Efecto antiarrugas y antimelanogénico del extracto de metanol de Pradosia Mutisii Parte 2

Mar 31, 2023

4. Materiales y MétodosHaga clic en Cistanche Tubulosa para Blanqueamiento

4.1. Materiales

Cistanchetambién tiene la función de promover la producción de colágeno, lo que puede aumentar la elasticidad y el brillo de la piel y ayudar a reparar los dañoscelúlas de piel. CistancheFeniletanol glucósidostienen un efecto regulador negativo significativo sobretirosinasaactividad, y el efecto sobre la tirosinasa se muestra como una inhibición competitiva y reversible, lo que puede proporcionar una base científica para desarrollar y utilizar los ingredientes blanqueadores en Cistanche. Por lo tanto, la cistanche tiene un papel clave en el blanqueamiento de la piel. Puede inhibir la producción de melanina para reducir la decoloración y la opacidad; y promovercolágenoproducción para mejorar la elasticidad y la luminosidad de la piel. Debido al reconocimiento generalizado de estos efectos de la cistanche, muchospielblanqueoproductos han comenzado a infundir ingredientes a base de hierbas como Cistanche para satisfacer la demanda de los consumidores, aumentando así el valor comercial de Cistanche enblanqueamiento de la pielproductos En resumen, el papel de la cistanche en el blanqueamiento de la piel es crucial. Su efecto antioxidante y su efecto productor de colágeno pueden reducir la decoloración y la opacidad, mejorar la elasticidad y el brillo de la piel, y así lograr unaefecto blanqueador. Además, la amplia aplicación de Cistanche en productos para blanquear la piel demuestra que no se puede subestimar su papel en el valor comercial.

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Las células HaCaT, B16F10 y HEK293 se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE. UU.). Las células HDF primarias neonatales (SKU: FC-0001) se obtuvieron de Lifeline (Oceanside, CA, EE. UU.). El MTT, el suero bovino fetal (FBS), la solución salina tamponada con fosfato (PBS), la penicilina y el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se adquirieron de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), 5-hidroxi-2-hidroximetil-4H-piranona (ácido kójico), monofenol monooxigenasa (tirosinasa de hongos) , 4-hidroxifenil- -D-glucopiranósido (arbutina), -hormona estimulante de melanocitos ( -MSH), polietilenimina (PEI), 1-difenil-2picril-hidrazilo (DPPH) , 2,20 -casino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) sal de diamonio (ABTS), peróxido de hidrógeno (H2O2), retinol (RE), ácido ascórbico (AA) y 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se adquirieron de Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El reactivo TRIzol se adquirió de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Los conjuntos de cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa fueron sintetizados por Macrogen (Seúl, Corea), y la premezcla de PCR se adquirió de Bio-D Inc. (Seúl, Corea). Las formas fosfo o totales de p38, ERK, JNK y -actina se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EE. UU.).

4.2. Análisis de compuestos de Pm-ME por UHPLC, acoplado a espectrometría de masas en tándem de alta resolución con ionización por electropulverización negativa (UPLC/HRMS)

Se compró un extracto de metanol al 95 por ciento de P. mutisii (Pm-EE) de Korea Plant Extract Bank (Daejeon, Corea). El análisis de compuestos se realizó mediante análisis UPLC/HRMS (Orbitrap) utilizando el sistema Shimadzu Ultra Performance LCMS 805{{20}} (Shimadzu, Kioto, Japón) con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo equipado con fuente de ionización por electrospray (ESI) operando en modo negativo. Se utilizó el software Lab Solutions versión 5.2 (Shimadzu) como se informó anteriormente [68,69]. Las soluciones de muestra se inyectaron en una columna de fase inversa (BEH C8, 1,7 µm, 2,1 mm × 150 mm, Waters, Milford, MA, EE. UU.) con las precolumnas adecuadas. La columna se mantuvo a 40 ◦C. La fase móvil consistió en una mezcla de soluciones acuosas de ácido fórmico 10 mM (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) a un caudal de 0,25 mL/min. El gradiente lineal y los sujetos isocráticos de la fase móvil fueron 5 % B durante 0,8 min, 5–10 % B durante los siguientes 0,4 min, 10 % isocrático B durante 0,70 min, 10–15 % B durante los siguientes 0,5 min, 15 isocrático % B durante 1,30 min, 15–21 % B durante 1,30 min, isocrático 21 % B durante 1,20 min, 21–27 % B durante los siguientes 0,50 min, luego 27–50 % B durante 3,30 min, 50–1{{54} } por ciento de B durante 2.00 min, isocrático 100 por ciento de B durante 1,00 min y 100–5 por ciento de B durante 5 min. Al final del programa, la columna se equilibró en las condiciones iniciales durante 2,70 min. La presión osciló entre 45 y 50 MPa durante la ejecución cromatográfica. El efluente se introdujo en una fuente de electropulverización (temperatura de interfaz 300 ◦C, temperatura del bloque térmico 400 ◦C y voltaje capilar 3,0 kV). Se usó argón como gas de colisión y nitrógeno como gas nebulizador. La interfaz entre la cromatografía líquida y el detector de espectrometría de masas se realizó mediante ESI. Después de la exploración completa de iones precursores en el modo de iones negativos (es decir, [MH]-), los iones de producto se determinaron mediante espectrometría de masas en tándem. Para lograr una alta especificidad además de una alta sensibilidad, utilizamos el análisis en los modos de monitoreo de reacciones múltiples.

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4.3. Cultivo de células

Se cultivaron células HaCaT (una línea celular de queratinocitos humanos), células B16F10 (una línea celular de melanocitos murinos) y células HDF (una línea celular de fibroblastos humanos) en DMEM suplementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina, mientras que células HEK293 ( una línea celular de riñón embrionario humano) se incubaron en DMEM complementado con 5 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina. Todas las células se mantuvieron a 37 ◦C en una incubadora humidificada al 5 por ciento.

4.4. Ensayo de viabilidad celular

Las células HaCaT se sembraron a una densidad de 4 × 104 células por pocillo en una placa de 96-pocillos durante 24 h y luego se trataron con Pm-ME durante 24 h. Las células B16F10 se sembraron a una densidad de 1 × 104 células por pocillo en una placa de 96-pocillos y se trataron en las mismas condiciones. Las células HDF se sembraron a una densidad de 1 × 105 células por ml en una placa de 96-pocillos durante 24 h. La viabilidad celular de las líneas celulares mencionadas anteriormente se midió mediante el ensayo MTT, en el que las células se incubaron primero con 10 µL/pocillo de solución de MTT durante 3 h y luego se trataron con 100 µL de solución de parada de MTT (dodecilsulfato de sodio al 10 % con 10 por ciento de HCl). Después de 8 h, se midió la absorbancia del formazán solubilizado a 570 nm utilizando un lector de densidad óptica (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.).

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4.5. Actividad de eliminación de radicales libres

La actividad de eliminación de radicales de Pm-ME se determinó mediante el ensayo ABTS. El ensayo ABTS se realizó como se informó anteriormente [70]. Brevemente, se mezclaron soluciones de ABTS 7,4 mM y persulfato de potasio 2,4 mM en una proporción de 1:1 y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche para generar la radicalización de ABTS. Luego se mezclaron diferentes concentraciones de Pm-ME (0–200 µg/mL) o AA (100 µg/mL) con la solución de ABTS y se transfirieron a una placa 96-bien, seguido de un período de incubación de 30 min a 37 ◦C. La absorbancia se midió a 730 nm. El efecto de eliminación de ABTS se calculó de la siguiente manera:

Efecto de eliminación de ABTS (porcentaje) {{0}} [(A0−A1)/A100] × 100

donde A0 es la absorbancia de ABTS y A1 es la absorbancia de las muestras.

4.6. Tinción DAPI

Las células HaCaT se sembraron a una densidad de 4 × 105 células/ml en una 12-placa de pocillos que contenía cubreobjetos de vidrio redondos previamente esterilizados. Después de 24 h, las células se trataron con Pm-ME durante 30 min, se lavaron con PBS y se trataron con H2O2 (50 µM) durante 24 h. Las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con 1 ml de paraformaldehído al 3,7 % en PBS durante 10 min. Las células se lavaron con PBS dos veces más, se tiñeron con reactivo DAPI (1 µL/mL) durante 30 min y luego se lavaron con PBS dos veces más. A continuación, el cubreobjetos se montó en un portaobjetos de vidrio rectangular utilizando una solución de montaje y se dejó secar a temperatura ambiente durante 24 h [71]. Las muestras se examinaron utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse Ti (Nikon, Tokio, Japón).

4.7. Irradiación UVB y ensayo de cambio morfológico

Las células HaCaT se sembraron a una densidad de 4 × 105 células/ml en una placa de 6-pocillos. Las células se trataron con Pm-ME durante 30 min, se lavaron con PBS y luego se sometieron a 30 mJ/cm2 de radiación UVB (pico de absorbancia a 312 nm) usando una lámpara UVB (Bio-link BLX-312, Vilber Lourmat , Collegian, Francia) equipado con un filtro Kodak Kodacel K6808® que elimina todas las longitudes de onda por debajo de 290 nm, como se informó anteriormente [72]. Después del tratamiento con UVB, las células se trataron durante 24 h con Pm-ME según artículos anteriores [36]. Los cambios morfológicos se evaluaron utilizando un microscopio de contraste de fase invertido (Olympus, Tokio, Japón) conectado a una cámara de video con software de imágenes NIH (Bethesda, Maryland, EE. UU.).

4.8. Análisis semicuantitativo de RT-PCR

Las células HaCaT se sembraron a una densidad de 4 × 105 células/ml en una placa de 12-pocillos. Para el análisis UVB, los tratamientos celulares se llevaron a cabo como se describió previamente en la sección anterior. Para el tratamiento con H2O2, las células también se sembraron a una densidad de 4 × 105 células/ml en una placa de 12-pocillos, se trataron con Pm-ME durante 30 min y se lavaron con PBS. , y luego se trató con H2O2 (5{{60}} µM) durante 24 h. Para determinar el efecto humectante de Pm-ME en las células HaCaT, primero se trataron con el compuesto (0–100 µg/mL) y luego se sometieron a extracción de ARNm. Para determinar el papel de MAPK en el envejecimiento y la hidratación de la piel, las células HaCaT se pretrataron durante 30 min con 20 µM de SB203580 (inhibidor de p38), SP600125 (un inhibidor de JNK), seguido de incubación con H2O2 (50 µM) durante 24 h y Se extrajo el ARNm y se cuantificaron los niveles de MMP-9 y COX-2. Para determinar el papel de ERK, las células HaCaT se trataron con 20 µM de inhibidor de ERK (U0126) solo o con Pm-ME (100 µg/mL) durante 24 h, después de lo cual se midieron los niveles de HAS-2. Para determinar el efecto de Pm-ME en la expresión de Col1A1, se sembraron células HDF a una densidad de 1 × 105 células por ml en una placa 6-bien durante 24 h, tratadas con Pm-ME (0–100 µg/ mL) durante 24 h, y luego se sometió a extracción de ARNm. Para determinar si Pm-ME podría recuperar la expresión génica del colágeno disminuido después de la exposición a UVR y ROS, se sembraron células HDF a una densidad de 1 × 105 células por ml en una placa de pocillos 6-durante 24 h, tratadas con Pm-ME. ME (0–100 µg/mL) durante 30 min, sometido a H2O2 (50 µM) o radiación UVB (30 mJ/cm2) y luego cultivado con Pm-ME (0–100 µg/mL) durante 24 h. El ARNm total se extrajo usando el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo semicuantitativo de RT-PCR se llevó a cabo utilizando la transcriptasa inversa MuLV, como se describió anteriormente [37]. El ARN (1 µg) se incubó con oligo-dT15 a 70 ◦C durante 5 min y se mezcló con un tampón de primera cadena 5x, dNTP 10 mM y ditiotreitol 0,1 M, luego se incubó a 37 ◦C durante 5 min. y durante 60 min después de la adición de transcriptasa inversa MuLV (2 U). Las reacciones se terminaron a 70 ◦C durante 10 min y el RNA total se eliminó añadiendo RNase H. La reacción de PCR se realizó con la mezcla de incubación (2 µL cDNA, 4 M 50 y 30 primers, tampón 10x (10 mM Tris –HCl, pH 8,3, KCl 50 mM, Triton X al 0,1 %-100), dNTPs 250 µM, MgCl2 25 mM y 1 unidad de polimerasa Taq (Promega, Madison, WI, EE. UU.)) bajo la siguiente incubación condiciones: tiempo de desnaturalización de 45 s a 94 ◦C, tiempo de recocido de 45 s a 55-60 ◦C, tiempo de extensión de 60 s a 72 ◦C y extensión final de 7 min a 72 ◦C tras 25-30 ciclos. Los cebadores (Bioneer, Seúl, Corea) utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla 1.

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4.9. Transfección de plásmidos y ensayo de gen informador de luciferasa

Para el ensayo del gen indicador de luciferasa, primero se sembraron células HEK293 y HDF a una densidad de 1 × 105 células/pocillo en 24-placas de pocillos. A continuación, ambas líneas celulares se transfectaron con plásmidos pCMV0Red Fireffly Luc que contenían 1 kb de región promotora Col1A1 y genes de -galactosidasa (como control de transfección) (00,8 µg/ml). La transfección se logró utilizando el método PEI durante 24 h. A esto le siguió el tratamiento con el compuesto (0-100 µg/ml) durante 24 h más. Se utilizó retinol (10 µg/ml), un compuesto que regula positivamente el gen Col1A1 [60], como control positivo. La actividad de luciferasa se midió de acuerdo con Luciferase Assay System (Promega), como se informó anteriormente [37]. Los lisados ​​celulares se centrifugaron a máxima velocidad durante 10 min en una microcentrífuga Eppendorf. Luego, se incubaron 50 µL de la fracción sobrenadante con 50 µL de sustrato de luciferasa y se determinó la actividad relativa de luciferasa con un Luminoskan Ascent (Thermo Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia). La actividad de luciferasa se normalizó a actividad de -galactosidasa y se midió a 405 nm mediante reacción enzimática con X-gal y lisado durante 5 min a 37 ◦C.

4.10. Ensayos de melanogénesis y secreción de melanina

Las células B16F10 se trataron con -MSH (100 nM) y Pm-ME (0–100 µg/mL) o arbutina (1 mM) durante 48 h. Para determinar la secreción de melanina de las células, se midió la absorbancia del medio de cultivo celular a 475 nm utilizando un lector de microplacas Spectramax 250 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). Las células se lavaron con PBS frío y se recolectaron. Para medir el contenido de melanina, las células se lisaron con 20 ml de tampón de lisis celular (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaF 20 mM, fosfato de glicerol 25 mM, pH 7,5, NaCl 120 mM y NP-40 al 2 % en agua destilada). agua) y se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 min. Se retiraron los sobrenadantes y el sedimento se disolvió en 100 µl de NaOH 1 M que contenía DMSO al 10 por ciento a 60 ◦C durante 30 min. La absorbancia de cada fracción se midió a 405 nm utilizando un lector de microplacas Spectramax 250 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.) [36].

4.11. Ensayo de tirosinasa

Para determinar la actividad de la enzima tirosinasa, se incubaron 50 mL de L-DOPA, 50 mL de Pm-ME (0–400 µg/mL) o 300 µM de ácido kójico durante 15 min con tirosinasa de hongo (100 U/mL) a temperatura ambiente. La absorbancia de cada muestra se midió a 475 nm utilizando un lector de microplacas Spectramax 250 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.).

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4.12. Análisis de Western Blot

Las células HaCaT se pretrataron con Pm-ME (0–100 µg/mL) durante 30 min y luego se trataron con H2O2 (50 µM) durante 24 h. Los lisados ​​​​celulares se prepararon como se describió previamente por Park et al. [73]. Los lisados ​​se sometieron a electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida seguida de transferencia a membranas de fluoruro de polivinilideno. Utilizando anticuerpos específicos, se detectaron y visualizaron formas totales y fosforiladas de proteínas diana mediante reactivos de quimioluminiscencia.

4.13. Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Se utilizó una prueba de Mann-Whitney para comparar las diferencias estadísticas entre los grupos experimental y de control. Un valor de p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS (SPSS, Chicago, IL, EE. UU.).

Disponibilidad de datos:Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

Contribuciones de autor:LRL, M.-YK, BCY y JYC diseñaron los experimentos. LRL realizó los ensayos de laboratorio. LRL, M.-YK, BCY y JYC analizaron los datos. LRL, M.-YK, BCY y JYC escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Fondos: Esta investigación, incluido el APC, fue financiada por el Centro Nacional del Cáncer de la República de Corea (Número de subvención: 1810960-1).

Conflictos de interés: Los autores no tienen ningún conflicto de interés que declarar.

abreviaturas

Pm-ME Extracto metanólico de P. mutisii

Metaloproteinasas de matriz de MMP

-MSH -hormona estimulante de melanocitos
Especies reactivas de oxígeno ROS
Ácido kójico KA

L-DOPA L-3,4-dihidroxifenilalanina

luz ultravioleta ultravioleta
DAPI 6-diamidino-2-fenilindol
Peróxido de hidrógeno H2O2
Proteínas quinasas activadas por mitógeno MAPK
Quinasa regulada por señal extracelular ERK
JNK c-Jun-N-terminal quinasa
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio
ABTS 2,2'-Azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) sal de diamonio
ácido ascórbico AA
RT-PCR transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa

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