Efectos antialérgicos y antiinflamatorios de la neferina en las células RBL-2H3

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Resumen:Los mastocitos juegan un papel muy importante en la alergia e inflamación de la piel, incluidas la dermatitis atópica y la psoriasis. En el pasado, se descubrió que la referencia tiene efectos antiinflamatorios y antienvejecimiento en la piel, pero su efecto sobre los mastocitos aún no se ha estudiado en detalle. En este estudio, utilizamos mastocitos (células RBL-2H3) y modelos de ratón para estudiar los efectos antialérgicos e inflamatorios de referencia. En primer lugar, encontramos que la referencia inhibe la desgranulación de los mastocitos y la expresión de citoquinas. Además, observamos que cuando los mastocitos fueron estimulados por A23187/phorbol 12-miristato-13-acetato (PMA), la elevación del calcio intracelular fue inhibida por referencia. La fosforilación de la vía MAPK/NF-KB también se reduce mediante el pretratamiento de referencia. Los resultados de los estudios in vivo muestran que la referencia puede mejorar la apariencia de la dermatitis y la infiltración de mastocitos causada por el dinitroclorobenceno (DNCB). Además, también se restaura la expresión de las proteínas de barrera en la piel.cistanchFinalmente, se encontró que la referencia puede reducir el comportamiento de rayado causado por el compuesto 48/80. En conjunto, nuestros resultados indican que la referencia es un muy buen producto natural antialérgico y antiinflamatorio. Su efecto sobre los mastocitos contribuye a su mecanismo farmacológico.

Palabras clave:referencia; producto natural; mastocitos; dermatitis; Comezón

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1. Introducción

Muchos estudios han confirmado que las enfermedades alérgicas son el resultado no solo de la activación inmunitaria innata sino también de la activación adaptativa. Entre ellos, los mastocitos juegan un papel muy importante en una variedad de enfermedades alérgicas como la rinitis alérgica, el asma y la dermatitis alérgica. Los mastocitos expresan receptores de IgE (FceRI) en sus membranas celulares, y los receptores de FceRI tienen una alta afinidad por los anticuerpos IgE [1,2]. Cuando la IgE específica de antígeno se une a FceRI, se produce una interacción y se produce una reacción alérgica. La agregación de FceRI puede activar las tirosina quinasas receptoras, iniciar reacciones aguas abajo y promover la fosforilación de varias proteínas clave (como la proteína quinasa activada por mitógeno; MAPK), lo que en última instancia conduce a la entrada de iones de calcio (Ca2 plus), que es un evento clave en la desgranulación de mastocitos [3].cistancheLos mastocitos activados se desgranulan y liberan mediadores químicos. Estos mediadores químicos utilizados en las reacciones alérgicas pueden causar inflamación [4], por lo que el tratamiento de los síntomas alérgicos implica inhibidores de la desgranulación de los mastocitos. Por lo tanto, la inhibición de la desgranulación de mastocitos mediada por IgE se usa a menudo para identificar nuevos compuestos para prevenir y tratar enfermedades alérgicas. Se ha establecido que los anticuerpos y antígenos anti-dinitrofenilo (DNP) IgE pueden inducir reacciones de hipersensibilidad cutánea pasiva (PCA) como un modelo típico in vivo de hipersensibilidad inmediata y como un fármaco de investigación para el potencial de alergias anti-antígenas [5,6 ]. Además, la desgranulación de los mastocitos también puede ser provocada por estimulantes no inmunitarios, como los compuestos 48/80 y A23187. Se sabe desde hace mucho tiempo que el ionóforo de calcio A23187 estimula la secreción de mastocitos con la liberación de mediadores preformados, como la histamina de sus gránulos, que sirve como ejemplo [4] El compuesto 48/80 es un polímero mixto de p-metoxi-N-metilfenetilamina reticulado por formaldehído, que se usa ampliamente para la estimulación independiente de mastocitos [7,8] Por lo tanto, las cantidades apropiadas del compuesto 48/80 y A23187 se han usado comúnmente como reactivos para estudiar el mecanismo de las reacciones alérgicas. Según evaluaciones estadísticas, alrededor del 15-20 por ciento de la población sufre de dermatitis atópica. Ya sean niños o adultos los que padecen esta enfermedad, sin un tratamiento adecuado, la dermatitis atópica puede causar malestar psicológico a los pacientes y sobrecargar sus costes sanitarios familiares y sociales [9]. Desafortunadamente, no existe un método de tratamiento adecuado para curar la dermatitis alérgica. Las opciones de tratamiento actuales aún evitan los alérgenos que causan enfermedades, y el uso continuo de esteroides es el estándar de oro del tratamiento. Los inevitables alérgenos y los efectos secundarios de los fármacos han impulsado el desarrollo urgente de nuevos fármacos terapéuticos. Los compuestos naturales aislados de hierbas y plantas medicinales son fuentes potenciales de agentes terapéuticos para prevenir y tratar enfermedades inflamatorias y mejorar la calidad de vida de los pacientes con trastornos alérgicos.

Cistanche puede antienvejecimiento

La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un alcaloide importante de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores, en muchas enfermedades [10-15].beneficios de la cistancheKhan et al. encontró que la referencia produce efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos que la referencia tiene potencial como medicina alternativa para el tratamiento de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de la referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un compuesto 48/80-y anafilaxia inducida por DNCB modelo de ratones

La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontrado que la referencia produce efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos que la referencia tiene potencial como medicina alternativa para el tratamiento de dermatitis atópica u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de ratones con anafilaxia inducida por compuesto 48/80 y DNCB .

2. Resultados

2.1.Prueba de citotoxicidad de neferina en mastocitos de rata (RBL-2H3)

Dado que las células de leucemia basófila de rata (RBL)-2H3, un análogo de mastocitos que libera histamina, son células adecuadas para examinar los efectos de la inflamación mediada por mastocitos [19], utilizamos estas células para investigar el efecto antialérgico efectos de referencia. Primero, probamos si la referencia puede producir citotoxicidad en mastocitos. Cuando las células se tratan previamente con referencia de 1 a 30 μM durante 24 h, la viabilidad celular de las células no se verá afectada por el tratamiento de referencia (Figura 1).

2.2.Neferine reduce el efecto de desgranulación de RBL-2H3 estimulado por diferentes activadores

Las células RBL-2H3 se utilizan comúnmente para estudios in vitro de desgranulación [20-22]Estimulación de las células RBL-2H3 con anti-dinitrofenol (DNP)IgE y albúmina sérica humana conjugada con DNP (HSA) desencadena la desgranulación. Además, se sabe que los mastocitos se desgranulan en respuesta a compuestos sintéticos, como el compuesto 48/80 y el ionóforo de calcio A23187, y estos compuestos se han utilizado como reactivos convenientes para estudios directos de los mecanismos de las respuestas alérgicas in vitro [23, 24]. Los resultados mostraron que el citoplasma de RBL-2H3 que no fue activado por el activador contenía gránulos secretores limitados.colesterol cistancheEl tratamiento de referencia (10 μM) solo no afectó la actividad de RBL-2H3 (Figura 2A, B). Sin embargo, la adición de diferentes activadores, incluido el compuesto 48/80, A23187 y anti-DNP/IgE más DNP/HSA, llenó claramente el citoplasma con gránulos secretores. Bajo el microscopio electrónico, se puede ver que hay una gran cantidad de gránulos secretores en el citoplasma, y ​​algunos gránulos secretores incluso se fusionan con la membrana celular, lo que lleva a la desgranulación (Figura 2C-E). Después del pretratamiento con referencia 10 uM, los gránulos secretores en el citoplasma se redujeron significativamente (Figura 2F-H). Estos resultados indican que la referencia puede inhibir eficazmente la activación y desgranulación de RBL-2H3 estimulada por el activador.

2.3.Neferine inhibe la elevación de calcio intracelular inducida por PMA/A23187-en RBL-2H3

Los iones de calcio desempeñan el papel de mensajero secundario en el proceso de activación celular. A23187 es la forma más eficaz de aumentar la penetración de los iones de calcio a través de las membranas celulares y estimular la activación de los mastocitos. El acetato de miristato de forbol (PMA) puede activar la proteína quinasa Cand y aumentar los iones de calcio intracelulares para mejorar el efecto de A23187. El aumento de los iones de calcio en los mastocitos también se ha considerado un factor importante en la inducción de la activación de los mastocitos, de modo que afecta la desgranulación de los mastocitos y libera más citocinas y quimiocinas inflamatorias.efectos secundarios de la cistanche deserticola,Por lo tanto, este estudio buscó explorar si la referencia puede inhibir la concentración de iones de calcio en RBL-2H3 cuando inhibe la inflamación. El grupo experimental se dividió en con o sin pretratamiento de referencia durante 20 min, y se añadieron CaClz 1 mM y PMA/A23187 para estimular y activar RBL-2H3. Los resultados experimentales mostraron que el tratamiento de RBL-2H3 con diferentes concentraciones de referencia solo no afectó el aumento de la concentración de iones de calcio intracelular. En el grupo de entrada de Ca2t inducido por PMA/A23187-, la concentración de iones de calcio intracelular aumentó significativamente. Las células RBL-2H3 se pretrataron durante 20 min con referencia (3 μM y 10 μM), y la concentración de iones de calcio se redujo significativamente (Figura 3).

2.4.Neferine redujo la expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias en PMA/A23187 estimulado por RBL-2H3

La respuesta inmune de la piel aumentará la cantidad de mastocitos en el cuerpo, y los mastocitos producirán citocinas proinflamatorias y acelerarán el progreso de la enfermedad. Las citocinas proinflamatorias, especialmente TNF-a, IL-6, IL-1 e IL-8, no solo inducen inflamación sino que también provocan infiltración de leucocitos, formación de granulomas y fibrosis tisular. PMA/A23187 actúa sobre los mastocitos y los induce a producir IL-16, IL-6, TSLP y TNF-, lo que provoca inflamación relacionada con alergias. Por lo tanto, pretratamos RBL-2H3 con referencia durante 20 min y estimulamos con PMA/A23187 durante 6 h para detectar si la referencia puede regular a la baja la expresión de ARNm de IL-1, IL{{ 19}}, TSLP y TNF-a. Los resultados mostraron que en el grupo tratado solo con referencia, la expresión de ARNm de citoquinas no se vio afectada, y la expresión de ARNm en el grupo que indujo inflamación por PMA/A23187 aumentó significativamente. En el grupo tratado con referencia, se observó que los niveles de expresión de ARNm de IL-1, IL-6, TSLP y TNF-a estaban significativamente suprimidos (Figura 4).

2.5.Neferine inhibe la fosforilación inducida por PMA/A23187-de la vía MAPK en RBL-2H3

Estudios previos han señalado que los mastocitos necesitan liberar iones de calcio intracelulares para activar MAPK. Además, la vía de señalización de MAPK regula la expresión de monocitos, linfocitos T, linfocitos B, citocinas y quimiocinas e induce la autoinmunidad. Este mecanismo es similar a la vía de activación de PMA/A23187. En este estudio, exploramos si la referencia puede participar en la regulación de las vías MAPK. Tratamos diferentes concentraciones de referencia (1, 3 y 10 uM) con RBL-2H3 durante 20 minutos y luego estimulamos con PMA/A23187 durante 30 minutos para inducir la inflamación. Los resultados mostraron que cuando RBL-2H3 se trató solo con diferentes concentraciones de referencia, la activación de las proteínas p38, JNK y ERK no se vio afectada. En el grupo tratado con PMA/A23187 solo, encontramos que las proteínas p38, JNK y ERK estaban activadas y tenían una fosforilación significativa. En el grupo pretratado con referencia se observó que a mayores concentraciones de referencia se redujo significativamente la fosforilación de las proteínas p38, JNK y ERK (Figura 5A-C).

2.6.Neferine inhibe la fosforilación inducida por PMA/A23187-de la vía NF-B en RBL-2H3

La expresión de citocinas proinflamatorias depende de la activación del factor de transcripción NF-kB en los mastocitos. Cuando la proteína IKB se fosforiló y degradó, se liberó NF-kB y migró hacia el núcleo, uniéndose a sus correspondientes elementos sensibles al ADN y promoviendo la transcripción de mediadores proinflamatorios. Se produjeron muchas citocinas y quimiocinas, que regulan la respuesta inmunitaria, la diferenciación y la inflamación. Por lo tanto, exploramos si el pretratamiento con referencia afecta la fosforilación de proteínas inducida por PMA/A23187. Tratamos diferentes concentraciones de referencia (1, 3 y 10 μM) para RBL-2H3. Después de 20 min, PMA/A23187 estimuló RBL-2H3 durante 1 ho 2 h para inducir inflamación. Los resultados mostraron que el tratamiento de RBL-2H3 con diferentes concentraciones de referencia solo no afectó la fosforilación de IKBa y NF-KB. Cuando se utilizó PMA/A23187 para la estimulación, se observó un aumento significativo en la fosforilación de IkBo y NF-KB. En el grupo pretratado con referencia, se encontró que la fosforilación de IkBa (Figura 6A) y NF-KB (Figura 6B) se redujo significativamente.

2.7.Efecto de Neferine sobre la dermatitis atópica inducida por 2,4-dinitroclorobenceno (DNCB)

Un modelo animal para la investigación de enfermedades, el DNCB es un irritante representativo que causa dermatitis atópica[25]. Nuestro experimento utiliza dinitroclorobenceno al 1 por ciento (DNCB) disuelto en alcohol al 75 por ciento para inducir la primera etapa de la respuesta de sensibilización. La referencia (3 mg/kg y 10 mg/kg) y dexametasona (Dexa,{{10}}.2 mg/kg) disuelta en DMSO se administraron por vía intraperitoneal el quinto día durante diez días. . En los días 8, 1 y 14, se aplicó DNCB al 0,5 por ciento como segunda etapa para inducir la inflamación. Los ratones se dividieron en cuatro grupos: grupo de control, grupo DNCB, grupo tratado con referencia y grupo tratado con dexametasona, y luego, después de la comparación entre los grupos, se observaron las diferencias. Observamos que DNCB indujo una reacción de inflamación cutánea atópica en la piel de los ratones. Después de aplicar DNCB, se encontró que la piel de los ratones aumentaba el enrojecimiento y la descamación. Todo esto se debe a la proliferación anormal de queratinocitos, la infiltración y la agregación de células inmunitarias. El grupo tratado con referencia 3 mg/kg y dexametasona 0,2 mg/kg durante cuatro días había aliviado el enrojecimiento. Continuamos observando el estado de la piel dorsal de los ratones hasta el día 15. En comparación con el grupo de control, el grupo DNCB tenía condiciones cutáneas severamente enrojecidas e hinchadas, y había caspa y heridas que parecían ser causadas por picazón y dolor. . Podemos encontrar una tendencia de grado decreciente tras los tratamientos de referencia y dexametasona (Figura 7A). Se usó tinción con azul de toluidina para observar el número de mastocitos agregados. Los mastocitos aparecieron de color púrpura cuando se observaron bajo un microscopio. Se puede demostrar cuantitativamente que muchos mastocitos infiltrados y acumulados en la dermis en el grupo experimental DNCB aumentaron significativamente en comparación con el grupo de control. En el grupo tratado con referencia y dexametasona, la infiltración, la agregación y el número de mastocitos se redujeron (Figura 7B, C).

2.8.Neferine mejora la expresión de ARNm de moléculas relacionadas con la barrera después del tratamiento de DNCB

La inflamación relacionada con la piel causada por la EA puede provocar una función anormal de la barrera cutánea. Si la barrera de la piel es defectuosa, es más fácil que los antígenos o irritantes penetren en la epidermis de la piel y entren en el cuerpo para inducir reacciones relacionadas con el sistema inmunitario. Al mismo tiempo, se suprimirá la producción de proteínas de diferenciación, incluidas filagrina, loricrina e involucrina. Por lo tanto, restaurar la barrera cutánea dañada es muy importante para prevenir y tratar la DA [26]. En nuestro estudio utilizamos referencias para intervenir en el modelo animal de dermatitis atópica inducida por DNCB. Después de sacrificar ratones, el tejido de la piel dorsal se puso a tierra para el análisis RI-qPCR para evaluar si la referencia puede mejorar la reducción de la expresión de ARNm en filagrina, loricrina e involucrina después del tratamiento de DNCB. Los resultados mostraron que el grupo experimental de DNCB había reducido significativamente la expresión de ARNm de filagrina, loricrina e involucrina en comparación con el grupo de control. La expresión de ARNm de filagrina, loricrina e involucrina aumentó significativamente en el grupo tratado con referencia y dexametasona en comparación con el grupo DNCB (Figura 8).

Además, demostramos que la referencia tiene un efecto de rascado antialérgico. Utilizamos un agente de desgranulación de mastocitos, compuesto 48/80, para inducir el comportamiento de rascado en ratones BALB/c. Como se muestra en la Figura 9, encontramos que el tratamiento de referencia inhibió el comportamiento de rayado causado por el compuesto 48/80 (50 ug/sitio). La administración repetida de dosis más bajas y más altas de referencia (3 y 10 mg/kg) durante 5 días consecutivos redujo significativamente el número de rasguños causados ​​por el compuesto 48/80.