PARTE 1 Efectos similares a los antidepresivos del extracto de Cistanche tubulosa en ratas con estrés crónico impredecible a través de la restauración de la homeostasis de la microbiota intestinal

La creciente evidencia muestra que los trastornos neuropsiquiátricos, como la depresión, están relacionados con el microbioma intestinal a través del eje intestino-cerebro.Cistanches Herbaes bien conocido para el tratamiento de la deficiencia de "yang de riñón" en la medicina tradicional china (MTC) y se ha utilizado para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas en los últimos años. En este estudio, se estableció el modelo de depresión inducida por estrés crónico impredecible (CUS, por sus siglas en inglés) para explorar el impacto deCistanche tubulosa(CTE) en pruebas de comportamiento, neurotransmisores de monoamina y factores neurotróficos en el hipocampo y el colon, composición de la microbiota intestinal y producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC). Además, se utilizó un análisis de correlación para evaluar la relación funcional entre la microbiota intestinal alterada, los neurotransmisores y las neurotrofinas alterados en el hipocampo y el colon, y la concentración alterada de AGCC. CTE mejoró significativamente los comportamientos similares a la depresión en ratas bajo CUS. El CTE restauró el nivel cerebral de 5-hidroxitriptamina (5-HT) y la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en ratas CUS. La abundancia relativa de microbiota intestinal y las concentraciones de acetato y ácido hexanoico también podrían verse moduladas por el tratamiento con CTE. Además, demostramos que la aplicación de CTE en ratas CUS condujo a una fuerte correlación entre la composición de la microbiota intestinal interrumpida, los niveles de neurotransmisores del hipocampo y la producción de SCFA de metabolitos neuroactivos. En conjunto, estos resultados identifican a la CTE como un tratamiento potencial para los síntomas depresivos al restaurar la homeostasis de la microbiota intestinal para los trastornos del eje microbiota-intestino-cerebro, abriendo nuevas vías en el campo de la neuropsicofarmacología.

Palabras clave: Cistanche tubulosa, antidepresivo, estrés crónico impredecible, microbiota intestinal, eje microbiota-intestino-cerebro

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INTRODUCCIÓN

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong en chino) se registra oficialmente como los tallos suculentos secos deCistanche desertica(YC Ma) yCistanche tubulosa(Schrenk) en la Comisión de Farmacopea China (2015). Es una conocida medicina tradicional china (MTC) para tratar la deficiencia renal, la impotencia, la infertilidad femenina, la leucorrea mórbida, la metrorragia profusa,

equinacósidoen cistanche puede promovercicatrización de la herida

y estreñimiento senil (Comisión de Farmacopea China, 2015). Estudios previos han revelado varios constituyentes químicos principales deCistanches Herba, incluidos los glucósidos de feniletanoide (PhG), los iridoides y los glucósidos de iridoide, los lignanos, los alditoles, los oligosacáridos y los polisacáridos. El análisis farmacológico ha demostrado que Cistanches Herba exhibe una amplia gama de actividades neuroprotectoras, inmunomoduladoras, antiinflamatorias y hepatoprotectoras (Jiang y Tu, 2009; Fu et al., 2017). Los PhG se han considerado como los principales componentes activos de Cistanches Herba que poseen diversas actividades farmacológicas, como neuroprotectoras, inmunomoduladoras, antiinflamatorias, hepatoprotectoras, antioxidantes, etc. (Jiang y Tu, 2009; Fu et al., 2017). Cistanches Herba se registró originalmente en el Clásico de la Medicina Herbal ("Shennong Bencao Jing" en chino), un libro muy conocido sobre plantas medicinales escrito entre 200 y 250 dC, como una "hierba alta" que puede regular "cinco (vísceras)". ) tensiones y siete (comer en exceso, ira, humedad, frío, preocupación, viento y lluvia, y miedo) deficiencias" (Huang, 1982). Hoy en día, Cistanches Herba es ampliamente aceptado como un tónico a base de hierbas para la debilidad general (Fu et al., 2017).C. tubulosaLas cápsulas de glucósidos (Memoregain®) se utilizan para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (Guo et al., 2013). Un sistema dopaminérgico disfuncional es una de las patogenias clave de la hipótesis de las monoaminas de la depresión (Duman et al., 1997; Krishnan y Nestler, 2008). Se ha descubierto que el echinacósido (uno de los PhG) y los PhG de la salsa Cistanche protegen las neuronas dopaminérgicas contra la neurotoxicidad de la dopamina (DA) inducida por 1-metil-4-fenil-1,2,3,{ {8}}tetrahidropiridina (MPTP) que puede aumentar los niveles de DA en el cuerpo estriado de ratones C57 (Tian y Pu, 2005; Geng et al., 2007). Además, catalpol y genipósido son dos iridoides representativos en Cistanches Herba, y se ha descubierto que mejoran el comportamiento similar a la depresión inducido por el estrés impredecible crónico (CUS) al restaurar las disfunciones del eje hipotálamo-pituitario-suprarrenal (HPA) y catalpol puede regular al alza el cerebro. expresión del factor neurotrófico derivado (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Además, la última publicación proporciona una nueva evidencia de que la decocción de Cistanches Herba redujo significativamente el período de inmovilidad en la prueba de suspensión de la cola del ratón, lo que sugiere fuertemente que Cistanches Herba posee cualidades potenciales similares a las de los antidepresivos (WangD. et al., 2017).

La medicina tradicional china atrae cada vez más atención como tratamiento de la depresión debido a sus efectos secundarios comparativamente moderados (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Varios tipos de TCM, como compuestos individuales de las drogas crudas (ginsenósido Rb1, ginsenósido Rg3 y Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), materiales medicinales chinos únicos (raíz de Panax ginseng, rizoma de Acorus tatarinowii y Morinda Officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) y decocciones de medicina tradicional china (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan y Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) han sido profundamente estudiados y demostrados para revertir o mitigar los síntomas similares a la depresión. Por ejemplo, se descubrió que Kai-Xin-San alivia notablemente los síntomas de depresión inducida por CUS en ratas al aumentar la cantidad de neurotransmisores, factores neurotróficos y sus receptores correspondientes, y al promover la expresión de sinaptotagmina y la densidad de las espinas dendríticas (Yan et al. , 2016).

Sin embargo, los estudios previos de la medicina tradicional china se basan en los resultados de las pruebas de comportamiento similares a los depresores y se centran en el mecanismo de acción farmacológico convencional. La conexión entre la eficacia antidepresiva de la MTC administrada por vía oral y la microbiota intestinal no se comprende bien. La creciente evidencia respalda que la microbiota intestinal juega un papel crucial en la regulación de las funciones cerebrales, particularmente la depresión y otros trastornos relacionados con el estrés (Foster y Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Por ejemplo, el estrés crónico da como resultado una desregulación de la estructura microbiana del intestino de la rata, con una disminución en la relación Firmicutes/Bacteroidetes y, más específicamente, una disminución en la abundancia relativa de Lactobacillus y un aumento en Oscillibacter (Meng et al., 2017). Además, el trasplante fecal de microbiota desregulada de pacientes deprimidos a ratones libres de gérmenes confirió un fenotipo similar a la depresión en estos animales, lo que indica que la microbiota intestinal desregulada causa síntomas conductuales y fisiológicos de depresión y ansiedad (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). En experimentos con animales, se descubrió que algunos moduladores de la microbiota, como los probióticos y los prebióticos, mejoran el comportamiento similar a la depresión en ratones con estrés crónico al mejorar la microbiota intestinal (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017). ).

Dada la asociación entre la microbiota intestinal y el desarrollo de enfermedades, así como la plasticidad de la estructura de la microbiota intestinal, decidimos investigar los efectos de la microbiota intestinal para mediar en la depresión que atrajeron nuestra atención y fueron investigados (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). Para lograr esto, se realizó un análisis Meta stats combinado de secuenciación del gen 16S rRNA (White et al., 2009) para analizar la composición de la microbiota intestinal. En el presente estudio,C. tubulosafue seleccionado para evaluar sus efectos similares a los antidepresivos porque tiene un nivel más alto de PhG en comparación conC. deserticola. Se estableció un modelo de depresión inducida por CUS en ratas para explorar el impacto deExtracto de C. tubulosa(CTE, que consta de 48,6 por ciento de PhG, 6,9 por ciento de glucósidos iridoides y 20,0 por ciento de sacáridos totales) en pruebas de comportamiento, neurotransmisores de monoamina y factores neurotróficos en el hipocampo y el colon, composición de la microbiota intestinal y cadena corta producción de ácidos grasos (SCFA). Además, se estudió la relación funcional entre la microbiota intestinal alterada, los neurotransmisores modificados y las neurotrofinas tanto en el hipocampo como en el colon, y la concentración alterada de AGCC. El análisis de correlación se utilizó para corroborar la evidencia de que la CTE se dirige a la microbiota intestinal para el tratamiento de la depresión mediante la modulación del eje microbiota-intestino-cerebro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

La fluoxetina (FLX) se adquirió de Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, China). Los kits de ELISA de 5-hidroxitriptamina (5-HT), norepinefrina (NE) y BDNF se adquirieron en el Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). El acetonitrilo de grado HPLC se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania). El agua desionizada se preparó a partir de agua destilada utilizando un sistema de purificación de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Todos los demás reactivos y productos químicos utilizados fueron de grado analítico.

tallos secos deC. tubulosase recogieron del condado de Hetian (Xinjiang, China). Las muestras de los especímenes del comprobante fueron autenticadas por el profesor Xiaobo Li y depositadas en el herbario de la Facultad de Farmacia de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (Shanghai, China). El polvo homogéneoC. tubulosalos tallos se suspendieron diez veces en etanol al 70 por ciento y se sometieron a reflujo térmico tres veces, cada una durante 1 hora a 100 grados. Los extractos se filtraron con gasa, se evaporaron al vacío a 65 grados y se liofilizaron. La muestra se volvió a disolver y luego se separó con resina macroporosa D101. Después de la adsorción, se descartó la fracción eluida con agua. El CTE se obtuvo después de eluir con etanol al 40 por ciento, luego se evaporó al vacío a 65 grados y se liofilizó.

Análisis de Composición Química de CTE

El contenido relativo de PhGs en CTE se determinó por espectrofotometría UV a 330 nm usando equinacósido como estándar. El contenido relativo de iridoides y glucósidos iridoides se midió por espectrofotometría UV con el método de doble longitud de onda para evitar la interferencia espectral de los PhG (se utilizó 237 nm para la cuantificación espectroscópica, se utilizó un punto isosbéstico de 280 nm para la longitud de onda de referencia), se utilizó genipósido como el estándar. El contenido de carbohidratos totales de CTE se determinó por el método colorimétrico de fenol-ácido sulfúrico con glucosa como estándar (Chow y Landhausser, 2004).

Los principales componentes químicos de CTE se caracterizaron por UPLC-Q-TOF-MS. El análisis UPLC-Q-TOF-MS se realizó en un sistema Waters ACQUITY UPLC (Waters Corp., Milford, MA, Estados Unidos) con una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 µm, Waters Corp., Estados Unidos) mediante elución en gradiente utilizando 0,1 por ciento de ácido fórmico acetonitrilo (A) y 0,1 por ciento de ácido fórmico en agua (B) a una caudal de 0,4 ml/min. El perfil de gradiente fue: 0-5 min (A: 5-20 por ciento), 5-7.5 min (A: 20-30 por ciento), 7.5-10 min ( A: 30-70 por ciento), 10-11 min (A: 70-100 por ciento), y se mantuvo durante 1,5 min. El gradiente se recicló de nuevo al 5 por ciento en 0,5 min y se mantuvo durante 2,5 min para la siguiente ejecución. El volumen de inyección fue de 3 [il. La temperatura del horno de columna se ajustó a 35 grados.

La espectrometría de masas se llevó a cabo utilizando un espectrómetro de masas Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, Estados Unidos). La ionización se realizó en el modo de electropulverización negativa (ESI). Los parámetros MS fueron los siguientes: voltaje capilar, 2.0 kV; tensión de cono, 20 V; temperatura de la fuente, 120 grados; temperatura de desolvatación, 500 grados; flujos de gas de cono y desolvatación, 50 y 1,000 L/h, respectivamente. Para una medición precisa de la masa, se usó leucina-encefalina como masa de bloqueo para generar un ion [MH]- (m/z 554,2615). Se llevó a cabo un experimento MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) en dos funciones de barrido de la siguiente manera: función 1 (baja energía): m/z 50-1,000, 0,25 s de tiempo de barrido, 0,02 s de retraso entre barridos , 6 eV energía de colisión; función 2 (alta energía): m/z 50-1,000, 0,25 s de tiempo de escaneo, 0,02 s de retraso entre escaneos, rampa de energía de colisión de 20-45 eV. Los datos se procesaron con el software UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, Estados Unidos).

cistanchepuedenmejorar la función renal

Experimentos con animales

Se adquirieron ratas macho Sprague-Dawley (200 × 20 g) de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, China) y se alojaron en el Centro de animales de laboratorio de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (Shanghai, China). Los animales se alojaron en grupos a temperatura ambiente controlada (25 ± 2 grados, 55 ± 10 por ciento de humedad relativa) con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h. A las ratas se les permitió el libre acceso a comida y agua regulares para ratas de laboratorio durante 1 semana. Las instalaciones y protocolos para animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (Shanghai, China).

Después de 1 semana de aclimatación, 40 ratas ingenuas se sometieron a un período de 72 h de entrenamiento con sacarosa y pruebas de referencia de sacarosa. Las ratas se dividieron en cinco grupos (n=8) en función de su preferencia por la sacarosa en la prueba de referencia de sacarosa (Figura complementaria S1). El grupo de control y el grupo CUS recibieron solución salina (10 ml/kg). Para los otros tres grupos, CTE a dosis alta (CTEH) (400 mg/kg), dosis baja (CTEL) (200 mg/kg) y FLX (10 mg/kg) se administraron por vía intragástrica 1 h antes del procedimiento CUS (8:00 a. m. a 9:00 a. m.) en el transcurso de 4 semanas.

Se desarrolló estrés crónico impredecible como se describió previamente (Willner, 1997; Xue et al., 2013), excepto para el grupo de control no estresado, se aplicó una serie de estresores a las ratas: iluminación estroboscópica de baja intensidad durante la noche (120 flashes/ min), ruido blanco (100 dB) durante 1 h, privación de agua durante 24 h, botellas de agua vacías durante 1 h (después de la privación de agua), privación de alimentos durante 24 h, nado forzado (5 min), restricción física ({{11 }} h), jaula sucia durante 24 h (200 ml de agua en 100 g de lecho de aserrín), pellizco de cola (1 min), inclinación de la jaula de 45 grados durante 24 h, descarga durante 30 min e iluminación durante la noche (12 h). Los factores estresantes se aplicaron de forma continua y aleatoria durante 4 semanas, cuyos detalles se describen en la Tabla complementaria S1. El alimento y el agua estuvieron disponibles libremente para las ratas de control no estresadas, que permanecieron tranquilas en otra habitación, excepto durante el período de privación de 14 h antes de cada prueba de sacarosa. Una rata murió durante el procedimiento CUS. La prueba de natación forzada (FST) se realizó después de

4 días de administración aguda y después de 28 días de estrés, se realizaron la prueba de preferencia de sacarosa (SPT) (día 29), la prueba de campo abierto (OFT) (día 31) y la prueba de alimentación con supresión de novedad (NSFT) (día 33). El esquema de un diseño para CUS y pruebas de comportamiento se muestra en la Figura complementaria S2.

Se realizó una prueba de natación forzada como se describió anteriormente (Porsolt et al., 1978). El procedimiento consistió en sesiones de preprueba y prueba, utilizando el mismo aparato y condiciones (diámetro 20 cm, altura 45 cm, conteniendo 25 cm de agua mantenida a 26 grados). Durante la sesión previa a la prueba, se obligó a las ratas a nadar durante 15 min; 24 h más tarde, las ratas se colocaron en el mismo aparato para una sesión de prueba de natación de 5 min. El comportamiento de natación dentro

Se observaron 5 min con una cámara de video, y se midió y analizó la duración de la inmovilidad.

Para SPT, las ratas se entrenaron primero para consumir una solución de sacarosa al 1 por ciento (v/v) durante 72 h antes de la SPT. La prueba de referencia de sacarosa antes del procedimiento CUS y la SPT al final de CUS se realizaron como se describió anteriormente (Xue et al., 2013).

La prueba de campo abierto se llevó a cabo al final del procedimiento CUS, el aparato y el método fueron los mismos que se detallaron anteriormente (Xue et al., 2013). Se utilizó un sistema de seguimiento de video (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) para registrar la distancia total recorrida.

La prueba de alimentación suprimida por novedad se evaluó como se describió anteriormente (Xue et al., 2013) y se registró y analizó la latencia para comenzar a comer dentro de los 5 minutos.

Medición de Neurotransmisores y Factores Neurotróficos

Después de las pruebas de comportamiento, se obtuvieron al menos cuatro gránulos fecales de cada rata, se colocaron en tubos cónicos estériles y se congelaron inmediatamente a -80 °C para el análisis de la comunidad microbiana y SCFA. Después de eso, se sacrificaron las ratas; el hipocampo y el colon fueron aislados y pesados ​​inmediatamente. Las muestras de tejido se lavaron con solución salina, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80°C para su almacenamiento. Después de la descongelación secuencial a -20°C y 4°C, las muestras de tejido se homogeneizaron en solución salina y se centrifugaron durante 25 min a 2500 rpm/4°C. El sobrenadante resultante se recogió y almacenó a 4°C hasta su uso. Los niveles de 5-HT en el hipocampo y el colon, NE en el hipocampo y BDNF en el hipocampo se determinaron mediante kits ELISA comerciales de acuerdo con los protocolos del fabricante (Hou et al., 2017).

Análisis del perfil composicional de la microbiota intestinal

El ADN total de la microbiota intestinal de las muestras fecales se extrajo como se describió anteriormente (Wei et al., 20{{20}}4). Cada muestra fecal (0.2 g) se mezcló en 1 ml de PBS y se homogeneizó completamente dos veces, luego se centrifugó a 200 g durante 6 min. Se añadió al sobrenadante 20 x 20 por ciento de PVP y se centrifugó a 300 g durante 6 min. A continuación, el sobrenadante resultante se centrifugó a 12,000 g durante 6 min y se recogieron los sedimentos celulares. Los sedimentos celulares se lavaron con PBS y luego se resuspendieron en 300 \mu l de lisados ​​(NaCl 150 mM, EDTA·Na2·2H2 100 mM, pH 8,0). La suspensión se mezcló con 100 µl de solución de lisozima (100 mg/ml) y 20 µl de ARNasa al 1 por ciento, se bañó en agua caliente a 37 °C durante 30 min y luego se añadieron 300 µl de lisado II (NaCl 100 mM, base Tris 500 mM, pH 8,0) . La suspensión de células se mezcló suavemente con 50 ± 20 por ciento de SDS, se bañó en hielo durante 5 min. A continuación, el ADN se purificó mediante extracción secuencial con PVP al 1 por ciento, fenol equilibrado con Tris y alcohol isoamílico-cloroformo (vol/vol/vol/vol, 3,125:25:24:1) y alcohol isoamílico-cloroformo (vol/vol, 24 :1) seguido de precipitación a -20°C durante 2 h con dos volúmenes de etanol y 50 µl de NaAc 3 M. El ADN se recogió por centrifugación, se secó al aire y se disolvió en 100 µl de agua desionizada estéril. La pureza del ácido nucleico se probó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos). A continuación, el ADN genómico total se sometió a amplificación por PCR utilizando cebadores específicos de las regiones V3-V4 del gen 16S rRNA: cebador directo 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') y cebador inverso 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). Los amplicones de PCR se purificaron con perlas Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Estados Unidos) y se cuantificaron con el kit de ensayo PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Después del paso de cuantificación individual, los amplicones se agruparon en cantidades iguales y se realizó una secuenciación de 2 x 300 pb por pares utilizando la plataforma Illumina MiSeq con MiSeq Reagent Kit v3 en Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, China). Las lecturas de extremos emparejados se ensamblaron con el software FLASH (versión 1.2.7), las lecturas de secuencia sin procesar se recortaron en calidad con el software QIIME (versión 1.8.0) para eliminar los códigos de barras que no coincidían y las secuencias por debajo de los umbrales de longitud. Posteriormente, las secuencias filtradas se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) con un umbral del 97 por ciento de similitud de secuencia utilizando QIIME con UCLUST. La diversidad beta se realizó en QIIME para el análisis de coordenadas principales UniFrac ponderado (PCoA). Finalmente, se utilizó el software Meta stats para comparar las diferencias en la composición taxonómica microbiana intestinal entre diferentes grupos.

Análisis de concentración de SCFA

La concentración de SCFA (incluidos acetato, propionato, butirato, isobutirato, ácido valérico, ácido isovalérico y ácido hexanoico) en muestras fecales de rata se determinó mediante un cromatógrafo de gases GC{{0}} (Shimadzu, Japón), ajustado con columna DB-FFAP (30 mx 0.25 mm x {{10}}.25 cm, Agilent, Estados Unidos). Se prepararon soluciones estándar de acetato, propionato, butirato, isobutirato, ácido valérico, ácido isovalérico y ácido hexanoico a 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01 y 0,005 mg/ml con éter (incluido 2-ácido metilvalérico 0,1 mg/ml como patrón interno), respectivamente. Cada muestra fecal (0,2 g) se mezcló en 0,8 ml de agua desionizada mediante agitación vorticial y centrifugación a 5,000 rpm durante 20 min a 4 °C, se agregaron 450 il de sobrenadante por 50 il 50 por ciento de H2SO4 y 500 il de patrón interno solución, se agitó en vortex por 1 min y se centrifugó a 12,000 rpm por 10 min, luego la mezcla se colocó en 4OC por 30 min. El sobrenadante se tomó para el análisis de GC. El análisis de SCFA se llevó a cabo como se describió anteriormente (Wang et al., 2016).

Análisis estadístico

Todos los datos se presentaron como medios 土 SEM. El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Estados Unidos) con un ANOVA de una vía seguido de la prueba de Dunnett o la prueba t de Student. Los datos se excluyeron de los análisis si superaban las dos desviaciones estándar de la media. Los valores de p < 0.05="" se="" consideraron="" estadísticamente="" significativos.="" se="" empleó="" el="" análisis="" de="" correlación="" de="" pearson="" para="" evaluar="" la="" asociación="" entre="" la="" abundancia="" relativa="" de="" microbiota="" intestinal,="" scfa,="" hipocampo="" 5-ht,="" ne="" y="" niveles="" de="" bdnf,="" y="" colon="">

RESULTADOS

Análisis de Composición Química de CTE

Primero se analizó exhaustivamente la composición química de CTE. Como se muestra en la Tabla 1, los PhG fueron el componente principal de CTE, con un contenido relativo del 48,6 por ciento, los iridoides y los glucósidos iridoides fueron el 6,9 por ciento y los sacáridos totales fueron el 20,0 por ciento. Estas

Luego se caracterizaron los componentes de CTE usando UPLC-Q-TOF-MS. Se detectó e identificó un total de 27 constituyentes, incluidos 20 constituyentes de PhG, cinco iridoides y glucósidos iridoides, y dos oligosacáridos. La información detallada, incluido el tiempo de retención, la MS precisa y los iones de fragmentos de MS/MS, se enumeran en Información de apoyo (Tabla complementaria S2). El cromatograma de iones totales (TIC) UPLC-Q-TOF-MS de CTE se muestra en la Figura complementaria S3.

CTE mejoró los comportamientos depresivos en ratas CUS

En ratas CUS, el tiempo total de inmovilidad en el FST y la latencia para comer en NSFT se redujeron significativamente con el tratamiento con CTE, y la preferencia por la sacarosa en SPT y la distancia total recorrida en OFT aumentaron.

La Figura 1A ilustra los efectos agudos de CTE en el tiempo de inmovilidad en FST en ratas CUS. En comparación con el grupo modelo CUS, 3- días de administración oral aguda de CTE redujo significativamente el tiempo de inmovilidad total en FST [ANOVA unidireccional, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Un análisis post hoc posterior reveló que la administración

CUADRO 1|composición química deC. tubulosaEl extracto de CTE con el grupo de dosis alta (prueba de Dunnett, p < {{0}}.05) y el grupo de dosis baja (prueba de Dunnett, p < 0.05) mostró una marcada reducción en el tiempo total de inmovilidad en el FST .

Los efectos de CTE sobre la preferencia de sacarosa en SPT en ratas CUS se muestran en la Figura 1B. El procedimiento de estrés de veintiocho días causó una disminución significativa en la preferencia por la sacarosa en el grupo del modelo CUS en comparación con las ratas de control no estresadas [ANOVA unidireccional, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; prueba de Dunnett, p < 0,05],="" lo="" que="" indica="" que="" el="" modelo="" cus="" se="" desarrolló="" con="" éxito.="" como="" control="" positivo,="" el="" grupo="" flx="" aumentó="" significativamente="" la="" preferencia="" por="" sacarosa="" en="" ratas="" cus="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05],="" demostrando="" la="" validez="" predictiva="" del="" modelo="" cus.="" la="" administración="" oral="" crónica="" de="" cte="" en="" el="" grupo="" de="" dosis="" alta="" mostró="" efectos="" clave="" en="" la="" preferencia="" por="" la="" sacarosa="" [anova="" de="" una="" vía,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,01],="" que="" lo="" restauró="" a="" niveles="" normales="" en="" ratas="" cus.="" el="" cte="" con="" el="" grupo="" de="" dosis="" baja="" mostró="" una="" tendencia="" creciente="" pero="" el="" efecto="" no="" fue="" estadísticamente="" significativo="" (prueba="" de="" dunnett,="" p="">

Como se muestra en la Figura 1C, también se utilizó la distancia total recorrida en OFT para evaluar los efectos de CTE en ratas CUS. En comparación con las ratas sin estrés, el grupo modelo CUS manifestó una distancia total mucho más corta [ANOVA unidireccional, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Prueba de Dunnett, p < 0.001]="" después="" de="" una="" 4-semana="" de="" exposición="" a="" cus,="" y="" el="" tratamiento="" flx="" de="" control="" positivo="" aumentó="" la="" distancia="" total="" en="" ratas="" cus="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05].="" la="" administración="" oral="" diaria="" de="" cte="" con="" dosis="" alta="" y="" dosis="" baja="" mostró="" un="" efecto="" evidente="" sobre="" la="" distancia="" total="" en="" ratas="" cus="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,01="" para="" el="" grupo="" de="" dosis="" alta,="" p="">< 0,001="" para="" el="" grupo="" de="" dosis="" baja,="" respectivamente].="" la="" figura="" complementaria="" s4="" muestra="" el="" mapa="" de="" seguimiento="" de="" actividad="" en="">

La Figura 1D muestra los efectos de CTE sobre la latencia para comer en el NSFT en ratas CUS. El procedimiento de estrés de veintiocho días provocó un aumento significativo en la latencia para comenzar a comer en el grupo modelo CUS en comparación con las ratas de control no estresadas [ANOVA unidireccional, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; prueba de Dunnett, p < 0,05],="" lo="" que="" indica="" que="" el="" modelo="" cus="" se="" desarrolló="" con="" éxito.="" la="" administración="" oral="" a="" largo="" plazo="" de="" cte="" con="" una="" dosis="" alta="" mostró="" efectos="" evidentes="" sobre="" la="" latencia="" para="" comenzar="" a="" comer="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" cus="" (prueba="" t="" de="" student,="" t="2.759," p="">< 0.05),="" mientras="" que="" una="" dosis="" baja="" de="" cte="" mostró="" sin="">

CTE restauró el nivel de neurotransmisores y factores neurotróficos en ratas CUS

Los efectos de CTE sobre los niveles de {{{{1{0}}}}HT y NE en el hipocampo de ratas CUS se muestran en las Figuras 2A,B. El procedimiento de estrés de cuatro semanas causó una reducción significativa de 5-HT [ANOVA unidireccional, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01; Prueba de Dunnett, p < 0.001]="" y="" ne="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001]="" concentración="" en="" el="" hipocampo="" de="" ratas="" cus="" en="" comparación="" con="" la="" del="" grupo="" de="" control,="" y="" el="" antidepresivo="" flx="" restauró="" significativamente="" los="" niveles="" de="" 5-ht="" en="" el="" hipocampo="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001].="" después="" de="" la="" administración="" oral="" de="" cte="" en="" el="" grupo="" de="" dosis="" alta,="" se="" observó="" un="" aumento="" significativo="" en="" el="" nivel="" de="" 5-ht="" [anova="" de="" una="" vía,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001]="" mientras="" que="" las="" concentraciones="" de="" ne="" no="" cambiaron.="" de="" manera="" similar,="" la="" expresión="" de="" bdnf="" se="" redujo="" significativamente="" en="" el="" grupo="" modelo="" cus="" en="" comparación="" con="" las="" ratas="" no="" estresadas="" (prueba="" t="" de="" student,="" t="4.171," p="">< 0.01)="" (figura="" 2c).="" tanto="" la="" administración="" oral="" a="" largo="" plazo="" de="" cte="" con="" dosis="" alta="" (prueba="" t="" de="" student,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" como="" flx="" (prueba="" t="" de="" student,="" t="2.263," p="">< 0.05="" )="" aumentó="" la="" expresión="" de="" bdnf="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" modelo="" cus.="" cte="" con="" dosis="" bajas="" no="" mostró="" un="" efecto="" significativo="" sobre="" la="" expresión="" de="">

El nivel de {{0}}HT en el colon de las ratas CUS fue diferente al del hipocampo, y el procedimiento de estrés de 4-semana no tuvo impacto en el 5-HT del colon (Figura 2D ). Por el contrario, la administración oral de CTE con dosis altas estimuló los niveles de 5-HT en el colon en comparación con el grupo modelo CUS (prueba t de Student, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" con="" una="" dosis="" baja="" no="" mostró="" ningún="" efecto="" sobre="" el="" nivel="" de="" ht="" del="" colon="">

CTE reguló la composición microbiana intestinal de ratas CUS

El efecto de CTE en la composición microbiana intestinal de ratas CUS se evaluó mediante el método basado en la secuenciación del gen 16S rRNA. Se encontró que 28 días de administración oral de CTE alteraron la composición microbiana intestinal de ratas CUS e impactaron varios

niveles taxonómicos microbianos entre grupos de ratas (nivel de clase 1, nivel de orden 1, nivel de familia 1, nivel de género 8 y nivel de especie 2). Esto sugiere que la comunidad microbiana intestinal podría desempeñar un papel en los efectos antidepresivos de la ETC. En la Tabla 2 se muestra información detallada de taxones microbianos intestinales significativamente alterados en diferentes niveles taxonómicos.

La secuenciación de MiSeq arrojó un total de 2 132 980 lecturas sin procesar, luego del proceso de control de calidad, eliminación de ruido y eliminación de quimeras. A continuación, las lecturas se agruparon en OTU, que se asignaron a taxones desde el nivel de phylum hasta el de especie. El estudio del análisis de diversidad beta se realizó para explorar la similitud de los patrones de la comunidad bacteriana entre los cinco grupos de ratas. PCoA basado en distancias UniFrac ponderadas de microbiota intestinal de los cinco grupos de ratas de estudio se muestra en la Figura 3A. El análisis de diversidad beta por PCoA mostró una clara separación de la comunidad microbiana del grupo de control y el grupo modelo CUS, mientras que el grupo CTE con dosis alta tendió a estar más cerca del grupo de control en comparación con el grupo CUS.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 por ciento . Como se muestra en las Figuras complementarias S5A, B, el procedimiento de estrés de 4 semanas provocó una tendencia no significativa hacia un mayor nivel de Firmicutes y una disminución no significativa de Bacteroidetes en el grupo modelo CUS en comparación con el grupo de control. Después de la administración diaria de CTE con dosis alta y dosis baja, la abundancia relativa de Firmicutes y Bacteroidetes volvió a niveles similares al grupo de control, aunque sin significación estadística. Y aunque se observaron cambios similares en la relación Firmicutes/Bacteroidetes entre los grupos de ratas, no se mostraron diferencias estadísticas (Figura complementaria S5C). Se encontró una tendencia no significativa hacia una disminución del nivel de phyla Cyanobacteria en el grupo modelo CUS en comparación con las ratas de control no estresadas; mientras que la administración de CTE con una dosis alta resultó en un aumento significativo en la abundancia relativa de cianobacterias en comparación con el grupo CUS (Figura complementaria S5D).

A nivel de género, Bacteroides y Ruminococcus fueron dos de los taxones microbianos más abundantes que representaron aproximadamente el 30 por ciento de la abundancia relativa en los cinco grupos de ratas. El procedimiento de estrés de cuatro semanas provocó una reducción significativa en la abundancia relativa de Bacteroides y un aumento significativo de Ruminococcus en el grupo modelo CUS en comparación con las ratas de control no estresadas (Figuras 4A, B). La administración a largo plazo de CTE dio como resultado un aumento significativo en la abundancia de Bacteroides así como una disminución significativa de Ruminococcus en comparación con las ratas CUS. Además, seis géneros de Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus y Brachybacterium mostraron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo modelo CUS y el grupo control (Figuras 4C-H). Después de 28 días de tratamiento de CTE, la abundancia relativa de los seis géneros mencionados anteriormente cambió respectivamente a niveles similares al grupo de control.

Se detectó una baja abundancia de Deinococcus en diferentes niveles taxonómicos, incluido el nivel de clase (Deinococci), el nivel de orden (Deinococcales), el nivel de familia (Deinococcaceae) y el nivel de género (Deinococcus) en el grupo de ratas CUS, mientras que no se detectó en el control. grupo y los grupos de administración (Figuras 5A-D).

A nivel de especie, Weissella beninensis fue mucho menor en el grupo CUS que en el grupo control, y se observó un aumento significativo en la abundancia relativa después de la administración de CTE con una dosis alta (Figura 5E). Por el contrario, la administración de CTE revirtió el aumento significativo en la abundancia relativa del conglomerado de Brachybacterium observado en las ratas CUS (Figura 5F).

SCFA modulados por CTE en ratas CUS

Las concentraciones de SCFA (incluidos acetato, propionato, butirato, isobutirato, ácido valérico, ácido isovalérico y ácido hexanoico) en muestras fecales de rata se analizaron mediante GC y se muestran en la Figura 6. Los niveles de acetato [ANOVA unidireccional, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Prueba de Dunnett, p < 0.05]="" y="" ácido="" hexanoico="" [anova="" unidireccional,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05]="" aumentaron="" significativamente="" en="" las="" ratas="" del="" grupo="" modelo="" cus="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control.="" después="" de="" la="" administración="" a="" largo="" plazo="" de="" cte="" con="" dosis="" altas,="" acetato="" (prueba="" t="" de="" student,="" t="2.182," p="">< 0.05)="" y="" ácido="" hexanoico="" [anova="" de="" una="" vía,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" prueba="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05],="" las="" concentraciones="" disminuyeron="" predominantemente="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" cus,="" lo="" que="" indica="" que="" la="" cte="" podría="" ejercer="" su="" actividad="" antidepresiva="" a="" través="" de="" la="" modulación="" del="" metabolito="" neuroactivo="" desordenado="" scfa.="" la="" administración="" de="" cte="" con="" el="" grupo="" de="" dosis="" baja="" mostró="" una="" tendencia="" decreciente="" pero="" ningún="" efecto="" notable="" sobre="" las="" concentraciones="" de="" acetato="" y="" ácido="">

Análisis de correlación de la microbiota intestinal, neurotransmisores y neurotrofinas en hipocampo, 5-HT en colon y SCFA

Para explorar la relación funcional de la microbiota intestinal alterada a nivel de género, neurotransmisores y neurotrofinas modificados en el hipocampo y el colon, y la concentración perturbadora de SCFA, se desarrollaron los coeficientes de correlación de Pearson (Meng et al., 2017). Las correlaciones entre ellos (r > 0.4 o r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" se="" muestran="" en="" la="" figura="" 7.="" los="" coeficientes="" indicaron="" fuertes="" correlaciones="" entre="" la="" composición="" alterada="" de="" la="" microbiota="" intestinal="" a="" nivel="" de="" género,="" la="" concentración="" de="" siete="" tipos="" de="" scfa="" y="" neurotransmisores="" de="" monoamina="" relacionados="" con="" la="" depresión="" (5-ht="" y="" ne).="" la="" abundancia="" de="" ruminococcus="" mostró="" una="" correlación="" negativa="" significativa="" con="" una="" concentración="" de="" 5-ht="" en="" el="" hipocampo,="" lo="" que="" significa="" que="" el="" procedimiento="" cus="" conduce="" a="" un="" incremento="" en="" la="" abundancia="" relativa="" de="" ruminococcus="" y="" una="" disminución="" en="" las="" concentraciones="" de="" 5-ht.="" después="" del="" tratamiento="" con="" cte,="" la="" abundancia="" relativa="" de="" ruminococcus="" se="" redujo="" al="" nivel="" del="" grupo="" de="" control="" y="" se="" encontró="" que="" los="" niveles="" de="" 5-ht="" habían="" mejorado.="" además,="" la="" abundancia="" relativa="" de="" bacteroides="" se="" correlacionó="" positivamente="" con="" un="" nivel="" de="" 5-ht="" en="">

hipocampo, y se asoció negativamente con la concentración de butirato, isobutirato, ácido valérico, ácido isovalérico y ácido hexanoico; la abundancia de Parabacteroides mostró una correlación positiva significativa con un nivel de 5-HT en el hipocampo y la concentración de propionato, mientras que mostró una correlación negativa con las concentraciones de isobutirato y ácido isovalérico; también se observó una asociación significativamente positiva entre la abundancia relativa de Butyricimonas y el nivel de NE en el hipocampo, y la abundancia relativa de Deinococcus se correlacionó positivamente con la concentración de acetato. Esto demostró que la CTE podría ejercer su actividad antidepresiva al cambiar la composición de la microbiota intestinal, alterar los niveles de neurotransmisores del hipocampo y restaurar los metabolitos neuroactivos SCFA. Los datos detallados del análisis de correlación se muestran en la Tabla complementaria S3.

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DISCUSIÓN

Identificación de la actividad antidepresiva de la CTE y sus ventajas clínicas

Este estudio evaluó la actividad antidepresiva de CTE en ratas CUS, confirmó la eficacia de modelos in vivo como FST, SPT, OFT y NSFT, y confirmó la actividad antidepresiva deC. tubulosaen ratas CUS, que se usa con frecuencia para el tratamiento de la deficiencia renal, la impotencia y la infertilidad femenina en la MTC. Actualmente, los antidepresivos recetados con mayor frecuencia son el inhibidor de la recaptación de serotonina y norepinefrina (IRSN) venlafaxina, seguido del inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS) FLX (Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). Sin embargo, se ha demostrado que estos antidepresivos poseen efectos secundarios graves que incluyen toxicidad cardíaca, presión arterial, disfunción sexual y trastornos del sueño (Ferguson, 2001; Jin et al., 2015). Entre todas las clases de antidepresivos, los ISRS y los IRSN se correlacionan con la mayor incidencia de disfunción sexual (Montejogonzalez et al., 1997; Clayton et al., 2014). De particular interés es la incidencia general de disfunción sexual, que es del 59,1 por ciento (604/1022) cuando todos los antidepresivos se consideran en su conjunto; y alrededor del 40 por ciento de los pacientes muestran poca tolerancia a la disfunción sexual, por lo que el cumplimiento del fármaco se ve gravemente afectado (Clayton, 2001). En vista de los inconvenientes del tratamiento actual de la depresión, Cistanches Herba muestra un gran potencial para la aplicación clínica, no solo por su potente actividad similar a la de los antidepresivos, sino también porqueCistanches Herbase ha utilizado tradicionalmente para tratar la impotencia, lo que debería eliminar al menos una preocupación de los efectos secundarios más comunes causados ​​por otros antidepresivos (Fu et al., 2017). Además, Cistanches Herba no muestra signos de toxicidad y cambios relacionados con el tratamiento.