Efectos antioxidantes, blanqueadores y antibacterianos de los flavonoides de peonía de Fengdan
Mar 23, 2022
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Jie-lu†, Zhiqianghuang†, Yusheng Liu, Huimin Wang, Min Qiu, Yinghui Qu y Wenpeng Yuan *
Resumen: Flavonoidestienen importantes actividades biológicas, como antiinflamatoria, antibacteriana, antioxidante y blanqueadora, por lo que es una potencial materia prima de alimentos funcionales. Sin embargo, la actividad biológica de la peonía Fengdanflavonoideno es particularmente claro. Por lo tanto, en este estudio, la peoníaflavonoidese extrajo de la harina de semillas de peonía de Fengdan, y las actividades antioxidantes, antibacterianas y blanqueadoras de la peoníaflavonoidefueron explorados. Las condiciones óptimas de extracción fueron concentración de metanol de 90 por ciento, relación sólido a líquido de 1:35 g:mL, temperatura de 55 ◦C y tiempo de 80 min; bajo estas condiciones, el rendimiento de la peonía Fengdanflavonoidepodría llegar a 1,205 ± 0,019 por ciento (la relación entre la masa seca de rutina y la masa seca de harina de semillas de peonía). La liquidación del total de peonía de Fengdanflavonoidesal radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), radical hidroxilo y 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS) los radicales libres podrían llegar al 75 por ciento, 70 por ciento y 97 por ciento, respectivamente. peonía fengdanflavonoidepodría inhibir el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de la peonía de Fengdanflavonoideen S. aureus, B. anthracis, B. subtilis y C. perfringens fueron {{0}}.0293 mg/ml, 0,1172 mg/ml, 0,2344 mg/ml y 7,500 mg/ ml, respectivamente. La tasa de inhibición del flavonoide de peonía de Fengdan sobre la tirosinasa fue del 8,53 al 81,08 por ciento. Este estudio ilustró intensamente que la actividad antioxidante, blanqueadora y antibacteriana de la peonía Fengdan totalflavonoidesfueron significativos. Peonía fengdan totalflavonoidestienen una gran posibilidad de ser utilizados como materiales alimentarios funcionales.
Palabras clave:peonía fengdanflavonoide; antioxidante; blanqueo; Actividad antibacterial; comida funcional
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1. Introducción
Peony is one of the economic and ornamental crops, which has been cultivated for more than 1600 years in China [1]. Oil peony refers to the variety of peony that can be used as a raw material for edible oil [2]. As one of the most commonly used oil peonies, Fengdan peony contains dark oval seeds, which has abundant unsaturated fatty acids (>90 por ciento) [3]. El aceite de semilla de peonía ha sido autenticado como un nuevo recurso alimentario por el gobierno chino, debido a su alta proporción de ácido -linolénico en 2011 [4]. Además, las semillas de peonía han sido certificadas como un nuevo recurso de alimento funcional para mejorar la salud humana por la Comisión Nacional de Salud y Planificación Familiar de la República Popular China en 2011 [5]. La harina de semilla de peonía de Fengdan es uno de los subproductos más importantes en la preparación del aceite de semilla de peonía, que representa aproximadamente del 60 al 70 por ciento de la semilla de peonía de Fengdan, y es rica en flavonoides, proteínas, polisacáridos, polifenoles, paeoniflorina y otros activos ingredientes. Sin embargo, una gran cantidad de harina de semillas de peonía de Fengdan solo se usa como alimento o como desecho en la actualidad [6], lo que resulta en el desperdicio de recursos naturales y la contaminación ambiental [2].
Según la literatura, los flavonoides tienen importantes actividades biológicas, como efectos antiinflamatorios, antibacterianos, antioxidantes y blanqueadores [7–10], que se consideranposibles materias primas de alimentos funcionales. Por ejemplo, la isoflavona de soja puede proteger las células del daño de los radicales libres debido a sus propiedades antioxidantes [11–13]. El flavonoide en el extracto de ginkgo biloba tiene fuertes propiedades antioxidantes y puede inhibir directamente los radicales libres [14]. El extracto de flavonoides de guayaba blanca es un agente antibacteriano natural que puede cambiar la morfología microscópica de E. coli y S. aureus [15].
Desafortunadamente, como posible materia prima de alimentos funcionales, el flavonoide de peonía de Fengdan no solo ha estado involucrado en la producción industrial, sino que su actividad biológica tampoco está particularmente clara. Por lo tanto, para mejorar el valor de aplicación de los flavonoides de peonía en el campo de los alimentos tanto como sea posible y reducir el desperdicio de recursos, se extrajo el flavonoide de peonía de la harina de semilla de peonía de Fengdan, y las actividades antioxidantes, blanqueadoras y antibacterianas del flavonoide de peonía de Fengdan fueron estudiados. Se espera que siente las bases para el desarrollo de nuevas materias primas de alimentos funcionales a partir de la peonía de Fengdan.
2. Resultados y Discusión
2.1. La influencia de cuatro factores en el rendimiento total de flavonoides
La influencia de la concentración de metanol en el rendimiento total de flavonoides se muestra en la Figura 1a. El rendimiento total de flavonoides aumentó al principio, y luego disminuyó con el aumento de la concentración de metanol, y alcanzó el máximo (1,016 por ciento, la relación entre la masa seca de rutina y la masa seca de harina de semilla de peonía) cuando la concentración de metanol era 90 por cientoLa razón puede estar relacionada con la polaridad del metanol y la solubilidad de los flavonoides totales en la harina de semillas de peonía [16]. Por lo tanto, la concentración óptima de metanol fue del 90 por ciento.
Como se muestra en la Figura 1c, el rendimiento total de flavonoides aumentó al principio y luego disminuyó con el aumento de la temperatura. El rendimiento total de flavonoides alcanzó el valor máximo (1,141 por ciento, la relación entre la masa seca de rutina y la masa seca de harina de semillas de peonía) a 55 ◦C. La velocidad de disolución de los flavonoides totales en la harina de semillas se aceleró elevando la temperatura adecuadamente. Sin embargo, un flavonoide total parcial se descompuso cuando se expuso a altas temperaturas [18], lo que conduce a una disminución en el rendimiento de flavonoides totales. Así, 55 ◦C fue la mejor temperatura.
La influencia del tiempo de extracción en el rendimiento total de flavonoides se muestra en la Figura 1d. El rendimiento total de flavonoides aumentó rápidamente en 0.5 h a 1.5 h. Cuando el tiempo de extracción fue superior a 1,5 h, el rendimiento total de flavonoides se mantuvo sin cambios. La razón de este fenómeno puede ser que los flavonoides totales en la harina de semillas se disolvieron continuamente con la extensión del tiempo de extracción en 0.5 h a 1.5 h. Además, al llegar el tiempo a 1,5 h, es posible que se hayan disuelto todos los flavonoides totales. Por lo tanto, aumentar el tiempo tuvo un ligero efecto sobre el rendimiento total de flavonoides [4,19]. Así, el mejor tiempo de extracción fue de 1,5 h.
2.2. Optimización para el rendimiento total de flavonoides
2.2.1. Ajuste de modelos y análisis de datos mediante RSM
Para explorar más a fondo la importancia relativa de los diversos factores en el rendimiento total de flavonoides de la harina de semillas de peonía de Fengdan, se llevó a cabo el experimento RSM. RSM se utiliza en el diseño estadístico y el análisis de datos de experimentos multifactoriales para evaluar la importancia relativa de varias variables y encontrar las mejores condiciones para respuestas ideales [20]. El diseño de Box-Behnken con RSM puede ajustarse a la ecuación de regresión lineal, por lo que el experimento puede analizarse con mayor precisión para encontrar la ley entre los factores que influyen [21].
La Tabla S1 mostró la relación entre el rendimiento total de flavonoides y las variables de prueba. Los datos experimentales se analizaron mediante análisis de regresión múltiple. La ecuación de regresión polinomial cuadrática del rendimiento total de flavonoides (Y) a la proporción de sólido a líquido (A), la temperatura de extracción (B) y el tiempo de extracción (C) fue: y=1.19 más 0 .01A − {{10}}.02B − 0.003C más 0,02AB − 0,02AC más 0.01BC - 0.03A2 - 0.04B20.02C2.
El anova del modelo polinomial cuadrático se demostró en la Tabla 1. ElEl valor F del modelo fue 18,57, el valor p del modelo fue 0.0004 (p < 0,01), el grado de ajuste del modelo fue 0,1202 y el coeficiente de determinación (R2) fue 0.9598, lo que indicó que el modelo tenía una significancia estadística extremadamente significativa. El término primario (B) y el término secundario (A2, B2, C2) tuvieron efectos extremadamente significativos en el rendimiento total de flavonoides (p < 0.01).="" a,="" ab="" y="" ac="" tuvieron="" efectos="" significativos="" en="" el="" rendimiento="" total="" de="" flavonoides="" (p="">< 0.05).="" c="" y="" bc="" no="" tuvieron="" un="" efecto="" significativo="" sobre="" el="" rendimiento="" total="" de="" flavonoides="" (p=""> 0,05). De acuerdo con el valor F de los tres factores, el efecto sobre el rendimiento total de flavonoides fue la temperatura de extracción > relación sólido-líquido > tiempo de extracción.
Tabla 1.El anova del modelo polinomial cuadrático.
Los diagramas de superficie de respuesta tridimensionales (3D) se mostraron en la Figura 2a, c, e. El punto más alto del gráfico 3D fue la mejor condición para los factores interactivos. Las pendientes de contorno de la interacción entre A y B (Figura 2b), A y C (Figura 2d) eran más pronunciadas, mientras que las de A y C (Figura 2f) eran suaves. Esto ilustró que la interacción entre A y B, A y C tuvo una gran influencia en el rendimiento total de flavonoides, mientras que la interacción entre B y C no tuvo un efecto significativo en el rendimiento total de flavonoides. La consistencia entre el experimento RSM y el análisis de regresión demostró además que el modelo establecido era más preciso.
Figura 2.Los diagramas de superficie 3D para AB (a), CA (c) y BC (e) al rendimiento total de flavonoides.
2.2.2. Verificación de Condiciones Óptimas
Los parámetros óptimos teóricos proporcionados por el modelo fueron la relación sólido-líquido de 1:36,11, la temperatura de extracción de 53,52 ◦C, el tiempo de extracción de 82,65 min y el valor teórico de rendimiento total de flavonoides fue de 1,195 por ciento. Considerando la operación real, los parámetros teóricos se ajustaron a la relación sólido-líquido de 1:35, la temperatura de extracción de 55 ◦C y el tiempo de extracción de 80 min. En estas condiciones, el rendimiento total de flavonoides fue de 1,205 ± 0,019 por ciento. En comparación con el valor de pronóstico teórico, el error relativo fue del 0,8 por ciento. El valor teórico fue consistente con el resultado real, lo que indica que los parámetros de optimización estaban disponibles. Chen et al. [10] extrajeron los flavonoides de la peonía utilizando una solución acuosa de etanol al 60 por ciento y el rendimiento fue del 1,34 por ciento, lo que concuerda con este documento. RSM se usó ampliamente para optimizar el proceso de extracción óptimo de flavonoides de plantas, como Aurantii Fructus [22], Pueraria [23] y hojas de Curcuma Zedoaria [24]. En comparación con la prueba ortogonal, RSM tenía las ventajas de una predictibilidad precisa, una mayor precisión y un análisis más fácil de los factores de influencia [25].
2.3. Actividad antioxidante del flavonoide de peonía de Fengdan
Los flavonoides son antioxidantes naturales que pueden limpiar eficazmente los radicales libres en el cuerpo. La capacidad antioxidante de los flavonoides se debe a que los flavonoides pueden aportar átomos de hidrógeno a los radicales libres y convertirse ellos mismos en radicales libres fenólicos. La tasa de transferencia de la reacción en cadena de oxidación automática puede ser ralentizada por la estabilidad de los radicales libres fenólicos, lo que inhibe la oxidación adicional de los lípidos [26].
La eliminación de flavonoides totales a radicales libres DPPH se muestra en la Figura 3a. En el rango de concentración de 0.1 a 1.0 mg/mL, la depuración de flavonoides totales y VC a radicales libres de DPPH se correlacionó positivamente con su concentración. En el rango de 0.1 a 0.5 mg/mL, el aclaramiento de VC aumentó con su concentración. Cuando la concentración fue superior a 0.5 mg/mL, la depuración de VC alcanzó el 98 por ciento y tendió a ser estable. En el rango de 0.1 a 0.8 mg/ml, la eliminación de flavonoides totales aumentó con el aumento de la concentración. Cuando la concentración fue superior a 0.8 mg/mL, la eliminación de flavonoides totales se estabilizó en alrededor del 75 por ciento. Oancea et al. [27] informaron que la eliminación del radical libre DPPH del extracto crudo de peonía fue del 81 por ciento; el aclaramiento fue similar a los resultados de este estudio. Los flavonoides totales de la peonía de Fengdan tenían una cierta capacidad de limpieza de los radicales libres DPPH, pero la capacidad era ligeramente inferior a la VC. La reacción entre el antioxidante y el radical libre DPPH se realiza mediante un átomo de hidrógeno y un mecanismo de transferencia de electrones [28]. El radical libre DPPH es púrpura en solución de etanol. Cuando el antioxidante elimina el radical libre DPPH a un estado estable a través del suministro de hidrógeno, su color se vuelve amarillo y tiene una fuerte absorción a 517 nm [29]. En este artículo, el efecto depurador de los flavonoides de peonía en DPPH se mejoró significativamente con el aumento de la concentración de flavonoides, lo que indicó que los flavonoides de peonía eran antioxidantes efectivos.
La eliminación de flavonoides totales al radical hidroxilo se ilustró en la Figura 3b. En la concentración de 0.1 a 1.0 mg/mL, el aclaramiento de flavonoides totales al radical hidroxilo fue menor que VC. A 0.4 mg/mL, la eliminación de VC básicamente alcanzó el máximo, alrededor del 97 por ciento. La tasa de eliminación de los flavonoides totales en los radicales hidroxilo aumentó con el aumento de la concentración y alcanzó el valor máximo (70 por ciento) cuando la concentración fue superior a 0,8 mg/mL. El radical hidroxilo es bastante activo y podría reaccionar rápidamente con cualquier biomolécula, lo que causa un gran daño a los órganos o tejidos [30]. El radical hidroxilo es la especie de oxígeno reactivo más tóxica para las células [31], que acelera la apoptosis celular al mejorar la oxidación del cuerpo [32]. Yang et al. [33] encontraron que el efecto depurador del aceite de semilla de peonía sobre el radical hidroxilo dependía de la concentración, y la eliminación del radical hidroxilo era de hasta el 92 por ciento en el rango de concentración de 0,1 a 0,5 mg/mL. En comparación con este documento, la eliminación de los flavonoides de la harina de semilla de peonía fue menor que la del aceite de semilla de peonía, pero como subproducto en la producción de aceite de semilla de peonía, los flavonoides extraídos de la harina de semilla de peonía también tuvieron un efecto depurador obvio sobre los radicales hidroxilo. a menor concentración. Por lo tanto, los flavonoides de peonía podrían considerarse como una materia prima de alimentos funcionales con la capacidad de un radical hidroxilo depurador. Por un lado, tuvo un mejor efecto protector sobre el sistema de defensa antioxidante humano y, por otro lado, también podría mejorar la utilización integral de las semillas de peonía.
2.4. Actividad blanqueadora del flavonoide de peonía de Fengdan
Como se muestra en la Figura 4, el flavonoide de peonía de Fengdan (0.03–1.00 mg/ml) produjo una inhibición de la tirosinasa del 8,53 al 81,08 %, que mostró una inhibición de la tirosinasa de forma dependiente de la dosis . La CI50 fue de 0,24 mg/ml. Lin et al. [36] encontraron que la tasa de inhibición de la tirosinasa era de alrededor del 75 por ciento cuando la concentración de extracto de etanol de peonía era de 1 mg/mL. La tasa de inhibición de la tirosinasa estuvo cerca de los resultados de este trabajo. La melanina es la sustancia clave para inhibir el blanqueamiento [37]. La tirosinasa es una enzima crucial en la síntesis de melanina, que se utiliza como índice para el cribado de alimentos funcionales cosméticos y blanqueadores [38]. Los inhibidores de la tirosinasa son ingredientes esenciales en la mayoría de los cosméticos o alimentos blanqueadores [39]. En este estudio, el flavonoide de peonía tuvo un efecto inhibidor evidente sobre la actividad de la tirosinasa. Por lo tanto, era factible y válido agregar flavonoides de peonía a los cosméticos o alimentos blanqueadores como materiales blanqueadores.
Tabla 2.Diámetro de la zona de inhibición.
3. Materiales y Métodos
3.1. Material y Reactivos
La harina de semilla de peonía Fengdan desnatada se compró a Guyu Peony Biotechnology Co., Ltd. (Heze, China). La harina de semillas se molió hasta convertirla en polvo y luego se pasó a través de un 40-tamiz de malla [45]. El polvo de harina de semillas se recolectó y almacenó a 4 ◦C para uso futuro. China suministró estándar de rutina, vitamina C (VC), metanol, etanol anhidro, nitrito de sodio (NaNO2), nitrato de aluminio (Al(NO3)3) e hidróxido de sodio (NaOH).Pharmaceutical Group Co., Ltd. (Pekín, China); Radical hidroxilo, radical libre DPPHy el kit de capacidad de captación de radicales libres ABTS se adquirieron de Shanghai Tongwei Industrial Co., Ltd.
3.2. Extracción de Flavonoides Totales
Además, se añadieron 15,00 g de harina de semilla de peonía Fengdan desnatada en un vaso de precipitados de 1000 ml. Luego, se colocó en un baño de agua termostático con pantalla digital (HH-S4, Jiangsu, China) con una batidora eléctrica (OES-60M, Wenzhou, China, 220 r/min) y se extrajo en las siguientes condiciones: la concentración de metanol fue del 90 por ciento, la relación sólido-líquido fue de 1:35 g:mL, la temperatura de extracción fue de 55 ◦C y el tiempo de extracción fue de 80 min. Tras la extracción, el filtrado de falvonoides totales se recogió mediante un filtro de vacío.
3.3. Experimento de un solo factor
El rendimiento total de flavonoides de la harina de semillas de peonía de Fengdan se optimizó mediante el uso de un experimento de un solo factor. Podría reflejar el efecto de cuatro factores en el rendimiento total de flavonoides. Este experimento fue investigado por el método de una sola variable. Los factores y variables del experimento se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3.Los factores y variables del experimento de un solo factor
3.4. Experimento RSM
El experimento de un solo factor proporcionó tres variables de cada factor para el experimento RSM. En este estudio, sobre la base del experimento de un solo factor, se seleccionó una concentración de metanol del 90 por ciento; Se utilizaron como argumentos la relación sólido-líquido, la temperatura de extracción y el tiempo de extracción. El rendimiento total de flavonoides de peonía se utilizó como valor de respuesta. Basado en el principio de la prueba Box-Behnken en el software Design-Expert 12.0, el RSM con tres factores y tres niveles fue diseñado para optimizar las condiciones de extracción de flavonoides totales de harina de semilla de peonía. Todo el diseño experimental estuvo compuesto por 17 puntos experimentales (Tabla S1). Se realizaron cinco repeticiones (13–17) en el centro de diseño para estimar un error puro. Los factores y niveles de RSM se demostraron en la Tabla 4.
Tabla 4.Los factores y niveles de RSM.
3.5. Preparación del polvo de flavonoides totales de peonía de Fengdan
Después de que RSM determinara el proceso de extracción óptimo, el filtrado de flavonoides totales de peonía de Fengdan se extrajo con el mejor proceso de extracción, luego se obtuvo el polvo de flavonoides totales de peonía después de que el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio (20 ml/min, 25 W, R -1001VN, Zhengzhou, China) y secado por liofilizador (−80 ◦C, 24 h, SCIENTZ-12N, Ningbo, China). El polvo se usaría en experimentos antioxidantes, blanqueadores y antibacterianos.
3.6. Evaluación de la actividad antioxidante
Solución de flavonoides totales de peonía de Fengdan y solución de VC con diferentes concentraciones de masa (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{9 }}.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mg/mL) fueron preparados con 80 por ciento de etanol, que se utilizará para determinar la depuración de flavonoides totales a tres radicales libres.
3.6.1. Ensayo de radicales libres DPPH
El aclaramiento de flavonoides totales a radicales libres DPPH se determinó según lo descrito por Pham, DC, con modificaciones menores [48]. Brevemente, se agregaron 150 μL de 0.2 mM DPPH en etanol anhidro a 150 μL de muestra a diferentes concentraciones (0.1–1.0 mg/mL). La mezcla se agitó y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La mezcla de 200 μl se añadió a una placa de pocillos 96- y la absorbancia se midió a 517 nm con un instrumento marcado con enzima (SpectraMax 190, Shanghái, China). Se utilizó VC como sustancia de control. El aclaramiento de DPPH se calculó mediante la siguiente fórmula.
El aclaramiento de DPPH por ciento={1− [(Ai − Aj) / Ao] ×100 } por ciento (2)
donde Ai era la absorbancia de 150 μL de muestra más 150 μL de DPPH; Aj fue la absorbancia de 150 μL de muestra más 150 μL de etanol anhidro; A0 fue la absorbancia de 150 μL de DPPH más 150 μL de etanol anhidro.
3.6.2. Ensayo de radicales hidroxilo
El aclaramiento de los flavonoides totales al radical hidroxilo se determinó según lo descrito por Zhou, J., con algunas modificaciones [49]. Brevemente, 50 μL de soluciones de muestra de diferentes concentraciones (0.1–1.0 mg/mL), 50 μL de solución de ácido salicílico-etanol 9,0 mM , se mezclaron en un tubo 50 μL de solución de FeSO4 9,0 mM y 200 μL de agua destilada. Luego, se agregaron 50 μL de H2O2 8,8 mM a la mezcla anterior y se midió la absorbancia a 510 nm. El aclaramiento del radical hidroxilo se calculó mediante la siguiente fórmula.
El aclaramiento del radical hidroxilo por ciento={1− [(Ai − Aj) / Ao] ×100 } por ciento (3)
donde Ai era la absorbancia de la muestra; Aj es la absorbancia del agua desionizada en lugar de H2O2; A0 era la absorbancia del agua desionizada en lugar de la muestra.
3.6.3. Ensayo de radicales libres ABTS
El aclaramiento de los flavonoides totales a los radicales libres ABTS se determinó según lo descrito por Gong, J. con algunas modificaciones [5{{10}}]. Brevemente, 1 ml de solución de ABTS 7 mM y 1 ml de solución de persulfato de potasio 2,45 mM se mezclaron en un tubo durante 12 h a temperatura ambiente en la oscuridad. La mezcla se diluyó 40 veces con etanol anhidro. Luego, 190 μL de mezcla y 10 μL de muestras a diferentes concentraciones (0.1–1.0 mg/mL) se mezclaron en un tubo durante 6 min a temperatura ambiente en la oscuridad; la absorbancia se midió a 734 nm. El aclaramiento de radicales libres ABTS se calculó mediante la siguiente fórmula.
El aclaramiento de ABTS por ciento={1− [(Ai − Aj) / Ao] ×100 } por ciento (4)
donde Ai era la absorbancia de 10 μL de muestra más 190 μL de mezcla; Aj fue la absorbancia de 10 μL de muestra más 190 μL de etanol anhidro; A0 fue la absorbancia de 10 μL de etanol anhidro más 190 μL de mezcla.
Cistanche elimina los radicales libres.
3.7. Evaluación de la actividad blanqueadora
El ensayo de inhibición de la tirosinasa se determinó según lo descrito por Chen Q con modificaciones menores [38]. Brevemente, 40 μL de tirosina 5 mmol/L disueltos en 80 μL de tampones de fosfato 1/15 (pH 6.8) se mezclaron con 40 μL de solución de flavonoides totales de peonía Fengdan a 37 ◦C durante 15 min. A continuación, se añadieron 40 μL de tirosinasa (300 UI/mL) para iniciar la reacción. La mezcla de ensayo se incubó a 37 ◦C durante 10 min. La absorbancia se midió con un instrumento marcado con enzima (SpectraMax 190, Shanghái, China) a 482 nm. Al mismo tiempo, se conformó el grupo blanco y el grupo control. En el grupo blanco no se añadió tirosinasa y se utilizó tampón fosfato para completar el volumen. En el grupo de control, no se agregó la solución de flavonoides y se usó el tampón de fosfato para completar el volumen. El porcentaje inhibidor de la actividad tirosinasa se calculó mediante la siguiente fórmula:
Tasa de inhibición (porcentaje)= [1−(As − Ab) / (Ac − Ab)]×100 por ciento (5)
donde AB era la absorbancia del grupo blanco a 482 nm, AC era la absorbancia del grupo control a 482 nm y AS era la absorbancia de la muestra a 482 nm.
3.8. Experimento de actividad antibacteriana
Luego, se agregaron 400 μL de agua estéril al tubo bacteriano liofilizado. Después de mezclar completamente, 200 μL de bacterias líquidas se esparcieron uniformemente en la placa de agar. Se incubó en una incubadora bioquímica (LRH-250, 650 W, Changzhou, China) a 37 ◦C durante 24 h para activar la bacteria. Luego, la colonia única se recogió en una placa de agar con un asa de inoculación desechable (65-0001, Shandong, China) y se inoculó en el medio líquido. El medio se colocó en un oscilador de cultivo inteligente a temperatura constante (HNYC-202T, 1800W, Tianjin, China) a 37 ◦C, 120 r/min durante 24 h. La concentración de la suspensión bacteriana se observó y contó con un hemocitómetro (Q401, Shanghái, China) y luego se ajustó a 106 CFU/mL [51].
El experimento de la zona de inhibición fue operado por el método de punzonado. Primero, se prepararon soluciones de flavonoides totales de peonía Fengdan de diferentes concentraciones (30 mg/mL y 500 mg/mL) con 80 por ciento de metanol. Luego, los 80 μL de suspensión de bacterias se esparcieron uniformemente sobre el medio de agar estéril. A continuación, se perforaron 4 orificios en el medio con un perforador de 7 mm de diámetro (A0358, Guangzhou, China). Tres de los orificios se agregaron a 100 μL de solución de flavonoides totales y el otro se agregó a los 100 μL de metanol al 80 por ciento como control. Finalmente, se cultivó en incubadora bioquímica a 37 ◦C durante 24 h. El diámetro de la zona de inhibición clara alrededor de cada orificio se midió utilizando un pie de rey (SWB-227-150, Guangzhou, China).
El experimento MIC se realizó de acuerdo con los siguientes pasos. El sistema de crecimiento bacteriano que contiene diferentes concentraciones de solución de flavonoides totales (0.0037, 0.0073, 0.0146, 0.0293, 0.0586, 0.1172, 0.2344, 0.4688, 0.9375, 1.8750, 3.7500, 7.5000, 15.0000 mg/mL) por un método de dilución de doble gradiente [52]. Además, la adición de solución bacteriana sin solución de flavonoides totales se usó como grupo de control de crecimiento, y la solución de flavonoides totales sin solución bacteriana se usó como grupo de control en blanco. Se cultivaron en un oscilador inteligente de cultivo a temperatura constante (HNYC- 202T, 1800 W, Tianjin, China) a 37 ◦C, 120 rpm/min durante 24 h. La concentración máxima diluida de flavonoides totales sin crecimiento bacteriano fue la CIM de flavonoides totales en las bacterias [53].
3.9. Análisis estadístico
Se utilizó Design-Expert V12.0.3.0 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.) para calcular los coeficientes del modelo polinomial cuadrático y la optimización. Los valores F y los valores p se usaron para comprobar la precisión de la ecuación del modelo polinomial, y los valores p inferiores a {{10}}.05 (p < 0,05)="" se="" consideraron="" estadísticamente="" significativos.="" todos="" los="" experimentos="" se="" midieron="" tres="" veces="" y="" los="" valores="" de="" los="" datos="" se="" expresaron="" como="" media="" ±="" desviación="" estándar="">
4. Conclusiones
En este estudio, las condiciones óptimas de extracción de los flavonoides totales de peonía de Fengdan fueron una concentración de metanol de 90 por ciento, una relación sólido-líquido de 1:35, una temperatura de extracción de 55 ◦C, un tiempo de extracción de 80 min y el rendimiento total de flavonoides fue de 1,204 por ciento. Creemos que el proceso de extracción es adecuado para la producción industrial. Los flavonoides de peonía de Fengdan demostraron excelentes efectos antioxidantes, la depuración de flavonoides totales al radical libre DPPH fue del 75 por ciento, al radical hidroxilo fue del 70 por ciento y al radical libre ABTS fue del 97 por ciento. Además, los flavonoides de peonía de Fengdan tuvieron un cierto efecto blanqueador, la tasa de inhibición de los flavonoides de peonía de Fengdan a la tirosinasa fue dependiente de la dosis y el IC50 podría alcanzar los 0,24 mg/mL. Además, los flavonoides totales de la peonía de Fengdan podrían inhibir el crecimiento de bacterias Gram-positivas. Todos los resultados proporcionaron un respaldo de datos confiable para la aplicación de flavonoides totales de peonía de Fengdan en productos saludables y materias primas de alimentos funcionales, y sentaron las bases para la producción industrial de flavonoides totales de peonía de Fengdan.
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