El nivel de ejercicio adecuado atenúa la disbiosis intestinal y el aumento del ácido valérico para mejorar la neuroplasticidad y la función cognitiva después de la cirugía en ratones, parte 3

MATERIALES Y MÉTODOS

Los protocolos y procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia (Charlottesville, VA, EE. UU.; número de protocolo: 3114).

La memoria es una de las habilidades que a menudo necesitamos utilizar en nuestra vida diaria. Puede hacer que las personas sean más inteligentes, más sensibles y más propicias para su carrera y sus relaciones interpersonales. Por eso, muchas personas quieren mejorar su memoria. Existe una relación entre los protocolos experimentales y la memoria. Exploremos este tema a continuación.

En primer lugar, los protocolos experimentales pueden ayudar a las personas a mejorar su memoria. En el experimento, las personas deben seguir ciertos pasos para completar la operación experimental. Esta actividad paso a paso puede poner al cerebro humano en un estado de alta atención y concentración, promoviendo así el desempeño de las funciones cerebrales. Al mismo tiempo, es necesario recordar algunos datos experimentales y pasos experimentales durante el experimento, que también ejercitarán la función de memoria del cerebro. Si practica repetidamente de esta manera, su memoria mejorará gradualmente.

En segundo lugar, la experiencia sensorial durante el proceso de memoria también está estrechamente relacionada con el diseño del plan experimental. En los experimentos, los diseñadores a menudo establecen ciertas tareas específicas durante el experimento, de modo que los participantes deben repetir la misma operación varias veces, como la memoria y escritura de números, la memoria y el reconocimiento de bloques de colores, etc. Esta experiencia repetitiva puede fortalecer la capacidad de las personas. capacidades de atención y memoria, lo que facilita que las personas procesen esta información en la memoria a largo plazo.

Además, en los experimentos, el uso de materiales estímulo representativos (como imágenes, sonidos, olores, etc.) también puede producir buenos resultados. Porque estos estímulos pueden desencadenar los procesos de excitación y memoria del cerebro, mejorando así la capacidad de memoria de las personas. Al mismo tiempo, estos estímulos también pueden combinarse con el entorno y las situaciones de la vida, reduciendo así la aparición de desacoplamientos y haciendo que la información sea más fácil de recordar y más cohesiva.

En resumen, el plan experimental desempeña un papel crucial en la mejora de la memoria humana. Al realizar experimentos, las personas pueden ejercitar sus capacidades cognitivas, mejorar sus niveles de memoria y, al mismo tiempo, promover la función cerebral. Por lo tanto, debemos continuar aprendiendo nuevos métodos experimentales y participar en más experimentos para mejorar nuestros niveles de memoria y hacer mayores contribuciones a nuestras carreras, relaciones y salud. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola tiene efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antienvejecimiento, que pueden ayudar a reducir la oxidación y las reacciones inflamatorias en el cerebro, protegiendo así la salud del sistema nervioso. Además, Cistanche deserticola también puede promover el crecimiento y la reparación de las células nerviosas, mejorando así la conectividad y la función de las redes neuronales. Estos efectos pueden ayudar a mejorar la memoria, la capacidad de aprendizaje y la velocidad del pensamiento, y también pueden prevenir el desarrollo de disfunciones cognitivas y enfermedades neurodegenerativas.

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Todos los experimentos con animales fueron realizados por la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (publicaciones NIH número 80–23) revisada en 2011. Las fuentes de materiales clave se enumeraron en la Tabla de recursos clave en los Materiales complementarios.

Animales y diseño experimental.

Se alojaron ratones macho C57BL/6 J de ocho semanas de edad que pesaban entre 19 y 22 g en una habitación mantenida en condiciones ambientales constantes (temperatura de 22 a 24 grados, un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y 50 ± 10 % de humedad) con libre acceso a los alimentos. y agua.

A todos ellos se les permitió aclimatarse durante una semana antes de los experimentos. Fueron asignados aleatoriamente a los siguientes grupos en el primer experimento: (1) grupo de control (sin exposición a anestesia ni cirugía), (2) grupo de ejercicio (ejercicio al 35-40 % de su capacidad máxima, pero sin exposición a anestesia ni cirugía) , (3) grupo de cirugía (exposición de la arteria carótida izquierda durante 15 min bajo anestesia con isoflurano durante 2 h), y (4) a (6) grupos Exe-l+Sur, Exe-m+Sur y Exe-h+Sur: ejercitados a 35 –40%, 55-60% y 75-80% de su capacidad máxima, respectivamente, y fueron sometidos a anestesia y cirugía.

Los animales se utilizaron para pruebas de aprendizaje y memoria a partir de 4 días después de la cirugía (n=20) o sus cerebros se recolectaron para ensayos bioquímicos a las 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 7 días después de la cirugía. (n=9 o 14), para tinción inmunofluorescente a las 48 h y 19 días después de la cirugía (n=6), y para tinción de Golgi a los 19 días después de la cirugía (n=8).

Se recogieron sangre y heces de ratones de los primeros 4 grupos para medir los SCFA a los 7 días después de la cirugía (n=7) y para análisis de 16 S a los 3 y 7 días después de la cirugía (n=8) o al al final del protocolo de ejercicio de la 4-semana (n=8) ​​o en el momento correspondiente en los primeros 2 grupos (n=16). Los ratones para la recolección de tejido eran diferentes cohortes de ratones que se utilizaron para pruebas de aprendizaje y memoria. En el segundo experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente a (1) el grupo Transcontrol+Sur y (2) el grupo Trans-exe+Sur.

Los ratones del primer grupo recibieron 500 ul de solución fecal del grupo de control mediante sonda gástrica y 600 ul mediante enema una vez al día durante 7 días consecutivos después del tratamiento con antibióticos para eliminar la microbiota intestinal nativa en los receptores. Los ratones del segundo grupo recibieron 500 ul de solución fecal de ratones en ejercicio mediante sonda gástrica y 600 ul mediante enema una vez al día durante 7 días consecutivos después del tratamiento con antibióticos. Las heces de los receptores se recolectaron 14 días después del trasplante fecal para el análisis de 16 S. Luego, los ratones fueron sometidos a cirugía.

El aprendizaje y la memoria se evaluaron a partir de los 4 días posteriores a la cirugía (n=15). El cerebro se recogió para estudios bioquímicos como en el primer experimento (n=10). En el tercer experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente a (1) el grupo Transcontrol y (2) el grupo Trans-control+Sur. Los ratones de ambos grupos recibieron un trasplante de heces de ratones de control. El segundo grupo fue operado 14 días después del trasplante fecal. El hipocampo se recogió 2 días después de la cirugía para medir el GDNF (n=10). En el cuarto experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente a (1) el grupo de control (ratones sin tratamiento previo que no estuvieron expuestos a ninguna de las condiciones experimentales descritas en este estudio), (2) el grupo de antibióticos que recibió antibióticos durante 7 días y (3) el grupo Trans-control que recibió un trasplante de heces de ratones de control.

El aprendizaje y la memoria se evaluaron 19 días después de completar el trasplante fecal (26 días después de completar el tratamiento con antibióticos en el grupo de antibióticos) (n=12). En el quinto experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente a (1) el grupo de control, (2) el grupo Trans-control que recibió un trasplante de heces de ratones de control, y (3) el grupo Trans-cirugía que recibió un trasplante de heces de ratones quirúrgicos. 

El trasplante fecal se realizó como se describe en el segundo experimento. Las heces de los receptores se recolectaron 14 días después del trasplante fecal para el análisis de 16 S (n=10). El aprendizaje y la memoria se evaluaron 4 días después de que se recogió la muestra fecal (n=17). En el sexto experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente a (1) grupo de cirugía más solución salina normal que recibió 200 µl de solución salina normal (NS) mediante inyección intraperitoneal una vez. una semana durante 4 semanas y luego cirugía, (2) grupo de ejercicio más solución salina normal más cirugía que recibió 200 µl de NS mediante inyección intraperitoneal una vez a la semana durante la 4-semana de ejercicio al 35-40% de su capacidad máxima y luego cirugía, (3 ) grupo de ejercicio más ácido valérico más cirugía que recibió ácido valérico (200 mg/kg en 200 µl) mediante inyección intraperitoneal una vez a la semana durante la 4-semana de ejercicio al 35-40 % de su capacidad máxima y luego cirugía.

La inyección se administró la mañana del primer día de ejercicio de la semana. Se realizó una inyección adicional el día de la cirugía. Los resultados conductuales (n=13) y bioquímicos (n=10) se evaluaron como en el segundo experimento. En el séptimo experimento, un macho C57BL/ de 13-semanas de edad (con un peso de 23 a 27 g) Se asignaron aleatoriamente 6 ratones J a (1) el grupo de control, (2) el grupo NS que recibió 4 µl de NS mediante inyecciones intracerebroventriculares una vez al día durante 4 días consecutivos y (3) el grupo de ácido valérico que recibió 4 mg/kg en 4 µl mediante inyecciones intracerebroventriculares. inyección una vez al día durante 4 días consecutivos. Los cerebroventrículos izquierdo y derecho se inyectaron en un horario alternativo. Se evaluaron el aprendizaje y la memoria 4 días después de la inyección (n=15).

En el octavo experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente a (1) grupo de cirugía más dimetilsulfóxido (DMSO) que recibió DMSO mediante inyección intracerebroventricular una vez al día durante 4 días consecutivos a partir del día de la cirugía, (2) grupo de cirugía más antagonista de C3ar que recibió antagonista de C3ar (SB290157). ) mediante inyección intracerebroventricular una vez al día durante 4 días a partir del día de la cirugía, (3) grupo de ejercicio más DMSO más cirugía que recibió DMSO mediante inyección intracerebroventricular una vez al día durante 4 días consecutivos a partir del día de la cirugía después de la 4-semana de ejercicio a los 35 –40 % de la capacidad máxima, y(4) grupo de ejercicio más agonista de C3ar más cirugía que recibió un agonista de C3 mediante inyección intracerebroventricular una vez al día durante 4 días consecutivos a partir del día de la cirugía después de la 4-semana de ejercicio al 35-40 % de la capacidad máxima. . Las pruebas de comportamiento se iniciaron a partir de los 4 días posteriores a la cirugía como se indicó anteriormente (n=15).

En el noveno experimento, los ratones fueron asignados aleatoriamente a (1) el grupo de control, (2) el grupo de cirugía, (3) el grupo de cirugía más GDNF que recibió GDNF mediante inyección intracerebroventricular cuando se sometieron a la cirugía y (4) cirugía más GDNF inactivado por calor. grupo que recibió GDNF inactivado por calor mediante inyección intracerebroventricular cuando se sometieron a la cirugía. Los hipocampos se recolectaron 48 h después de la cirugía para el estudio ELISA (n=12). Después de una semana de aclimatación, se utilizaron ratones viejos (18-ratones macho C57BL/6 J de un mes de edad) que pesaban entre 30 y 36 g. tres estudios. En el primer experimento, los ratones viejos fueron asignados aleatoriamente a (1) el grupo de control, (2) el grupo de ejercicio en el que los ratones hicieron una 4-semana de ejercicio al 35-40 % de su capacidad máxima, (3) el grupo de cirugía y (4) el grupo Exe+Sur en el que los ratones hicieron 4-semanas de ejercicio al 35-40% de su capacidad máxima antes de la cirugía. Los animales se utilizaron para pruebas de aprendizaje y memoria a partir de 4 días después de la cirugía (n=12) o sus cerebros se recolectaron para ensayos bioquímicos a las 48 h después de la cirugía (n=10 o 12), para tinción inmunofluorescente a las 48 h. y 19 días después de la cirugía (n=6), y para la tinción de Golgi a los 19 días después de la cirugía (n=8).

Se recogieron sangre y heces de ratones de los 4 grupos para medir SCFA a los 7 días después de la cirugía (n=7) y para análisis de 16 S a los 3 y 7 días después de la cirugía (n=8) o al final. de 4-semana del protocolo de ejercicio o en el momento correspondiente en los 2 primeros grupos (n=16). Los ratones para la recolección de tejidos eran cohortes diferentes que se utilizaron para pruebas de aprendizaje y memoria. En el segundo experimento, se asignaron aleatoriamente ratones viejos a (1) el grupo Trans-Old Control+Sur y (2) el grupo Trans-Old Exe+Sur. Estos ratones fueron sometidos a cirugía 14 días después del trasplante fecal como se describe en el Segundo experimento con ratones adultos jóvenes. Se evaluó el aprendizaje y la memoria a partir de los 4 días posteriores a la cirugía (n =10).

En el tercer experimento, se asignaron aleatoriamente ratones viejos al grupo (1) cirugía más NS; (2) grupo de ejercicio más NS más cirugía; y (3) grupo de ejercicio más ácido valérico más cirugía. Estos ratones recibieron ejercicio acondicionado y ácido valérico como se describe en el sexto experimento con ratones adultos jóvenes. Los resultados de comportamiento se probaron a partir de 4 días después de la cirugía (n=11). Los tamaños de muestra (n) descritos anteriormente representaron el número de animales que se asignaron al azar a cada grupo/condición. Este número de animales fue la suma de al menos 3 réplicas de cada experimento. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en grupos según tablas de aleatorización generadas por computadora en cada experimento.

Determinación de la capacidad máxima de ejercicio y entrenamiento con ejercicio.

Antes de la cirugía, se expuso a ratones de {{0}}semanas y 18-meses a un ejercicio aeróbico en cinta rodante de 4-semanas después de determinar la capacidad máxima de ejercicio de los ratones individuales. Esta determinación se realizó de manera similar a las descritas anteriormente [47, 48]. Brevemente, los ratones se aclimataron a la cinta rodante el primer día con ajustes iniciales de rejilla de choque a 25 V, 0,3 mA y 2 Hz y la velocidad e inclinación a cero durante 10 minutos. Luego se aumentó la velocidad de la cinta a 10 cm/s con una inclinación de 50 durante 10 min. A continuación, se aumentaron la velocidad y la inclinación de la cinta a 15 cm/arena 100 durante 5 min.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50% del tiempo en la red; y/o (3) falta de motivación para pinchar manualmente. El ratón se retiró inmediatamente del carril respectivo una vez que se cumplieron uno o más de estos criterios. Al día siguiente, los ratones corrieron en la misma cinta a la mitad de la velocidad máxima promedio (35 cm/s en ratones jóvenes o 30 cm/s en ratones viejos) y 100 de inclinación hasta que alcanzaron nuevamente uno de los criterios de agotamiento, y la duración de El ejercicio continuo se registró como la capacidad máxima de ejercicio de cada ratón. Después de estos dos protocolos, los ratones se alojaron por separado durante 30 minutos para evitar un comportamiento agresivo notable después del ejercicio.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >Se excluiría el 3% del tiempo total en 3 días consecutivos.

Los grupos sin ejercicio en el mismo conjunto de experimentos que los grupos con ejercicio fueron colocados en una cinta de correr sin movimiento diariamente durante aproximadamente 30 a 40 minutos. Recibieron 10 descargas durante un total de 5 s, la cantidad promedio de descargas que recibieron los ratones en un grupo de ejercicio cada día, durante su permanencia en una cinta de correr inmóvil. Si un conjunto de experimentos no tenía un grupo de ejercicio, ningún ratón en el conjunto de experimentos recibió descargas.

Tratamiento con antibióticos

Para facilitar la colonización de la microbiota trasplantada, los ratones receptores recibieron un tratamiento con antibióticos una vez al día durante 7 días consecutivos para eliminar su microbiota intestinal original, como lo describimos nosotros y otros [11, 36]. En resumen, después de la purga con sulfato de magnesio al 10% (200 ul/10 g, dos veces con intervalos de 3 h) mediante sonda gástrica el primer día, los ratones C57BL/6 J recibieron amoxicilina/ácido clavulánico (200 mg/kg), metronidazol ( 200 mg/kg) y cefazolina (2 g/kg) mediante sonda gástrica y enema (en 300 ul para sonda gástrica y 400 ul NS para enema) por la mañana una vez al día durante 7 días consecutivos, y amoxicilina/ácido clavulánico (20 mg/kg ), metronidazol (20 mg/kg) y cefazolina (300 mg/kg) en 200 ul NS al día mediante inyección intraperitoneal durante los mismos 7 días (de 4 pm a 5 pm). Para evitar la contaminación cruzada bacteriana, la manipulación del ratón y los cambios diarios de jaula y botella de agua fueron realizados por técnicos que vestían una bata limpia y guantes en una campana ventilada. Las heces de estos ratones se recolectaron 24 h después del último tratamiento para análisis de 16 S para determinar el efecto.

Trasplante fecal

Los gránulos fecales frescos recolectados dentro de los 30 minutos posteriores a la evacuación intestinal de los ratones de control, los ratones inmediatamente después de completar la 4-semana de ejercicio y los ratones de 2 a 8 días después de la cirugía se diluyeron con 100 mg/ml de solución salina estéril. Todos los gránulos fecales de 7 –10 donantes con cada condición experimental se mezclaron y resuspendieron juntos en solución salina. Brevemente, la materia fecal se mezcló en vórtice durante 5 minutos y luego se pasó a través de un colador de células de nailon de 70 μm para eliminar los alimentos no digeridos y los materiales particulados. Los ratones receptores recibieron 500 ul de la solución fecal correspondiente mediante sonda gástrica por la mañana y 600 ul por enema por la tarde a partir de las 24 h posteriores a la última dosis de antibióticos durante 7 días consecutivos. Los ratones trasplantados se mantuvieron durante 2 semanas después del trasplante fecal antes de ser sometidos a recolección fecal para análisis de 16 S y cirugía.

Anestesia y cirugia

La cirugía se dejó expuesta a la arteria carótida como describimos antes [6]. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2% y mantuvieron respiraciones espontáneas con una mascarilla suministrada con oxígeno al 100% durante el procedimiento. La temperatura rectal se controló y mantuvo a 37 grados con la ayuda de una manta térmica. Se realizó una incisión en la línea media del cuello de 2- cm y una disección de tejido blando con una exposición de la arteria común de 1- cm de largo sin ningún daño al nervio vago después de que el ratón fue anestesiado con isoflurano durante al menos 20 minutos. Luego se irrigó la herida y se cerró con una sutura quirúrgica 4-0. El procedimiento quirúrgico se realizó en condiciones estériles y duró alrededor de 15 minutos en ratones jóvenes y 12 minutos en ratones viejos. La duración total de la anestesia general fue de 2 horas. Después de la cirugía, todos los animales recibieron una inyección subcutánea de 3 mg/kg de bupivacaína. No se observó respuesta al pellizco de los dedos del pie durante la anestesia.

Inyecciones intracerebroventriculares

Como se describió anteriormente, algunos grupos de ratones recibieron una inyección intracerebroventricular. Brevemente, estos ratones fueron colocados en un marco de cabeza estereotáxica en posición boca abajo. El sitio de inyección se ubicó en: 1,00 mm mediolateral, −0.3 mm anteroposterior de Bregma y −2,5 mm de profundidad dorsoventral. Los ratones del grupo de cirugía más GDNF recibieron una inyección intracerebroventricular de 1{{ 20}} ug/kg de GDNF de ratón recombinante en 3 ul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) como se describe en estudios previos [6, 26], y los ratones en cirugía más el grupo de GDNF inactivado por calor recibieron una inyección de desnaturalizado por calor (5 minutos a 1000°C). ) Solución GDNF. Los ratones sometidos a cirugía más el grupo antagonista de C3ar recibieron 10 ug/kg de SB290157 en 3 ul de PBS que contenía DMSO al 5 % a las 0 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la cirugía. Los ratones en el grupo de ejercicio más agonista de C3ar y de cirugía recibieron 1 ug/kg de agonista de C3ar en 3 ul de PBS que contenía DMSO al 5% al ​​mismo tiempo que para SB290157. Los ratones en un grupo de ácido valérico del sexto experimento recibieron 4 mg/kg de ácido valérico en 4 µl durante 4 días consecutivos.

Pruebas de comportamiento

El aprendizaje y la memoria se evaluaron mediante el reconocimiento de objetos novedosos y la prueba del laberinto de Barnes. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron entre las 10:00 a. m. y las 5:00 p. m. en una habitación insonorizada. Los ratones utilizados en las pruebas de aprendizaje y memoria no se utilizaron en ningún estudio de bioquímica para evitar los efectos de estas pruebas.

Prueba de reconocimiento de objetos novedosos

Como describimos antes nosotros y otros [20, 49, 50], los ratones se colocaron en una cámara de campo abierto durante 5 minutos para que se habituaran 4 días después de la cirugía. La prueba se realizó de la siguiente manera. Dos de los mismos objetos se colocaron en ángulos adyacentes de la cámara el día del aprendizaje. Los ratones se colocaron en la cámara con la espalda hacia los objetos y se les permitió explorar la cámara libremente durante 5 minutos. El animal era eliminado si el tiempo total de exploración en dos objetos era<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

laberinto de barnes

Siete días después de la cirugía, los animales fueron sometidos al laberinto de Barnes para probar su aprendizaje espacial y su memoria como describimos anteriormente [6, 49]. El laberinto de Barnes es una plataforma circular con 20 agujeros igualmente espaciados (SDInstruments, San Diego, CA). Uno de los agujeros estaba conectado a una cámara oscura llamada caja de objetivos. La prueba comenzó colocando animales en medio del laberinto de Barnes. Se utilizaron ruido aversivo (85 dB) y luz brillante (200 W) arrojados sobre la plataforma para alentar a los ratones a encontrar esta caja. Después de entrenar durante 4 días, su memoria de referencia se probó los días 5 y 12. No se realizó ninguna prueba durante el período. desde el día 5 al día 12. La latencia para ingresar al cuadro objetivo durante cada prueba fue registrada mediante un sistema de seguimiento de video ANYMaze (SD Instruments).

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