El inhibidor NQDI‑1 de ASK1 reduce el estrés oxidativo y la neuroapoptosis a través de la vía de señalización ASK1/p38 y JNK en lesiones cerebrales tempranas después de hemorragia subaracnoidea en ratas, parte 1

Abstracto. El estrés oxidativo y la neuroapoptosis son procesos patológicos clave después de la hemorragia subaracnoidea (HSA). El presente estudio evaluó los efectos neuroprotectores anti-oxidación y anti-apoptóticos del inhibidor de la quinasa 1 reguladora de la señal de apoptosis (ASK1) etil-2,7-dioxo-2,7-dihidro-3H-nafto(1,2, 3-de) quinoline1-carboxilato (NQDI-1) en la lesión cerebral temprana (EBI) después de SAH en un modelo de rata. Se utilizaron un total de 191 ratas y se indujo el modelo SAH mediante perforación de monofilamento. Posteriormente se usó transferencia Western para detectar los niveles de expresión endógena de proteínas. A continuación, se utilizó inmunofluorescencia para confirmar la localización celular nerviosa de ASK1. La función neurológica a corto plazo se evaluó mediante las puntuaciones de García modificadas y la prueba de equilibrio de haz 24 horas después de la HSA, mientras que la función neurológica a largo plazo se evaluó mediante la prueba de rotarod y la prueba del laberinto de agua de Morris. La apoptosis de las neuronas se evaluó mediante tinción TUNEL y el estrés oxidativo se evaluó mediante tinción con dihidroetidio 24 h después de la HSA. Los niveles de expresión de proteínas de (p‑)ASK1 y ASK1 fosforilados aumentaron después de la HSA. NQDI‑1 se inyectó por vía intracerebroventricular 1 h después de la SAH y demostró mejoras significativas en la función neurológica a corto y largo plazo y redujo significativamente el estrés oxidativo y la apoptosis neuronal. La inyección de NQDI-1 provocó una disminución significativa en los niveles de expresión de proteínas de p-ASK1, p-p38, p-JNK, 4 hidroxinonenal y Bax y aumentó significativamente los niveles de expresión de proteínas de hemooxigenasa 1 y Bcl-2. El uso del inhibidor de p38 BMS-582949 o el inhibidor de JNK SP600125 condujo a disminuciones significativas en los niveles de expresión de proteínas de p-p38 o p-JNK, respectivamente, y una reducción significativa en el estrés oxidativo y la apoptosis neuronal; sin embargo, estos inhibidores no demostraron un efecto sobre los niveles de expresión de la proteína p-ASK1 o ASK1. En conclusión, el tratamiento con NQDI-1 mejoró la función neurológica y disminuyó el estrés oxidativo y la apoptosis neuronal en EBI después de SAH en ratas, posiblemente a través de la inhibición de la fosforilación de ASK1 y la vía de señalización de ASK1/p38 y JNK. NQDI-1 puede considerarse un agente potencial para el tratamiento de pacientes con HSA.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y puede eliminar las especies reactivas de oxígeno, prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Palabras clave: hemorragia subaracnoidea, NQDI-1, quinasa 1 reguladora de la señal de apoptosis, estrés oxidativo, apoptosis, lesión cerebral temprana

Introducción

La hemorragia subaracnoidea (HSA) es una enfermedad cerebrovascular aguda grave causada por el flujo de sangre hacia el espacio subaracnoideo del cerebro (1). Sin embargo, en la actualidad, no existen fármacos efectivos disponibles para mejorar el daño del tejido cerebral después de la HSA después de la prevención del resangrado (2). Por lo tanto, se requieren con urgencia más estudios sobre los mecanismos de lesión cerebral después de la HSA y la exploración de opciones de tratamiento adecuadas para mejorar el pronóstico de la HSA.

La lesión cerebral temprana (EBI, por sus siglas en inglés) se refiere al daño secundario del tejido cerebral causado por múltiples alteraciones fisiológicas y una variedad de cambios patológicos que ocurren dentro de las 72 h posteriores al inicio de la SAH (3). En la fase de respuesta aguda posterior a la HSA, la lesión comienza con la entrada de grandes cantidades de sangre al espacio subaracnoideo y le siguen una serie de lesiones patológicas (4). Como las mitocondrias son particularmente susceptibles a la hipoxia ya la lesión isquémica, la disfunción mitocondrial es una de las principales lesiones patológicas sufridas después de la HSA (5). Se liberan grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que conduce a un aumento del estrés oxidativo y a la activación de la vía apoptótica mitocondrial, lo que provoca lesión y disfunción mitocondrial (6). Por tanto, las modalidades terapéuticas que reducen el estrés oxidativo y la apoptosis son claves para mejorar el pronóstico de la HAS.

La quinasa 1 reguladora de la señal de apoptosis (ASK1), un miembro de la familia de la proteína 3 quinasa activada por mitógeno (MAP3K), se activa por numerosos tipos diferentes de estrés celular y tiene un papel importante en el estrés oxidativo y la apoptosis (7). En cultivos primarios de neuronas del hipocampo de ratón, el inhibidor de la quinasa Rho fasudil revierte la elevación de (p-)ASK1 fosforilada inducida por amiloide, lo que disminuye la apoptosis neuronal en la enfermedad de Alzheimer (8). Sin embargo, hasta donde sabemos, no se han evaluado las opciones terapéuticas dirigidas a ASK1 después de la HSA.

Se ha informado que el etil-2,7-dioxo-2,7-dihidro-3H-nafto(1,2,3-de)quinolina1-carboxilato (NQDI-1) es un inhibidor específico de ASK1 y ha sido validado utilizando ensayos de quinasa in vitro (9,10). Estudios anteriores han informado que NQDI‑1 puede ser eficaz en el tratamiento de numerosas enfermedades a través de la inhibición de la actividad ASK1 (11,12). NQDI-1 alivia el daño mitocondrial inducido por microcistina-LR y la apoptosis en las células de la granulosa ovárica mediante la inhibición de la activación de ASK1 (13). Además, la indometacina puede inducir respuestas apoptóticas en cascada en las células gliales a través de la activación del estrés del retículo endoplásmico por ASK1 (14). Por lo tanto, el inhibidor específico de ASK1, NQDI-1, puede ejercer efectos neuroprotectores después de la HSA a través de la inhibición de la actividad de ASK1. Se considera que p38 y JNK forman las vías de señalización aguas abajo de ASK1; p38 y JNK activados pueden activar aún más una variedad de sustratos, incluidos los factores de transcripción nuclear, así como las proteínas quinasas y otras proteínas funcionales, lo que conduce al inicio del estrés oxidativo y la apoptosis (15).

Se planteó la hipótesis de que el inhibidor de ASK1 NQDI‑1 ejerce efectos neuroprotectores y reduce el estrés oxidativo y la neuroapoptosis a través de la vía de señalización ASK1/p38 y JNK en EBI después de SAH en ratas.

Materiales y métodos

Animales de experimentación.Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética para Animales de Experimentación de la Universidad Central del Sur (aprobación n.º 2019sydw0104). Un total de 191 ratas macho Sprague‑Dawley (SD) que pesaban 280‑320 g se alojaron en un entorno de temperatura constante (21‑23 °C) y humedad (45‑50 %) con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. y tenían libre acceso a agua y alimentos. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (16) y se realizaron según las pautas de la Guía para el cuidado y uso de animales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (17). Cuando las ratas alcanzaron el punto de tiempo preestablecido designado del experimento o cumplieron con ciertos criterios para la eutanasia [pérdida completa de apetito durante 24 h o poco apetito (50 por ciento por debajo de lo normal) durante 3 días, incapacidad para comer o beber, o se evaluaron como siendo cerca de la muerte (comportamiento de autolesión, postura anormal, dificultad respiratoria, etc.)], las ratas se colocaron en un dispositivo de eutanasia de dióxido de carbono con una tasa de desplazamiento de volumen de CO2 establecida en 30 por ciento/min (18). La muerte fue confirmada por el cese de la respiración y los latidos del corazón y la dilatación de las pupilas. Los cadáveres de todas las ratas se embolsaron y congelaron para su eliminación ambientalmente racional.

modelo SAH. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >Se consideró que 8, mediante la evaluación de la puntuación de calificación SAH, cumplían los requisitos experimentales y eran un modelo exitoso. El procedimiento para el grupo simulado fue similar al del grupo SAH, con la excepción de que el alambre de prolina 4-0 no perforó la pared arterial. La respiración, la frecuencia cardíaca, el color de la piel y el reflejo del pedal se monitorearon cada 5 minutos durante las etapas de recuperación quirúrgica y anestésica. De estos, 23 ratas murieron y 8 ratas fueron excluidas, y estas muertes y exclusiones se complementaron con nuevas ratas modeladas con SAH.

Gravedad de la HAS.La gravedad de la SAH se evaluó mediante la puntuación de calificación de SAH 24 h después de la SAH (20). El lado ventral del tejido cerebral se dividió en 6 regiones, cada una con una calificación de 0‑3 según la cantidad de coágulo de sangre y qué tan bien se oscurecieron los vasos sanguíneos: una puntuación de 0 indica que no hay coágulo, 1 indica una pequeña cantidad de coágulo, 2 indica una cantidad moderada de coágulo pero todavía se pueden identificar grandes vasos en la base del cráneo, y 3 indica una gran cantidad de coágulo y vasos no identificables en la base del cráneo. Las seis puntuaciones regionales se sumaron para calcular una puntuación total (0-18), donde las puntuaciones más altas indicaron una hemorragia más grave. Se consideró que las ratas con una puntuación de grado de SAH total inferior o igual a 8 tenían SAH leve, se excluyeron de los experimentos posteriores y se reemplazaron con ratas recién modeladas.

Administración de Drogas.Para permitir que las concentraciones de fármaco en el tejido cerebral se regulen con mayor precisión independientemente del hígado y otros factores, los siRNA y NQDI-1 se administraron mediante inyección intracerebroventricular (21). Después de la anestesia (inducción, isoflurano al 3 por ciento; mantenimiento, isoflurano al 2 por ciento), las ratas se fijaron en un aparato estereotáxico cerebral. El microinyector se fijó al bregma a 1.0 posterior, 1,5 a la derecha y 3,3 mm de profundidad. El siRNA ASK1 (n.º de cat. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) o el control de siRNA Scr (n.º de cat. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) se disolvieron en 5 µl de agua desionizada estéril libre de nucleasas a una concentración de 500 pmol y administrado 48 h antes de la HSA. Las secuencias del siRNA ASK1 fueron las siguientes: sentido 5'‑CGG CAGACAUUGUUAUCAAtt‑3' y antisentido 5'‑UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc‑3'. Las concentraciones y dosis del fármaco notificadas en un estudio similar (22) y la solubilidad de NQDI‑1 se utilizaron para determinar las concentraciones utilizadas en el presente estudio. Se inyectaron tres dosis de NQDI‑1 (1, 3 y 10 µg/kg; Selleck Chemicals) o solución vehículo en un volumen total de 5 µl/rata 1 hora después de la HSA. Las soluciones BMS‑582949 (100 mg/kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg/kg; Selleck Chemicals) y vehículo podían cruzar la barrera hematoencefálica y se administraron por vía intraperitoneal 1 hora después de la HSA (23,24).

Función neurológica a corto plazo.Se utilizaron la puntuación de García modificada y la puntuación de balance de haz para evaluar la función neurológica a corto plazo 24 h después de la HSA. La puntuación de García modificada se dividió en seis categorías de la siguiente manera: movimiento voluntario, movimiento voluntario de las extremidades, extensión de la pata delantera, capacidad de escalar, respuestas somatosensoriales y respuesta de los tentáculos, cada una de las cuales se calificó individualmente y se sumó para dar una puntuación total que oscilaba entre 3 y 18. (25). Se consideró que las puntuaciones más altas indicaban una mejor función neurológica. Para la puntuación del equilibrio del haz, las ratas se colocaron en una viga durante 1 minuto y se evaluó una puntuación que oscilaba entre 0-4 en función de la distancia recorrida (26). Se consideró que las puntuaciones más altas indicaban una mejor función neurológica.

Función neurológica a largo plazo.Los experimentos de preadaptación de Rotarod se realizaron en ratas usando la misma velocidad y aceleración iniciales antes del modelo SAH. Las ratas se colocaron en un probador de barra giratoria Rotamex (Columbus Instruments) para la prueba Rotarod los días 7, 14 y 21 después de la HSA (27). Primero, la velocidad inicial del Rotarod se fijó en 5 revoluciones por minuto y la aceleración en 2 revoluciones por 5 segundos. Después de ponerse las ratas, se registró la latencia de caída de las ratas. A continuación, se permitió que las ratas descansaran durante 1 hora. Finalmente, se probó nuevamente la latencia de caída de las ratas a la velocidad inicial de 5 revoluciones por minuto y una aceleración de 2 revoluciones por 5 seg. Se consideró que una latencia de caída más larga indicaba una mejor coordinación motora en la rata. En la semana 4 después del modelado SAH, se utilizó la prueba del laberinto acuático de Morris para evaluar la memoria de aprendizaje y la orientación espacial de las ratas (27). El ejercicio de aprendizaje de nadar y encontrar una plataforma ubicada debajo de la superficie del agua se realizó desde el día 1 hasta el día 5 en la semana 4 (días 28‑33 después de la SAH) y se registraron la trayectoria de nado, la latencia de escape y la distancia de nado. El último día, se retiró la plataforma para la prueba y se registraron la trayectoria de nado, la distancia de nado y la duración del cuadrante de la sonda durante 60 segundos.

SI tinción.Después de la perfusión secuencial de solución salina a 4 °C y paraformaldehído al 4 % a 4 °C del corazón para eliminar la sangre del tejido cerebral, se obtuvo tejido cerebral intacto. Después de la deshidratación en gradiente de sacarosa, el tejido cerebral se cortó en secciones de 10 µm en posición coronal y se almacenó a -20 °C. La tinción IF se utilizó para evaluar la colocalización de ASK1 con las células nerviosas. Las secciones de tejido congeladas se bloquearon con suero de burro al 5 % (n.º de cat. G1217‑5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios de la siguiente manera: Anti‑ASK1 (ratón; 1:200; n.º de cat. 67072-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.), anti-NeuN (conejo; 1:200; n.º de cat. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) , molécula adaptadora de unión a calcio anti‑ionizado‑1 (Iba‑1; conejo; 1:200; n.° de cat. 10904‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc.), y proteína ácida fibrilar anti‑glial (GFAP; pollo ; 1:200; nº de cat. ab4674; Abcam). A continuación, las secciones de tejido se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes de la siguiente manera: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti‑Mouse IgG (H plus L) (n.° de cat. 715‑585‑150; 1:500 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H más L) (n.° de cat. 711‑545‑152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) y Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti‑Chicken IgY (IgG) (H más L) (n.° de cat. 703‑545‑155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Posteriormente, se tiñeron en busca de núcleos celulares utilizando DAPI de 2 µg/ml (n.º de cat. G1012‑100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) durante 10 min a temperatura ambiente. Las secciones se evaluaron utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX53 (Olympus Corporation) y se capturaron imágenes.

Tinción con dihidroetidio (DHE).La tinción con DHE se realizó para evaluar el estrés oxidativo del cerebro (28). Las secciones congeladas de tejido cerebral se incubaron con 2 µmol/l de DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. Después de teñir los núcleos celulares usando 2 µg/ml de DAPI durante 10 min a temperatura ambiente, las secciones se evaluaron usando un microscopio de fluorescencia Olympus BX53. Se seleccionaron al azar un total de seis secciones de cada tejido cerebral y se seleccionaron al azar seis áreas en cada sección para obtener imágenes. El número de células positivas para DHE se contó utilizando el software ImageJ 1.4 (Institutos Nacionales de Salud) y la media se calculó y tomó como los porcentajes finales para cada sección de tejido cerebral.

Tinción TUNEL.Se utilizó la tinción TUNEL para evaluar el porcentaje de neuronas apoptóticas (29). Las secciones de tejido congeladas se bloquearon con suero de burro al 5 % durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario anti‑NeuN (conejo; 1:200; n.° de cat. 26975‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc. .). Luego, las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo secundario fluorescente Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti‑Rabbit IgG (H más L) (n.º de cat. 711‑545‑152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) durante 2 h. a temperatura ambiente. La tinción TUNEL se realizó utilizando el kit de ensayo de apoptosis TUNEL de un paso (n.º de cat. C1090; Instituto de Biotecnología Beyotime) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Finalmente, las secciones de tejido se tiñeron para núcleos celulares utilizando DAPI 2 µg/ml durante 10 min a temperatura ambiente. La selección aleatoria de las ubicaciones de recuento de TUNEL y el cálculo de las neuronas positivas de TUNEL para cada sección se realizaron utilizando el método mencionado anteriormente para el recuento de DHE.

Western blotting (WB).Se utilizó WB para semicuantificar los niveles de expresión de proteínas. Después de la perfusión de solución salina a 4ºC del corazón para eliminar la sangre del tejido cerebral, se obtuvo tejido cerebral intacto. Estudios previos informaron que el modelo SAH, inducido a través de una punción endovascular del lado izquierdo, da como resultado un grado de sesgo hacia los eventos de sangrado y puede ser relativamente grave en términos de daño al tejido cerebral del lado izquierdo (30). Por lo tanto, el tejido cerebral del lado izquierdo se utilizó para evaluar el daño patológico siguiendo el modelo SAH. Las proteínas del tejido cerebral se extrajeron utilizando una solución de lisis RIPA (n.º de cat. P0013B; Instituto de Biotecnología Beyotime) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de proteína de las muestras se determinó mediante el ensayo BCA (cat. no. P0012; Beyotime Institute of Biotechnology) y posteriormente se ajustó a 5 µg/µl mediante la adición de diferentes cantidades de agua bidestilada. Los 5 µl de las muestras de proteína de 5 µg/µl se agregaron a cada carril y estas muestras de proteína se separaron en geles al 10 por ciento mediante electroforesis SDS‑PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente utilizando leche en polvo sin grasa al 5 % (n.º de cat. P0216-300g; Instituto de Biotecnología Beyotime). Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ˚C con anticuerpos primarios de la siguiente manera: Anti‑p‑ASK1 (Ser‑83; 1:1,000; n.° de cat. MA5‑28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .), anti‑ASK1 (1:1,000; n.º de cat. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1 ,000; n.º de cat. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑p38 MAPK (1:1,000; n.º de cat. 8690; Cell Signaling Technology, Inc.), proteína quinasa activada por antifosfoestrés/quinasa Jun-amino-terminal (fosfo-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; n.º de cat. 9255; Señalización celular Technology, Inc.), anti‑SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; n.º de cat. 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑4 hidroxinonenal (4‑HNE; 1:1 ,000; n.º de cat. ab46545; Abcam), anti-hem oxigenasa 1 (HO-1; 1:1,000; n.º de cat. 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑Bcl‑2 (1:1,000; n.º de cat. 26593‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc.), anti‑Bax (1,1000; n.º de cat. 60267‑1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.) y anti‑‑actina (1:2,000; n.º de cat. 4970; Tecnología de señalización celular, Inc.). A esto le siguió una incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante apropiados durante 2 h a temperatura ambiente: cabra anti-ratón IgG-HRP (cat. no. sc-2005; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology , Inc.) o IgG-HRP anti-conejo de cabra (cat. no. sc-2004; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), y las bandas específicas se visualizaron utilizando un kit ECL (cat. no. P0018AS; Beyotime Institute of Biotechnology) y se tomaron imágenes utilizando un sistema UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH). El análisis densitométrico relativo de las bandas de WB se realizó con el software ImageJ 1.4 (NIH) y los niveles de expresión de proteínas se normalizaron frente a la actina.

Diseño experimental

Cambios de expresión y localización celular de ASK1 después de SAH. Se asignó aleatoriamente un total de 36 ratas a seis grupos (n=6/grupo) de la siguiente manera: i) operación simulada (simulada), ii) 3 h después de la SAH, iii) 6 h después de la SAH, iv ) 12 h post-SAH, v) 24 h post-SAH y vi) 72 h post-SAH. WB se utilizó para evaluar los cambios en los niveles de expresión de proteínas de ASK1 y p‑ASK1 endógenos. Un total de 4 ratas adicionales se dividieron en grupos simulados (n=2) y SAH 24 h (n=2) y se usó la tinción IF para evaluar la colocalización de ASK1.

Efectos terapéuticos del inhibidor de ASK1 NQDI-1 en la función neurológica a corto y largo plazo después de la SAH. Un total de 30 ratas se dividieron en 5 grupos (n=6/grupo) de la siguiente manera: i) Sham, ii) SAH más vehículo, iii) SAH más 1.0 µg /kg NQDI‑1, iv) SAH más 3.0 µg/kg NQDI‑1 y v) SAH más 10.0 µg/kg NQDI‑1. Se utilizaron las puntuaciones modificadas de García y de equilibrio de haz para evaluar la función neurológica a corto plazo 24 horas después de la HSA. En función del grado de mejora neurológica a corto plazo, se evaluó que 3,0 µg/kg de NQDI-1 era el grupo de dosis más apropiado y esta dosis de NQDI-1 se utilizó en experimentos posteriores. Un total de 30 ratas se dividieron en 3 grupos (n=10) de la siguiente manera: i) Sham, ii) SAH más vehículo y iii) SAH más NQDI-1. Se utilizó un experimento rotarod para evaluar la función neurológica a largo plazo los días 7, 14 y 21 después de la SAH, y se realizó la prueba del laberinto acuático de Morris en la semana 4 después de la SAH para evaluar la función neurológica a largo plazo.

Efectos terapéuticos del inhibidor de ASK1 NQDI‑1 sobre el estrés oxidativo y la apoptosis. Un total de 12 ratas se dividieron en 3 grupos (n=4/grupo) de la siguiente manera: i) Sham, ii) SAH más vehículo y iii) SAH más NQDI‑1. La tinción (THE) se realizó para evaluar el estrés oxidativo y la tinción TUNEL se usó para evaluar la apoptosis neuronal 24 h después de la HSA.

Papel de la vía de señalización ASK1/p38 y JNK en los efectos terapéuticos de NQDI‑1. Un total de 48 ratas se dividieron en 8 grupos (n=6/grupo) de la siguiente manera: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH más vehículo, iv) SAH más NQDI‑1, v) SAH más revuelto (Scr) ARN (si) de interferencia corto, vi) SAH más ASK1 siRNA, vii) SAH más BMS‑582949 y viii) SAH más grupos SP600125. Se inyectaron el siRNA de ASK1, el inhibidor de p38 BMS-582949 y el inhibidor de JNK SP600125 para evaluar si ASK1, p38 y JNK estaban involucrados en los efectos neuroprotectores de NQDI-1.

Análisis estadístico. Los datos se presentaron como media ± desviación estándar y los datos experimentales de WB se obtuvieron en 6 réplicas independientes, mientras que la tinción con DHE y la tinción con TUNEL se realizaron como 4 réplicas independientes. Los datos se analizaron utilizando SPSS versión 17 (SPSS, Inc.). Los datos de la prueba del laberinto de agua de Morris se evaluaron mediante un ANOVA mixto/ANOVA de medidas repetidas de dos vías, seguido de la prueba post hoc LSD. Se analizó la distribución normal de los datos de los experimentos restantes mediante la prueba de distribución normal de Shapiro-Wilk, seguida de ANOVA de una vía y luego la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey. Los gráficos se trazaron utilizando GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.). PAG<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Resultados

Mortalidad y gravedad de la HAS. En el presente estudio se utilizaron un total de 191 ratas SD, de las cuales se excluyeron 8 ratas debido a que solo presentaban SAH leve (puntuación de clasificación de SAH inferior o igual a 8). De las ratas SD utilizadas en los experimentos, 34 ratas estaban en el grupo simulado y 149 ratas se sometieron a un modelo de SAH. Ninguna rata del grupo simulado murió; sin embargo, 23 ratas murieron siguiendo el modelo SAH (tasa de mortalidad del 15,4 por ciento) (Tablas SI-V). En comparación con el grupo simulado, los coágulos en el espacio subaracnoideo se ubicaron principalmente cerca del anillo de Willis y en ambos lados de la arteria basilar siguiendo el modelo SAH (Fig. 1A). El modelo de calificación de SAH 24 h después de SAH no demostró una diferencia significativa en la gravedad de la hemorragia entre todos los grupos no simulados y una diferencia significativa entre los grupos simulados y todos los no simulados (Fig. 1B).

Cambios en la expresión de proteínas y localización celular de ASK1 después de SAH. Los niveles de expresión de proteína de ASK1 aumentaron y alcanzaron un pico a las 24 h en el cerebro después de SAH (Fig. 1C y D). Sin embargo, la proporción de la expresión de proteínas de p-ASK1/ASK1 no demostró una diferencia significativa (Fig. 1C y E). La localización celular de ASK1 con neuronas positivas para NeuN, microglía positiva para Iba-1 y astrocitos positivos para GFAP se demostró tanto en el grupo simulado como en el grupo SAH de 24 h (Fig. 1F-H).

El inhibidor de ASK1 NQDI‑1 mejora las funciones neurológicas a corto plazo 24 h después de la HSA. Se inyectó NQDI‑1 (1, 3 y 10 µg/kg) por vía intracerebroventricular 1 hora después de la HSA. Las ratas que se sometieron al modelado de SAH tuvieron puntajes de balance de haz y García modificados significativamente más bajos 24 h después del modelado de SAH; sin embargo, las tres dosis de NQDI-1 produjeron una mejora parcial significativa en la función neurológica a corto plazo (Fig. 2A y B). Las puntuaciones de García modificadas fueron significativamente más altas en el grupo de SAH más NQDI‑1 (3,0 µg/kg) en comparación con el grupo de SAH más NQDI‑1 (1,0 µg/kg); sin embargo, no se demostraron diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo SAH más NQDI-1 (10,0 µg/kg) (Fig. 2A y B), lo que sugirió que aumentar aún más la concentración de NQDI-1 no no provocar una mejoría adicional en la función neurológica a corto plazo después de la HSA. Por lo tanto, se consideró que el NQDI‑1 (3,0 µg/kg) era la concentración óptima efectiva y se utilizó en experimentos posteriores.

El inhibidor de ASK1 NQDI-1 mejora las funciones neurológicas a largo plazo después de la HSA. Usando velocidades iniciales de 5 o 10 rpm para la prueba Rotarod, la latencia de caída se redujo significativamente en el grupo SAH más vehículo en comparación con el grupo simulado, mientras que la latencia de caída se prolongó significativamente después de la inyección intracerebroventricular de NQDI‑1 en comparación con el grupo SAH más vehículo grupo (Fig. 2C y D). Además, durante los días 1-5 de la fase de entrenamiento de la prueba del laberinto acuático de Morris en la semana 4 posterior a la SAH, el grupo SAH más vehículo demostró una latencia de escape y una distancia de nado significativamente más largas en comparación con el grupo simulado, mientras que el tratamiento con NQDI-1 demostró una disminución significativa en comparación con el grupo de vehículo SAH más (Fig. 2E‑G). En la fase de prueba con el retiro de la plataforma circular subacuática, no se observaron diferencias significativas en la velocidad de nado entre los tres grupos (Fig. 2H). La duración del cuadrante de la sonda fue significativamente más corta en el grupo SAH más vehículo en comparación con el grupo simulado y el tratamiento con NQDI-1 prolongó significativamente el tiempo de exploración en comparación con el grupo SAH más vehículo (Fig. 2I).

El inhibidor de ASK1 NQDI‑1 reduce el estrés oxidativo y la apoptosis neuronal 24 h después de la SAH. El nivel de estrés oxidativo se midió mediante tinción con DHE y la proporción de neuronas apoptóticas se evaluó mediante el porcentaje de neuronas positivas para TUNEL 24 horas después de la HSA. El porcentaje de células positivas para DHE fue significativamente mayor en el grupo SAH más vehículo en comparación con el grupo simulado y el tratamiento con NQDI-1 lo redujo significativamente en comparación con el grupo SAH más vehículo (Fig. 3A y). El porcentaje de neuronas positivas para TUNEL fue significativamente mayor en el grupo SAH más vehículo en comparación con el grupo simulado. Sin embargo, el porcentaje de neuronas positivas para TUNEL disminuyó significativamente después del tratamiento con NQDI-1 en comparación con el grupo SAH más vehículo (Fig. 3B y D).

ASK1 siRNA, BMS‑582949 y SP600125 mejoran las funciones neurológicas a corto plazo 24 h después de la SAH. En comparación con el grupo de ARNip de SAH más Scr o el grupo de vehículo de SAH más, la administración de ARNip de ASK1, BMS‑582949 o SP600125 demostró una mejora significativa en la puntuación de balance de haz y García modificada (Fig. 4A y B).

NQDI-1 atenúa el estrés oxidativo y la apoptosis después de SAH a través de la disminución de la fosforilación de ASK1, p38 y JNK. Los niveles de expresión de proteínas de ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, HO-1, Bax y Bcl-2 fueron significativamente más altos después de SAH en comparación con el grupo simulado; sin embargo, la proporción de p-ASK1/ASK1 no fue significativamente diferente (Fig. 5A-M). La inyección de vehículo o Scr siRNA no indujo diferencias significativas en los niveles de expresión de proteínas en comparación con el grupo SAH. En comparación con el grupo SAH más vehículo, el tratamiento con NQDI-1 provocó una disminución significativa en los niveles de expresión de proteínas de p-ASK1/ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE y Bax, mientras que los niveles de expresión de proteínas de HO ‑1 y Bcl‑2 aumentaron significativamente. En comparación con el grupo de ARNip de SAH más Scr, los niveles de expresión de proteína de ASK1 disminuyeron significativamente después de la inyección de ARNip de ASK1. El tratamiento con ASK1 siRNA también resultó en una disminución significativa en los niveles de expresión de proteínas de p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE y Bax y un aumento significativo en la expresión de HO‑1 y Bcl‑2 en comparación con SAH más Scr siRNA grupo.

El inhibidor de p38 BMS-582949 reduce los niveles de expresión de la proteína p-p38 pero no afecta los niveles de expresión de la proteína p-ASK1, ASK1 o p-JNK. El tratamiento con el inhibidor de p38 BMS-582949 demostró una disminución significativa en los niveles de expresión de proteínas de p-p38, 4-HNE y Bax y también aumentó significativamente la expresión de proteínas de HO-1 y Bcl-2 en comparación con el grupo SAH más vehículo; sin embargo, los niveles de expresión de proteínas de ASK1, p-ASK1/ASK1 y p-JNK no demostraron diferencias significativas (Fig. 6A-M). El inhibidor de JNK SP600125 reduce el nivel de expresión de la proteína p-JNK pero no afecta los niveles de expresión de la proteína p-ASK1, ASK1 o p-p38. El tratamiento con el inhibidor de JNK SP600125 provocó una disminución significativa en los niveles de expresión de proteínas de p-JNK, 4-HNE y Bax y un aumento significativo en los niveles de expresión de proteínas HO-1 y Bcl-2 en comparación con el grupo SAH más vehículo; sin embargo, los niveles de expresión de proteínas de ASK1, p-ASK1/ASK1 y p-p38 no se alteraron significativamente (Fig. 7A-M).

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