El nivel de ejercicio adecuado atenúa la disbiosis intestinal y el aumento del ácido valérico para mejorar la neuroplasticidad y la función cognitiva después de la cirugía en ratones, parte 4

Perfil de microbiota intestinal

Se recolectaron heces frescas de ratones para elaborar perfiles de microbiota intestinal. Los ratones se colocaron individualmente en una jaula tratada en autoclave para recolectar las heces y se les permitió defecar libremente. Las heces se recogieron inmediatamente en tubos Eppendorf estériles en hielo seco y luego se almacenaron a -80 grados hasta su posterior procesamiento. El ADN de las bacterias se extrajo con un kit de aislamiento de ADN del suelo Power Lyzer Power de acuerdo con nuestros protocolos anteriores [11].

Investigaciones recientes muestran que el microbioma intestinal tiene un impacto muy importante en nuestra memoria. Precisamente, las bacterias de la microbiota intestinal pueden influir en el sistema nervioso del cerebro humano, alterando así su función de memoria. Este es un hallazgo sorprendente porque significa que podemos mejorar nuestra memoria cambiando nuestro microbioma intestinal.

Entonces, como alguien que intenta mejorar su memoria, ¿qué puede hacer para mejorar su microbioma intestinal? La respuesta es sencilla: céntrate en una dieta equilibrada. Una dieta equilibrada no sólo ayuda a regular el equilibrio de la microbiota intestinal sino que también mejora todos los aspectos del funcionamiento del cuerpo.

En primer lugar, debemos centrarnos en una dieta diversificada y rica en fibra dietética. Una dieta rica en fibra puede ayudar a mantener la diversidad del microbioma intestinal, un factor clave para promover la buena salud. Al mismo tiempo, también debemos asegurarnos de consumir suficientes proteínas de alta calidad y grasas saludables en nuestras comidas. Estos nutrientes pueden promover la función de la memoria y la conducción nerviosa.

Además, el ejercicio regular y la reducción del estrés también pueden promover el equilibrio y la diversidad en el microbioma intestinal. Ya sea respirando profundamente, meditando o practicando yoga, todas estas son formas efectivas de reducir el estrés. El ejercicio puede mejorar la contractilidad intestinal, aumentar la vitalidad intestinal y promover la desintoxicación cíclica, ayudando así a promover el equilibrio y la diversidad de la microbiota intestinal.

En definitiva, no sólo debemos centrarnos en nuestra dieta y salud física, sino también en nuestra microbiota intestinal. Cambiar nuestros hábitos alimentarios y reducir el estrés puede promover el equilibrio y la diversidad en nuestra microbiota intestinal, lo que puede ayudarnos a mejorar la memoria y la función del sistema nervioso. Entonces, ¡prestemos juntos atención a nuestra salud intestinal y mejoremos nuestra memoria y condición física!

Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino que tiene muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de Cistanche deserticola proviene de los numerosos ingredientes activos que contiene, incluidos ácido tánico, polisacáridos, glucósidos flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de diversas formas.

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Las bibliotecas de secuenciación de la región hipervariable V3-V4 se prepararon de acuerdo con las instrucciones del sistema Illumina MiSeq. Brevemente, se utilizaron 12,5 ng de ADN como plantilla de ADN para la primera PCR de ARNr 16 S. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: F: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′ y R: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′.
Luego, los amplicones se limpiaron con perlas magnéticas AMPure XP y luego se usaron para Index PCR utilizando el kit Nextera XTIndex. Se utilizaron el kit de ensayo Qubit dsDNA HS y la cinta de pantalla D1000 de alta sensibilidad TapeStation (Agilent, Blacksburg, VA, EE. UU.) para medir las concentraciones de los productos de PCR y normalizar la cantidad para la preparación de la biblioteca.

La secuenciación se realizó en un instrumento Illumina MiSeq mediante el kit de reactivos MiSeq v2 (500 ciclos). Los datos se analizaron con el flujo de trabajo Metagenomics v2.5.1.3 del software MiSeqReporter (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Las lecturas pareadas obtenidas mediante secuenciación de doble terminal se fusionaron en una secuencia a través del software Pandaseq. Se obtuvieron lecturas largas con regiones altamente variables.

Se recortaron las lecturas cuya puntuación phred promedio en la ventana (5 pb de tamaño, 1 pb de longitud de paso) era inferior a 20. Se descartaron las lecturas que contenían "N" ambiguo o con una longitud <220 pb. Después del control de calidad de los datos originales, el Se ordenaron secuencias de alta calidad sin quimeras según su abundancia, de mayor a menor, y luego se agruparon con un 97% de similitud en Unidades Taxonómicas Operativas (OTU). Se consideró que cada OTU representaba una especie. Para evitar la desviación del análisis causada por los diferentes tamaños de los datos de secuenciación de las muestras, el número de lecturas de OTU se ingresó de acuerdo con el número de secuencia mínimo coincidente con la OTU cuando la profundidad de secuenciación era suficiente. La diversidad alfa se analizó mediante nivelación aleatoria.

ARead se extrajo de cada OTU como una secuencia representativa. La secuencia representativa se comparó con la base de datos del proyecto de base de datos ribosomal. Se clasificaron las especies para cada OTU y se obtuvieron tablas de abundancia de especies para su posterior análisis. La selección de OTU se realizó utilizando Uclust en la plataforma de software QIIME v1.9.1.

Para el análisis de la diversidad de especies en una muestra se utilizó la diversidad alfa, incluido el índice Chao1 y el índice de cobertura de bienes. Se utilizó el análisis de diversidad beta para comparar diferencias en la diversidad de especies entre muestras y se caracterizó mediante análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en la distancia de Bray-Curtis. Las diferencias entre los grupos se probaron mediante análisis de similitud (ANOSIM).

Perfiles de AGCC en plasma

Las concentraciones plasmáticas de SCFA se cuantificaron utilizando una cromatografía de gases-espectrometría de masas 7890–5977 (GC-MS, Agilent, Blacksburg, VA, EE. UU.). Se recogieron muestras de plasma de ratones en los puntos temporales descritos anteriormente y se almacenaron a -8{ {20}} grados rápidamente y luego se descongela a temperatura ambiente para su procesamiento. Brevemente, se mezcló en vórtex una muestra de plasma de 100 ul con 900 ul de etanol (que contenía HCl al 0,5 %, V/V). Se aplicó un tratamiento ultrasónico durante 40 minutos y luego las muestras se centrifugaron a 14,000 RPM durante 10 minutos. El sobrenadante de las muestras se midió mediante análisis GC-MS en un GC-MS Agilent 7890–5977 con ionización por impacto electrónico y un Columna capilar DB-FFAP (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).

Cuantificación del ácido valérico cortical.

La cantidad de ácido valérico en la corteza cerebral recolectada 24 horas después de la última inyección intraperitoneal de ácido valérico se determinó mediante un método similar al informado anteriormente [51, 52]. Brevemente, 0.1 g de corteza cerebral se homogeneizó en 500 µl de acetonitrilo acuoso. El sobrenadante se extrajo con 8 ml de tampón de extracción (hexano: éter dietílico=1:1) y se centrifugó a 1800 g durante 5 min. Se recogieron 7,5 ml de sobrenadante, se mezclaron con 93 µl de 20 mMKOH en metanol y se secaron a 40 grados bajo nitrógeno gaseoso. El residuo seco se reconstituyó en 50 µl de 18-Crown-6 al 2,5 % en acetonitrilo y se derivatizó adicionalmente con 9-clorometilantraceno en acetonitrilo con la adición de hidróxido de tetrametilamonio.

Finalmente, se cargaron 30 µl de solución de derivatización en una columna Acclaim C18 (3 µm, 4,6 × 100 mm, Thermo Scientific) y se separaron en cromatografía líquida de alto rendimiento Ultimate 3000 (HPLC, Thermo Scientific) equipada con detector UV-visible. El pico del ácido valérico derivatizado se detectó a una longitud de onda de 254 nm.2-Se añadió ácido etilbutírico (2-EA) como control de referencia interno. El área del pico del ácido valérico se midió como mAU*min y su área de pico de cada muestra se normalizó con la de 2-EA en la muestra. Los resultados finales se presentaron como proporciones del grupo ácido valérico al grupo NS.

Recolección de tejido cerebral

Los ratones se pesaron y anestesiaron con isoflurano a las 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 7 días después de la cirugía y se perfundieron con NS de 4 grados para la recolección de tejido cerebral. Estos hipocampos se utilizaron para análisis ELISA o ensayo de ARN. Se utilizó todo el cerebro en Bregma -3 a -6 mm para la tinción inmunofluorescente. Todos los procedimientos de disección se realizaron en hielo.

Preparación de bibliotecas de ARNm y secuenciación Illumina Hiseq.

The hippocampi harvested at 24 h after surgery from the control group, surgery group, and Exe+Sur group in the first experiment were placed in liquid nitrogen for 1 h and then stored in a −80 °C freezer quickly for no >1 semana. La purificación del ARN, la transcripción inversa, la construcción de la biblioteca y la secuenciación se realizaron en WuXi NextCODE en Shanghai de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Illumina).

Las bibliotecas de secuenciación centradas en ARNm a partir de ARN total se prepararon utilizando el kit de preparación de muestras de ARN Illumina TruSeq®. El ARNm de PolyA se purificó a partir del ARN total utilizando perlas magnéticas unidas con oligo-d y luego se fragmentó con un tampón de fragmentación. Tomando estos fragmentos cortos como plantillas, se sintetizó el ADNc de la primera hebra utilizando transcriptasa inversa y cebadores aleatorios, seguido de la síntesis de ADNc de la segunda hebra. Luego, el ADNc sintetizado se sometió a reparación terminal, fosforilación y adición de base 'A' de acuerdo con el protocolo de construcción de bibliotecas de Illumina.

Se agregaron adaptadores de secuenciación Illumina a los fragmentos de ADNc. Después de la amplificación por PCR para el enriquecimiento del ADN, se utilizaron AMPure XPBeads (Beckman) para limpiar los fragmentos objetivo de 200–300 pb. Después de la construcción de la biblioteca, se utilizó el fluorómetro Qubit 3.0 dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific). se utilizó para cuantificar las concentraciones de las bibliotecas de secuenciación resultantes, mientras que la distribución de tamaños se analizó utilizando Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent). La secuenciación se realizó utilizando un sistema Illumina siguiendo los protocolos proporcionados por Illumina para la secuenciación de extremos emparejados 2 × 150 en WuXi NextCODE en Shanghai, China.

Expresión de ARNm del hipocampo mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (Q-PCR)

El hipocampo se extrajo 24 h después de la cirugía del grupo de control, grupo de ejercicio, grupo de cirugía, grupo Exe+Sur, grupo Trans-Control+Sur, grupo Trans-Exe+Sur, grupo Exe+Sur+NS y Exe+Sur+. El grupo Val se colocó en nitrógeno líquido durante 1 h y luego se almacenó en un congelador a -80 grados durante no más de 3 días. La extracción de ARN, la transcripción inversa de ARN a ADNc y la q-PCR se realizaron como describimos anteriormente [49, 53]. Brevemente, el ARN se extrajo mediante el kit RNeasy Micro. La transcripción inversa se completó utilizando 5X All-in-One MasterMix. Finalmente, se utilizó un sistema CFX connect en tiempo real (Bio-Rad) para la cuantificación cuantitativa. Los cebadores para qPCR fueron: C3ar1-F:TGGGCTGGTGCTGTGGGTAG y C3ar1-R: GATGGCGAAGGCGGTTTCAC. La expresión génica relativa para C3ar1 se calculó utilizando el ciclo de umbral comparativo ΔΔCt y el gen de mantenimiento -actina para la normalización de la expresión génica. Los niveles de ARNm para genes diana se expresan como aumentos en relación con el grupo relevante, respectivamente.

Determinación de citocinas y GDNF en el hipocampo.

IL{{0}}, IL-6, C3 y GDNF en el hipocampo se detectaron mediante el uso de ELISAkits. Para probar IL-1, IL,-6 y GDNF, los tejidos cerebrales se homogeneizaron en hielo en el tampón RIPA que contenía Tris-HCl 25 mM con pH 7,6, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 1%, 0,1%. SDS y un cóctel inhibidor de proteasa que contiene 10 mg/ml de aprotinina, 5 mg/ml de pepstatina, 5 mg/ml de leupeptina y fluoruro de fenilmetanosulfonilo 1 mM.

Para la prueba de C3, los tejidos cerebrales se homogeneizaron en hielo en el tampón PTR (suministrado en el kit). El sobrenadante se recogió para la detección por ELISA después de que el homogeneizado se centrifugara a 13,000 g durante 20 minutos a 4 grados y la concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de proteína BCA (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts, Reino Unido). IL-1, IL6, C3 y GDNF en el sobrenadante del cerebro se detectaron según las instrucciones del fabricante para ELISA, y la cantidad de ellos en cada muestra en el cerebro se normalizó por su contenido total de proteínas y se expresó como pg/ mg de proteína.

transferencia Western

La transferencia Western se realizó como se describió anteriormente [49]. En resumen, las concentraciones de proteínas de las muestras se determinaron mediante el ensayo de proteínas BCA. Se sometieron veinte microgramos de cada muestra a análisis de transferencia Western utilizando los siguientes anticuerpos primarios: proteína de densidad postsináptica policlonal de conejo 95 (PSD95) en una dilución de 1:1000, antisinapsina 1 policlonal de conejo en una dilución de 1:1000 y anti- - de conejo. anticuerpo tubulina a dilución 1:1000. Las imágenes fueron escaneadas por un escáner Image Master II (GE Healthcare, Milwaukee, WI, EE. UU.) y analizadas utilizando el software ImageQuant TL v2003.03 (GE Healthcare). Las señales de banda de las proteínas interesadas se normalizaron con las de la tubulina correspondiente y se expresaron como fracciones de la muestra de control de los mismos geles.

Tinción inmunofluorescente

El marcaje inmunofluorescente y la cuantificación de la tinción se realizaron como hemos descrito anteriormente [6, 54]. Brevemente, el cerebro se fijó en paraformaldehído al 4% a 4 grados durante 24 h y luego se incubó en sacarosa al 30% durante la noche a 4 grados antes de congelarlo en un compuesto de temperatura de corte óptima. Se cortaron secuencialmente secciones coronales de 20- µm de espesor de Bregma. −3 a −6 mm utilizando un criostato y montado en portaobjetos de microscopio.

Después de lavarse en solución salina tamponada con Tris (TBS), las secciones se bloquearon en suero de burro al 10% más albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en TBS que contenía triton-X100 al 0,3% durante 2 h a temperatura ambiente y luego se incubaron a 4 grados durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo monoclonal de conejo anti-C3 (1:50), anticuerpo monoclonal de cabra anti-GFAP (1:200), anticuerpo monoclonal de rata anti-C3ar (1:50) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-Iba{{ 21}} anticuerpo (1:200).

Las secciones se enjuagaron en TBS con 0.Triton-x 100 al 1%. El anticuerpo IgG anti-conejo de burro conjugado con Alexa Fluor 594 (1:200), el anticuerpo IgG anti-cabra de burro conjugado con Alexa Fluor 488 (1:200) , Se incubaron anticuerpos IgG anti-rata de burro conjugados con AlexaFluor 594 (1:200) o anticuerpos IgG anti-conejo de burro conjugados con AlexaFluor 647 (1:200) con las secciones durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.

Las secciones se lavaron en TBS, se incubaron con Hoechst 33342 (1:1000) para tinción nuclear, se enjuagaron y se montaron con medio de montaje Vectashield (H-1000; Vector Labs, Burlingame, CA). Las imágenes de inmunotinción se adquirieron mediante z-stack con un sistema de microscopía LSM710 (ZEISS) y en todos los experimentos se incluyó un control negativo que omitía la incubación con el anticuerpo primario.

La cuantificación se realizó como se describió anteriormente [6, 54]. Brevemente, se tomaron imágenes de toda la región del giro dentado (DG) que estaba cubierta por 2 o 3 campos no superpuestos de cada una de las seis secciones secuenciales del hipocampo de un ratón. El número de píxeles por imagen con una intensidad superior a un nivel de umbral predeterminado se consideró como un área teñida positivamente para un marcador interesado y se cuantificó utilizando Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EE. UU.) y Se presenta como porcentaje de área positiva sobre el área total. Luego se promediaron seis mediciones por ratón para reflejar el nivel de tinción positiva. Todos los análisis cuantitativos se realizaron de forma ciega.

Administración de BrdU y tinción inmunofluorescente.

Siete días después de la cirugía, los ratones recibieron 7 inyecciones intraperitoneales consecutivas de 80 mg/kg de 5′-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) al mediodía una vez al día como se describió anteriormente [14]. Los ratones fueron sacrificados 5 días después para recolectar el hipocampo. El hipocampo se fijó en paraformaldehído al 4 % 0. solución salina tamponada con fosfato 1 M a 4 grados durante 24 h y se incluyó en parafina. Se cortaron secuencialmente secciones coronales de cerebro de cinco micrones de espesor de Bregma −2 a −4 mm. La recuperación del antígeno se realizó incubando secciones con tampón de citrato de sodio que contenía citrato de sodio 10 mM, Tween 20 al 0,05 % (pH 6,0) a 95-100 grados durante 20 minutos.

La desnaturalización del ADN se realizó incubando con HCl 1 N en hielo durante 3 minutos, HCl 2 N a temperatura ambiente durante 3 minutos y a 37 grados durante 6 minutos. Las secciones se bloquearon con suero de burro al 5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0.5% de triton-X 100 durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, las secciones se incubaron durante la noche a 4 grados con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo monoclonal anti-BrdU de rata (1:100) y anticuerpo monoclonal anti-GFAP de cabra (1:200). Las secciones se incubaron con anticuerpo IgG anti-rata de burro conjugado con Alexa Fluor 594 (1:200) o anticuerpo IgG anti-cabra de burro conjugado con Alexa Fluor 488 (1:200) durante 1 h a temperatura ambiente en una habitación oscura. Después de lavarlas en PBS, las secciones se contratiñeron con Hoechst 33342 (1:1000), se enjuagaron y se montaron con medio de montaje Vectashield (Vector Labs).

Las imágenes se adquirieron con un microscopio de fluorescencia con una cámara con dispositivo de carga acoplada (High MagOlympus BX51) y un sistema de microscopía confocal LSM710 (ZEISS). En todos los experimentos se incluyó un control negativo que omitía la incubación con el anticuerpo primario. Para cada cerebro de ratón, se utilizaron seis secciones secuenciales del hipocampo para el recuento de células. Se contó el número de todas las células teñidas positivamente para un marcador interesado o la combinación de dos marcadores en la zona subgranular del DG de cada sección. Los análisis cuantitativos se realizaron de forma ciega.

tinción de Golgi

La tinción de Golgi se realizó utilizando el kit FD Rapid GolgiStainTM. Diecinueve días después de la cirugía, los cerebros de 6 ratones de cada grupo se sumergieron en la solución de impregnación (soluciones A y B: 1:1) durante 2 semanas y luego se transfirieron a la solución C durante 3 días. Se cortaron secciones coronales del cerebro con un espesor de 100 μm y alrededor de −2,7 mm de bregma en un vibratomo (Microslicer® 10110, Ted Pella, Inc. California, EE. UU.).

Como se describió anteriormente [55, 56], se seleccionaron aleatoriamente más de 10 neuronas bien individualizadas en la región DG del hipocampo de cada ratón, y se tomaron imágenes secuenciales de escaneo óptico de múltiples capas en un intervalo de 2,0 μma a lo largo del eje z. (3DHISTECH, Pannoramic MIDI, Hungría) con objetivo de 20 ×. Los archivos de escaneo de múltiples capas se superpusieron para convertirse en un archivo de escaneo claro que se puede ver con Caseviewer (3DHISTECH, Hungría) en una computadora. El número total de ramas y la longitud dendrítica se midieron mediante el software Fiji (Fiji-win64, NIH, EE. UU.). La complejidad de los árboles dendríticos totales (intersecciones) se estimó mediante el análisis de Sholl. Para la medición de la densidad de la columna vertebral, se seleccionaron 5 neuronas de cada animal.

A partir de los archivos de escaneo se fotografiaron cinco campos microscópicos seleccionados al azar en las dendritas apicales o basales. Un observador que no conocía la asignación de grupos contó el número de espinas en segmentos de 40 μm. Los resultados se expresaron como el número de espinas/segmentos de 10 μm. Los datos de número de ramas dendríticas, longitud e intersecciones, así como la densidad de las espinas de un ratón, se promediaron para reflejar el nivel del ratón.

análisis estadístico

No se realizó el cálculo del tamaño de la muestra para cada experimento. La determinación del tamaño de la muestra se basó principalmente en nuestra experiencia: se utilizaron tamaños de muestra más grandes para los experimentos que prueban el aprendizaje y la memoria que para los estudios bioquímicos. Todos los datos que se recopilaron se incluyeron en los análisis. Los datos faltantes incluían los animales que cumplían criterios de exclusión predeterminados para el entrenamiento físico y los animales que murieron antes del período de observación previsto. El número de animales que aportaron datos para el análisis de cada condición experimental se indica en las leyendas de las figuras.

Los resultados se presentan como medias ± DE (datos de distribución normal) o mediana ± rango intercuartil (datos no de distribución normal) con la presentación de datos de animales individuales en el gráfico de barras y medias ± DE en los diagramas de líneas. Los datos de las sesiones de entrenamiento de BarnesMaze se analizaron mediante un análisis de varianza repetido de dos factores (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey.

Los datos de la microbiota intestinal se analizaron como se describe en la sección Perfiles de la microbiota intestinal. Los demás datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey si los datos estaban distribuidos normalmente, mediante ANOVA unidireccional de rango seguido del método de Student-Newman-Keuls del test de Tukey si los datos no estaban distribuidos normalmente, mediante ANOVA bidireccional. , mediante prueba t o prueba de suma de rangos. Una diferencia significativa se definió como P < 0.05 según la prueba de hipótesis de dos colas.

No se realizaron ajustes para comparaciones múltiples. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SigmaStat (Systat Software, Inc., Point Richmond, CA, EE. UU.).

REFERENCIAS

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2. Monk TG, Weldon BC, Garvan CW, Dede DE, van der Aa MT, Heilman KM y otros. Predictores de disfunción cognitiva después de una cirugía mayor no cardíaca. Anestesiología. 2008;108:18–30.

3. Newman MF, Kirchner JL, Phillips-Bute B, Gaver V, Grocott H, Jones RH y otros. Evaluación longitudinal de la función neurocognitiva después de una cirugía de bypass de arteria coronaria. N. Engl J Med. 2001;344:395–402.

4. Hall M, Schwartzman A, Zhang J, Liu X. Datos de cirugía ambulatoria de hospitales y centros de cirugía ambulatoria: 2010. Informe nacional de estadísticas de salud 2017.

5. Li Y, Chen D, Wang H, Wang Z, Song F, Li H, et al. Efectos intravenosos versus anestésicos volátiles sobre la cognición posoperatoria en pacientes de edad avanzada sometidos a cirugía abdominal laparoscópica. Anestesiología. 2021;134:381–94.

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