten en queratinocitos muertos mediante la muerte celular programada conocida como cornificación, formando una fuerte barrera epidérmica [26]. Después de la muerte celular, la capa de piel cornificada proporciona muchas ventajas a la cara y los tejidos, incluido un aumento de la elasticidad, la estabilidad, la hidratación y la resistencia mecánica [25]. De los genes KRT identificados, el gen que codifica Keratin15 (KRT15), un miembro de la familia de genes de queratina, se conoce como un marcador de células madre del folículo piloso que se expresa en gran medida en los tejidos de la piel [27,28]. Un estudio reciente ha sugerido que KRT15 funciona en la regeneración epitelial contra la radiación y la reparación de heridas [29,30].

Además de varios genes que codifican proteínas KRT, los genes que codifican DDIT4, BNIP3 e IGFBP3 funcionan en la muerte celular programada. Por ejemplo, el transcript4 inducible por daños en el ADN (DDIT4) se expresa en gran medida por diferentes estreses e inhibe el objetivo de los mamíferos de la vía del complejo de rapamicina 1 (mTORC1) asociada con el tratamiento del cáncer [31]. Estudios previos han identificado el gen DDIT4, que fue altamente expresado por la dexametasona, que es un agente quimioterapéutico que induce la autofagia en los linfocitos, lo que sugiere su posible papel en la regulación del crecimiento, la proliferación y la supervivencia celular [32,33]. LACCE mostró efectos similares a la dexametasona como agente antiinflamatorio. La proteína que interactúa con Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa (BNIP3) es miembro de una familia de proteínas pro-apoptosis que regula la proliferación celular[34] . Además, BNIP3 está involucrado en la protección de los queratinocitos de la apoptosis inducida por UVB mediante la regulación positiva de su expresión génica [35]. Varios estudios han demostrado que la expresión de la proteína 3 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP-3) está relacionada con la senescencia celular [36,37]. La adición de IGFBP-3 induce o inhibe la apoptosis según los tipos de células [37]. Por ejemplo, IGFBP-3 se reguló positivamente en las células cervicales inmortalizadas por el virus del papiloma humano, lo que resultó en la mejora de la mitogénesis inducida por IGF-1- [37]. Un estudio reciente ha demostrado la regulación a la baja de IGFBP-3 en células viejas senescentes e inducidas por H, O2-en comparación con células jóvenes, lo que sugiere su posible función como marcador del envejecimiento [36].

BNIP3, IGFBP3, estratifina (SFN), CA2, FGFBP1, KRT17 y JUP participan en la regulación positiva del proceso de desarrollo. De ellas, las anhidrasas carbónicas son enzimas ubicuas presentes en procariotas y eucariotas, incluidos animales y plantas [38]. En los seres humanos, la anhidrasa carbónica cataliza la formación de ácido carbónico a partir de agua y dióxido de carbono (CO), que son necesarios para la fisiología del cerebro, los riñones y los huesos [39]. Un estudio anterior demostró que CA4 y CA9 estaban regulados al alza en un ratón durante el período hipóxico de la herida por RNA-Seq [40]. Además, la adición de la enzima CA9 recombinante promovió la reepitelización de la herida [40]. Además, un estudio del proteoma también reveló la participación de la proteína CA2 en el envejecimiento y la neurodegeneración en un ratón [41]. Aquí, demostramos que LACCE promovió la regeneración de las células de queratinocitos humanos al regular la expresión de CA2. La proteína de unión al factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFBP1) es una chaperona secretada extracelular que se une a los FGF y modula la señalización de FGF J42]. Varios estudios han demostrado que FGFBP1 se expresa mucho durante la angiogénesis y desempeña un papel importante en la carcinogénesis, la inflamación y la cicatrización de heridas de la piel [42-44]. Además, la localización celular de genes regulados positivamente en la vesícula, el exosoma extracelular, el filamento intermedio y el filamento de queratina sugiere que estas proteínas son un componente principal del citoesqueleto.

En los genes regulados a la baja, se sabe que la mayoría de los genes son inducidos por diferentes tensiones. Por ejemplo, dos genes que codifican la metalotioneína 2a (MT2A) y la metalotioneína le (MT1E) se inducen en condiciones de estrés por metales, incluidos iones de zinc, iones de cobre e iones de cadmio, y estrés oxidativo, como UVB [45,46]. Además, un inhibidor de la unión al ADN 3 (ID3), un miembro de las proteínas helix-loop-helix, es un gen temprano inmediato en respuesta a las señales mitogénicas y al estrés oxidativo [47]. El dominio de repetición de anquirina 1 (ANKRD1), también conocido como proteína de repetición de anquirina cardiaca (CARP), es un cofactor transcripcional que se regula durante la cicatrización de heridas e induce la angiogénesis [48]. Tanto ID3 como ANKRD1 están involucrados en la regulación negativa del proceso biológico. ID3 actúa como un regulador transcripcional que inhibe la diferenciación de células madre y promueve la progresión del ciclo celular [47]. Además, un estudio reciente mostró que la pérdida de la función ANKRD1 en ratones resultó en un retraso en la cicatrización de heridas, lo que sugiere su papel en las heridas y lesiones tisulares [49]. ]. Además, el dominio BTB relacionado con Rho que contiene 3 (RHOBTB3) funciona para promover la degradación proteasomal de los factores inducibles por hipoxia (HIF), que son los principales reguladores de las respuestas adaptativas a la falta de oxígeno [50]. Además, la proteína transmembrana 1 inducida por interferón (IFITM1) inhibe la entrada de muchos virus en la célula huésped [51]. De manera similar, el gen que codifica la proteína 6 inducible por interferón alfa (IFI6) es inducido por el interferón y regula la apoptosis y la inmunidad innata antiviral [52,53]. La regulación a la baja de los genes que responden al estrés por el tratamiento con LACCE sugiere que LACCE no causa estrés en las células de queratinocitos humanos.

5. Conclusiones

Aquí, evaluamos LACCE como un material cosmético natural a través de varios ensayos in vitro e in vivo, lo que sugiere sus fuertes efectos en la mejora de los tejidos de la cara y la piel. En particular, el análisis del transcriptoma basado en RNA-Seg reveló el mecanismo molecular en las células de queratinocitos humanos en respuesta a LACCE. LACCE reguló al alza el gen implicado en la queratinización y la cornificación, proporcionando una barrera cutánea, que es promovida por los genes necesarios para la muerte celular programada. Muchos reguladores positivos del proceso de desarrollo estaban regulados al alza, mientras que diversos genes inducidos por el estrés estaban regulados a la baja por el tratamiento con LACCE. En conjunto, nuestro estudio demostró que LACCE es un agente para cosméticos o cosmecéuticos antienvejecimiento.

Este artículo está extraído de Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes