Efectos atenuantes de Dieckol sobre la nefropatía hipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas
Mar 11, 2022
Resumen: La hipertensión inducerenalfibrosis o fibrosis intersticial tubular, que eventualmente resulta en etapa terminalenfermedad renal.La transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) es uno de los mecanismos subyacentes derenalfibrosis. Aunque estudios previos mostraron que los extractos de Ecklonia cava (ECE) y director (DK) tenían una acción inhibitoria sobre la enzima convertidora de angiotensina (Ang) I, que convierte Ang I en Ang II. Se sabe que Ang II está involucrada en renalfibrosis; sin embargo, no se evaluó si ECE o DK atenuaron la nefropatía hipertensiva al disminuir la EMT. En este estudio, el efecto de ECE y DK en la disminución de Ang II y su vía de señal descendente del receptor de angiotensina tipo 1 (AT1R)/TGF/SMAD, que está relacionado con la EMT y la restauraciónfunción renalen ratas espontáneamente hipertensas (SHR), se investigó. Tanto ECE como DK redujeron significativamente el nivel sérico de Ang II en los SHR. Además, elrenalla expresión de AT1R/TGF/SMAD disminuyó con la administración de ECE o DK. Los marcadores de células mesenquimales en elriñónde SHR se redujo significativamente por ECE o DK. El tejido fibrótico de lariñónde SHR también disminuyó significativamente por ECE o DK. La proporción de albúmina/creatinina en orina de SHR disminuyó significativamente por ECE o DK. En general, los resultados de este estudio indican que ECE y DK disminuyeron los niveles séricos de Ang II y la expresión de AT1R/TGF/SMAD, y luego disminuyeron la EMT yrenal fibrosis en SHR. Además, la disminución de la EMT yrenalla fibrosis podría conducir a la restauración defunción renal. Parece que ECE o DK podrían ser beneficiosos para disminuir la nefropatía hipertensiva al disminuir la EMT yrenalfibrosis.
Palabras clave:transición epitelial a mesenquimatosa; extractos de E. cava; dieckol; ratas espontáneamente hipertensas; fibrosis renal; angiotensina II; riñón; renal
LA CITANCHE MEJORARÁ LA ENFERMEDAD RENAL/RENAL
Introducción
losriñónes un órgano importante que se ve afectado por daño hipertensivo de órganos diana: crónicoenfermedad del riñoncomúnmente ocurre en alrededor del 16 por ciento de los pacientes hipertensos [1]. Las características patológicas de la nefropatía hipertensiva incluyen inflamación, esclerosis glomerular, atrofia tubular y fibrosis intersticial [2]. El tejido fibrótico reemplaza el funcionamiento normal.riñóntejido, lo que conduce ainsuficiencia renal[3,4]. De este modo,renalLa fibrosis intersticial tubular o fibrosis es la principal lesión patológica de la nefropatía hipertensiva, que induce la etapa terminalenfermedad renal(ESRD) [5].RenalLa fibrosis muestra las siguientes características: aumento de la producción masiva de matriz extracelular (ECM), aumento del reclutamiento de fibroblastos en los sitios de lesión tisular y aumento de los cambios de fenotipo de fibroblastos a miofibroblastos que expresan actina de músculo liso (-SMA) [6]. El aumento de los miofibroblastos que expresan -SMA conduce a la deposición innecesariamente excesiva de colágeno y aumenta la desregulación de las metaloproteinasas de la matriz, lo que destruye la membrana basal y acelera aún más la fibrosis [6]. Recientemente, muchos estudios han demostrado que la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) es uno de los mecanismos subyacentes derenalfibrosis [7,8]. Al someterse a EMT, la célula epitelial pierde gradualmente marcadores epiteliales, como la E-cadherina, que es el elemento principal de las uniones de célula a célula, y gana marcadores de fenotipos mesenquimales, como -SMA [9]. Al perder las uniones celulares, las células que se sometieron al proceso EMT se mueven fácilmente hacia el espacio intersticial [9]. Además, las células epiteliales que adquirieron las propiedades de los miofibroblastos expresan -SMA y sintetizan proteínas de la MEC, como el colágeno, lo que finalmente conduce a la fibrosis intersticial tubular (TIF) [9].
La angiotensina II (Ang II) actúa como el actor principal en la fibrosis inducida por hipertensión. Como principal activador del sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), la Ang II provoca graves lesiones vasculares, glomerulares y tubulointersticiales, que se acompañan del aumento del factor de crecimiento transformante-beta (TGF) a través del receptor de angiotensina tipo 1 ( AT1R) [10]. Los niveles de Ang II y su receptor en elriñonesde las ratas espontáneamente hipertensas (SHR) fueron más altas que las de las ratas Wistar Kyoto (WKY) [11]. Se sabe que Ang II induce EMT a través de vías de señalización dependientes de TGF [12]. El tratamiento con Ang II para células NRK52E (líneas celulares epiteliales tubulares normales de rata) induce la expresión de la vía de señalización TGF 1/SMAD, que finalmente aumenta las proteínas proapoptóticas y fibróticas [13]. Cuando Ang II se une con AT1R, la vía de señal SMAD3 se activa e induce EMT en las líneas celulares NRK52E [12].
Se ha informado que los polifenoles de algas marinas funcionan como inhibidores de la enzima convertidora de Ang I (ECA) [14-17]. La ECA participa en la conversión de Ang I en Ang II y aumenta la Ang II como un potente vasoconstrictor, lo que lleva a la hipertensión [18]. Varios florotaninos, como el florofucofuroeckol A, director (DK), y eckol, que están presentes en extractos de Ecklonia cava o Ecklonia stolonifera, muestran actividades inhibidoras de la ECA; por lo tanto, se esperaba que estos polifenoles redujeran la presión arterial (PA) [15,19]. Aunque los extractos de E. cava (ECE) y DK muestran actividades inhibidoras de la ACE, ningún informe ha investigado si ECE o el director están involucrados en la EMT de lariñónorenalfibrosis que es inducida por la hipertensión. Por lo tanto, el efecto de ECE y DK en la disminución de Ang II y su vía de señal descendente de AT1R/TGF /SMAD2/3, que está relacionada con la EMT delriñóny restaurarfunción renalen SHR, fue investigado en este estudio.
2. Resultados
2.1. ECE y DK Presión sistólica reducida y nivel sérico de Ang II en SHR
La PA sistólica de los SHR fue significativamente mayor que la de las ratas WKY y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. Los efectos decrecientes de la administración de 50, 100 y 150 mg/kg/día de ECE y DK no fueron significativamente diferentes (Figura 1a). Las PA diastólica y media de los SHR fueron significativamente más altas que las de las ratas WKY. La administración de ECE o DK no disminuyó significativamente la PA diastólica y media (Figura 1b,c). El nivel sérico de Ang II en las SHR fue significativamente mayor que el de las ratas WKY y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. Además, el efecto decreciente más destacado se observó en el grupo tratado con 150 mg/kg/día de ECE (Figura 1d).
2.2. ECE y DK atenuaron la expresión de AT1R en el riñón de SHR
La expresión de AT1R se evaluó mediante qRT-PCR y tinción. La expresión de ARNm de AT1R en la médula y la corteza delriñónfue significativamente mayor en las SHR que en las ratas WKY. Dicha expresión disminuyó con la administración de ECE o DK (Figura 2a). En la médula, el efecto de disminución fue más prominente en el grupo tratado con DK. En la corteza, 150 mg/kg/día de ECE tuvieron el efecto de disminución más destacado. El nivel de expresión de AT1R en la corteza y la médula de los SHR, que se evaluó mediante tinción, aumentó significativamente y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. Además, el efecto decreciente más destacado se observó en el grupo tratado con DK (Figura 2b,c). Para validar la atenuación ECE y DK de la expresión AT1R enriñóntúbulos, una línea celular del túbulo proximal de ratón (TCMK-1) fue activada por angiotensina II en un modelo in vitro [20]. El nivel de expresión de la proteína AT1R en células TCMK-1 tratadas con angiotensina II con ECE (5, 25, 50 ug/mL), DK o inhibidor disminuyó en comparación con el tratamiento solo con angiotensina II (Figura 2d).
2.3. ECE y DK redujeron la expresión de TGF, SMAD2/3 y Snail2 en el riñón de SHR
Las expresiones de TGF en la médula y la corteza de las SHR fueron significativamente más altas que las de las ratas WKY, las cuales disminuyeron con la administración de ECE o DK. En la médula, el efecto de disminución fue más prominente en los grupos tratados con 150 mg/kg/día de ECE y DK. En la corteza, el efecto de disminución fue más prominente en el grupo tratado con DK (Figura 3a). Las expresiones de SMAD2 en la médula y la corteza de los SHR fueron más altas que las de las ratas WKY, que disminuyeron significativamente con la administración de ECE o DK. El efecto de disminución en la médula fue más prominente en los grupos tratados con 150 mg/kg/día de ECE o DK. En la corteza, los efectos decrecientes de 50, 100 y 150 mg/kg/día de ECE o DK no fueron significativamente diferentes (Figura 3b). La expresión de SMAD3 en la médula y la corteza de los SHR fue significativamente mayor que la de las ratas WKY y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. El efecto decreciente más destacado se observó en el grupo tratado con 150 mg/kg/día de ECE (Figura 3c). La expresión de Snail2 en la médula y la corteza de los SHR aumentó significativamente con la administración de ECE o DK. El efecto decreciente más destacado se observó en el grupo tratado con DK (Figura 3d). En el modelo in vitro, el nivel de expresión de TGF y proteína pSMAD2/3 en células TCMK-1 tratadas con angiotensina II con ECE (5, 25, 50 ug/mL), DK o inhibidor disminuyó en comparación con el único tratamiento con angiotensina II (Figura 3e,f).
Figura 2. Análisis comparativo de la administración de ECE y DK sobre la reducción de la expresión de AT1R en elriñónde SHR y en células TCMK-1 tratadas con angiotensina II. (a) Niveles de ARNm de AT1R en el área de la corteza y en la médula delriñónse midieron mediante análisis qRT-PCR. (b) Niveles de expresión de la proteína AT1R en el área de la corteza y en la médula delriñónse midieron por inmunohistoquímica y (c) los niveles de proteína se cuantificaron mediante el software Image J. Se administraron tres dosis de ECE (50 mg/kg/día, 100 mg/kg/día y 150 mg/kg/día) por vía oral durante 4 semanas y también se administraron 2,5 mg/kg/día de DK por vía oral durante 4 semanas. ( d ) Niveles de expresión de la proteína AT1R en células TCMK -1 tratadas con angiotensina II (renalcélulas tubulares epiteliales) con 5, 25, 50 ug/ml de ECE, 2,5 ug/ml de DK o inhibidor se midieron mediante transferencia de Western. Barra de escala=25 µm. Las medias denotadas por una letra diferente indican diferencias significativas entre los grupos (p < 0,05).="" -="" significa="" el="" mismo="" grupo.="" ece,="" extracto="" de="" ecklonia="" cava;="" dk,="" director;="" inhibidor,="" telmisartán="" 1="">
2.4. ECE y DK Redujeron la EMT en el Riñón de los SHR
La expresión del marcador de células mesenquimales, como vimentina y -SMA, de los SHR fue significativamente mayor que la de las ratas WKY y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK (Figura 4). El efecto decreciente sobre la expresión de vimentina en la corteza de los SHR fue más prominente en el grupo tratado con DK, mientras que el efecto decreciente sobre la expresión de vimentina en la médula de los SHR fue más prominente en el grupo tratado con 150 mg/ kg/día de ECE. Además, el efecto decreciente sobre la expresión de vimentina en la corteza de los SHR fue más prominente en el grupo tratado con DK (Figura 4a, b). La expresión de -SMA en la corteza y la médula de los SHR disminuyó de manera más significativa en el grupo tratado con 150 mg/kg/día de ECE (Figura 4c, d). La expresión del marcador de células epiteliales, como E-cadherina, en la corteza y la médula de los SHR fue significativamente menor que la de las ratas WKY (Figura S1) y aumentó significativamente con la administración de ECE o DK.
Figura 3. Análisis comparativo de la administración de ECE y DK sobre la reducción de la expresión de TGF, SMAD2/3 y Snail2 en elriñonesde SHR. (a) TGF, (b) SMAD2, (c) SMAD3, (d) niveles de ARNm de Snail2 en el área de la corteza y en la médula delriñónse midieron mediante análisis qRT-PCR. Se administraron tres dosis de ECE (50 mg/kg/día, 100 mg/kg/día y 150 mg/kg/día) por vía oral durante 4 semanas y también se administraron 2,5 mg/kg/día de DK por vía oral durante 4 semanas. (e) Niveles de expresión de proteína TGF, SMAD2/3, pSMAD2/3 en células TCMK-1 tratadas con angiotensina II (renalcélulas epiteliales tubulares) con 5, 25, 50 ug/ml de ECE, 2,5 ug/ml de DK o inhibidor se midieron mediante transferencia Western y (f) los niveles de proteína se cuantificaron mediante el software Image J. Las medias denotadas con una letra diferente indican diferencias significativas entre los grupos (p < 0,05).="" -="" significa="" el="" mismo="" grupo.="" ece,="" extracto="" de="" ecklonia="" cava;="" dk,="" director;="" inhibidor,="" telmisartán="" 1="">
Figura 4. Análisis comparativo de la administración de ECE y DK sobre la reducción de EMT en elriñónde los SHR. (a) Niveles de expresión de la proteína vimentina en el área de la corteza y en la médula delriñónse midieron por inmunohistoquímica y (b) los niveles de proteína se cuantificaron mediante el software Image J. ( c ) Los niveles de expresión de proteína -SMA en el área de la corteza y en la médula del riñón se midieron mediante inmunohistoquímica y ( d ) los niveles de proteína se cuantificaron mediante el software Image J. Barra de escala=25 µm. Se administraron tres dosis de ECE (50 mg/kg/día, 100 mg/kg/día y 150 mg/kg/día) por vía oral durante 4 semanas y 2,5 mg/kg/día DK también se administraron por vía oral durante 4 semanas. Las medias denotadas con una letra diferente indican diferencias significativas entre los grupos (p < 0,05).="" -="" significa="" el="" mismo="" grupo.="" ece,="" extracto="" de="" ecklonia="" cava;="" dk,="">
2.5. ECE y DK redujeron la fibrosis renal y la esclerosis glomerular en el riñón de SHR
El área de fibrosis en la corteza y la médula delriñónde los SHR fue significativamente mayor que el de las ratas WKY (Figura 5a, b) y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. En la corteza, el efecto decreciente más destacado se observó en el grupo tratado con DK, mientras que en la médula, el efecto decreciente más destacado se observó en el grupo tratado con 150 mg/kg/día de ECE. El GSI de los SHR fue significativamente mayor que el de las ratas WKY (Figura 5c, d) y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. Además, el efecto decreciente más destacado se observó en el grupo tratado con DK.
Figura 5. Análisis comparativo de la administración de ECE y DK sobre la reducción derenalfibrosis y esclerosis glomerular en elriñónde SHR. (a) Área de la corteza teñida con tricrómico de Masson y área de la médula de unriñónque muestra el área de fibrosis (color azul) y (b) el área de fibrosis se cuantificó mediante el software Image J. (c) Área de la corteza teñida con PAS y área de la médula de unriñónmostrando esclerosis glomerular y (d) la esclerosis se evaluó mediante un método de puntuación semicuantitativo (Grados 0–4). Barra de escala=25 µm. Se administraron tres dosis de ECE (50 mg/kg/día, 100 mg/kg/día y 150 mg/kg/día) por vía oral durante 4 semanas y también se administraron por vía oral 2,5 mg/kg/día de DK por 4 semanas Las medias denotadas con una letra diferente indican diferencias significativas entre los grupos (p < 0,05).="" -="" significa="" el="" mismo="" grupo.="" ece,="" extracto="" de="" ecklonia="" cava;="" dk,="" director;="" gsi;="" índice="">
2.6. ECE y DK Atenuación de la función renal en SHR
La cantidad de ingesta de agua dentro de las 24 h no fue significativamente diferente entre todos los grupos (Figura 6a). El volumen de orina de los SHR dentro de las 24 h fue significativamente menor que el de las ratas WKY (Figura 6b). Se incrementó significativamente con la administración de 100 y 150 mg/kg/día de ECE y DK. La relación sodio/potasio (Na/K) en la orina no fue significativamente diferente entre todos los grupos (Figura 6c). El nivel de albúmina en la orina de los SHR fue significativamente mayor que el de las ratas WKY y disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. Los efectos decrecientes de 50, 100 y 150 mg/kg/día de ECE y DK no fueron significativamente diferentes (Figura 6d). La proporción de albúmina/creatinina en orina de las SHR fue significativamente mayor que la de las ratas WKY y disminuyó con la administración de ECE o DK. Los efectos decrecientes de 50 y 100 mg/kg/día de ECE y DK no fueron significativamente diferentes (Figura 6e).
Figura 6. Análisis comparativo de la administración de ECE y DK sobre la atenuación defunción renalagravamiento en SHR. (a) El consumo de agua, (b) el volumen de orina, (c) la relación Na/K en orina, (d) el nivel de microalbúmina en orina, (e) la relación entre albúmina y creatinina en orina (UACR) se midieron antes del sacrificio. Se administraron tres dosis de ECE (50 mg/kg/día, 100 mg/kg/día y 150 mg/kg/día) por vía oral durante 4 semanas y también se administraron por vía oral 2,5 mg/kg/día de DK por 4 semanas Las medias denotadas con una letra diferente indican diferencias significativas entre los grupos (p < 0,05).="" -="" significa="" el="" mismo="" grupo.="" ece,="" extracto="" de="" ecklonia="" cava;="" dk,="" director;="" ns,="" no="">
3. Discusión
La hipertensión es la segunda etiología principal de ESRD después de la diabetes [21]. Es difícil predecir la gravedad de la hipertensiónrenalfibrosis con BP, ya querenalla fibrosis podría progresar severamente incluso cuando la PA del paciente no es extremadamente alta [21]. Aunque los tratamientos antihipertensivos con inhibidores de la ECA, como los bloqueadores de los receptores de angiotensina, los inhibidores de la renina y los antagonistas de la aldosterona, podrían reducir la gravedad de la hipertensión.enfermedad del riñon, no son suficientes para prevenir la progresión de la nefropatía hipertensiva [22]. Aunque la PA objetivo recomendada se alcanza por debajo de 130/80 mmHg, la estrategia de tratamiento para disminuir la PA no puede retrasar la progresión de la nefropatía hipertensiva [23]. Aunque la nefropatía hipertensiva se describe típicamente como nefroangioesclerosis e hialinosis glomerular [24,25], recientemente se reveló que el intersticio del riñón, que está involucrado en TIF, está relacionado con la progresión de la enfermedad, así como los compartimentos glomerular y vascular [ 26,27]. Dado que TIF es la principal fisiopatología de la nefropatía hipertensiva, es esencial para el desarrollo de nuevos agentes dirigidos a modular TIF para prevenir la progresión de la nefropatía hipertensiva. En los últimos años, la EMT ha sido reconocida como un actor crucial enrenalfibrosis [28,29].
Ang II induce vasoconstricción y, en consecuencia, hipertensión [30]. En la hipertensión, el RAAS se activa sistémicamente, y la regulación positiva del RAAS se acompaña en varios órganos, como elriñón[31,32]. La hiperactivación del SRAA intrarrenal es un mecanismo importante de hipertensión yenfermedad del riñon[31,32]. Tanto el TGF 1 como la Ang II inducen la activación del RAAS intrarrenal y mejoran las expresiones de angiotensinógeno, renina, ACE y AT1R, que inducen la EMT [33]. En nuestro estudio, la PA sistólica de los SHR disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. El nivel sérico de Ang II de los SHR disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK. La expresión de AT1R en la corteza y la médula de los SHR disminuyó significativamente con la administración de ECE o DK.
La regulación positiva de RAAS, como el aumento de la expresión de AT1R, activa la vía de señalización descendente de TGF 1 [34]. Activado por RAAS, el TGF 1 induce la EMT a través de las vías dependiente e independiente de SMAD [33]. Como vía de señalización dependiente de SMAD, la señalización de TGF 1 se transduce a través de TGF RII y TGF RI y conduce a la activación de SMAD2/3. [10]. SMAD4 se une a SMAD2/3 y promueve la translocación del complejo SMAD en el núcleo [10]. Los SMAD translocados regulan al alza las expresiones de los genes EMT, como Snail, Twist y ZEB [34]. En nuestro estudio, la expresión de AT1R fue significativamente mayor en la corteza y la médula de las SHR que en las ratas WKY, y disminuyó con la administración de ECE o DK. La expresión de TGF y SMAD2/3 en la corteza y la médula de los SHR disminuyó con la administración de ECE o DK.
LA CITANCHE MEJORARÁ LA INFECCIÓN RENAL/RENAL
La EMT se caracteriza por la pérdida de un marcador epitelial, como la E-cadherina, y la consecución de marcadores mesenquimales, como -SMA, vimentina y fibronectina [35]. La E-cadherina es la cadherina más expresada en las células epiteliales y, por lo tanto, se usa con frecuencia como marcador epitelial [36]. -SMA es un marcador fenotípico de las células de miofibroblastos, y su expresión es una característica de las etapas avanzadas de la EMT [37]. -Los miofibroblastos que expresan SMA, que se someten a EMT, inducen la síntesis de ECM excesiva y remodelación anormal de ECM yrenalfibrosis [37]. La nefropatía hipertensiva induce glomeruloesclerosis y fibrosis intersticial, lo que induce una disminución de lafunción renaly proteinuria significativa [6]. En nuestro estudio, la expresión de vimentina y -SMA en la médula y la corteza de los SHR aumentó y disminuyó con la administración de ECE o DK. La cantidad de área de fibrosis en la médula y la corteza de los SHR aumentó y disminuyó mediante la administración de ECE o DK. El índice de esclerosis glomerular de los SHR aumentó y disminuyó con la administración de ECE o DK.
El volumen de orina de los SHR disminuyó progresivamente en comparación con el de las ratas WKY de la misma edad [38]. Se sabe que cuanto mayor es la excreción de sodio en la orina, menor es la excreción de potasio en la orina. Además, en estudios humanos, la relación Na/K en orina se asocia con el aumento de la PA y el rápido deterioro de lafunción renal[39]. En nuestro estudio, el volumen de orina de las SHR fue menor que el de las ratas WKY, aunque la cantidad de agua consumida no fue diferente entre las ratas SHR y WKY. La relación Na/K en la orina de los SHR fue significativamente diferente entre las ratas WKY, SHR y los grupos tratados con ECE o DK. La relación Na/K en la orina se utilizó como marcador de la ingesta de sodio y potasio en la dieta en estudios con humanos [39]. La PA aumentó con el aumento de la ingesta de sodio. Sin embargo, el aumento de la ingesta de potasio disminuyó la PA al aumentar la excreción de sodio en la orina [40]. Por lo tanto, la relación Na/K en orina está asociada con la PA en humanos [40]. En nuestro estudio, todos los animales no fueron alimentados con una dieta alta en sodio, lo que explica por qué la relación Na/K en la orina entre los grupos no mostró ninguna diferencia significativa. La hipertensión tiende a aumentar la proteinuria [37]. Se sabe que el cociente albúmina-creatinina en la orina se asocia con una disminución de la tasa de filtración glomerular [41]. Estudios previos han demostrado que el desarrollo de microalbuminuria en SHR está causado por una lesión tubular predominante, que induce la pérdida urinaria de proteínas de bajo peso molecular [42,43]. En nuestro estudio, la proporción de albúmina a creatinina en la orina de los SHR fue más alta que la de las ratas WKY y disminuyó con la administración de ECE o DK.
Estudios previos mostraron que varios polifenoles tienen un efecto inhibidor sobre la actividad de la ECA [14-17]. Sin embargo, estos estudios solo informaron la actividad inhibidora de la ECA como un valor IC50, que es la concentración de inhibición del 50 por ciento del control positivo, y no mostraron un efecto antihipertensivo o un efecto protector contra la nefropatía hipertensiva en los animales. Un estudio mostró que ECE disminuyó la PA en el 2-riñón1-clip Goldblatt ratas hipertensas [44]. Pyrogallol-phloroglucinol-6,6-bieckol disminuyó la PA en el modelo animal de hipertensión inducida por una dieta rica en grasas mediante la modulación de la disfunción vascular [45]. Sin embargo, estos estudios solo mostraron una disminución de la PA y no evaluaron si la ECE mostró algún efecto atenuante de la nefropatía hipertensiva. Nuestro estudio mostró que ECE y DK disminuyeron la expresión de AT1R/TGF /SMAD2/3 en elriñóny disminuyó el nivel sérico de Ang II. Además, ECE y DK redujeron la EMT,renalfibrosis y esclerosis glomerular. Parece que ECE y DK podrían ser útiles para atenuar la nefropatía hipertensiva
4. Materiales y Métodos
4.1. Preparación de ECE y Aislamiento de DK
Los ECE se obtuvieron de Aqua Green Technology Co., Ltd. (Jeju, Corea). La E. cava se lavó minuciosamente con agua pura y se secó al aire a temperatura ambiente durante 48 h. Se molió y se añadió etanol al 50 por ciento, seguido de calentamiento a 85 ◦C durante 12 h. Los ECE se filtraron y luego, cuando se concentraron, se esterilizaron calentándolos a alta temperatura durante 40 a 60 minutos y luego se secaron por aspersión. A continuación se aisló el Director, que es uno de los florotaninos representativos de E. cava. Brevemente, la cromatografía de partición centrífuga se realizó utilizando un sistema de solventes de dos fases que mezclaba agua pura, acetato de etilo, n-hexano y una mezcla de metanol (proporción 7:7:2:3). La fase estacionaria orgánica se cumplió en la columna y la fase móvil se cumplió en la columna, siguiendo el orden decreciente de tasa de compañeros (2 mL por minuto) y se utilizó para la separación. Seguimos los métodos del Dr. Son et al. (2019) [45].
LA CITANCHE MEJORARÁ LA INSUFICIENCIA RENAL/RENAL
4.2. Modelo animal de hipertensión
Se compraron SHR machos (8 semanas de edad) y ratas WKY macho (8 semanas de edad) en Orient Bio (Sungnam, Corea) y se mantuvieron a una temperatura constante de aproximadamente 24 ◦C, humedad relativa de 50–55 por ciento y luz/ ciclo oscuro de 12 h/12 h. La sublimación de ratas se llevó a cabo durante 1 semana. Las ratas se dividieron aleatoriamente en seis grupos (cinco ratas por grupo): (i) grupo WKY, en el que a las ratas se les administró oralmente agua potable durante 4 semanas; (ii) grupo SHR, en el que a las ratas se les administró oralmente agua potable durante 4 semanas; (iii–v) grupo SHR, en el que a las ratas se les administró oralmente ECE de (iii) 50 mg/kg/día, (iv) 100 mg/kg/día y (v) 150 mg/kg/día durante 4 semanas; (vi) grupo SHR, en el que a las ratas se les administró por vía oral 2,5 mg/kg/día de DK durante 4 semanas. Después de 4 semanas, el consumo de agua, el volumen de orina y el análisis químico de la orina se validaron con jaula metabólica durante 24 h. Después de completar el análisis metabólico, todas las ratas se sacrificaron de acuerdo con los principios éticos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Gachon (número de aprobación: LCDI-2019-0121).
4.3. inmunohistoquímica
tejido renalLos bloques de parafina se seccionaron a 8 µm, se colocaron en portaobjetos cubiertos de gelatina y se secaron a 37 ◦C durante 3 días. losriñónLos portaobjetos de tejido se desparafinizaron y luego se incubaron con 0,3 por ciento de peróxido de hidrógeno (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) durante 10 min. Posteriormente, los portaobjetos se enjuagaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron con suero animal para inhibir la unión no específica de anticuerpos. Además, se incubaron con anticuerpos primarios (anti-AT1R, anti-E-cadherina, anti- -SMA y anti-vimentina) y se enjuagaron con PBS tres veces. Luego, los portaobjetos de tejido se incubaron con los anticuerpos secundarios biotinilados del kit ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.), se incubaron durante 3 h con una solución de bloqueo y se enjuagaron con PBS tres veces. Los portaobjetos de tejido se revelaron con 3,3-diaminobencidina como sustrato durante 3 min, se montaron con una solución DPX basada en xileno (Sigma-Aldrich) y se visualizaron mediante microscopía óptica (Olympus Optical Co., Tokio, Japón) .
4.4. Extracción de ARN y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
El ARN de la ratariñónLos tejidos se aislaron utilizando el reactivo RNAiso Plus (TAKARA, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. losriñónLos tejidos se dividieron primero en dos partes, a saber, la parte de la corteza y la parte de la médula. Los tejidos renales se cortaron finamente y se trituraron hasta convertirlos en polvo, y los polvos se resuspendieron con 1 ml de reactivo RNAiso Plus, se mezclaron con 0,1 ml de cloroformo puro glade (Amresco, Solon, OH, EE. UU.) y luego centrifugado a 13,000× g durante 20 min a 4 ◦C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se mezcló con 0,25 ml de alcohol isopropílico puro de glade, y los sedimentos de ARN extraídos se lavaron con alcohol al 70 % y se centrifugaron a 7500 × g durante 5 min a 4 ◦C. Los gránulos secos se disolvieron en 10–30 µl de agua pura tratada con dietilpirocarbonato, y el ARN se cuantificó y verificó con NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.). El ADN complementario (ADNc) se preparó a partir de ARN utilizando un kit de síntesis de ADNc (PrimeScript™, TAKARA). Una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) determinó los niveles de ARN de lariñóntejidos Los cebadores directo e inverso se mezclaron con agua destilada y luego se colocaron 10 µl de mezclas en una placa de qRT-PCR de 384-pocillos. El cDNA y SYBR green (TAKARA) se agregaron posteriormente y luego se validaron usando una máquina qRT-PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Los genes de interés se enumeran en la Tabla complementaria S1. Seguimos los métodos del Dr. Son et al. 2019 [45].
4.5. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Para confirmar el nivel sérico de Ang II, se añadió una alícuota de la sangre extraída (1,5 a 1,7 mL) en tubos separadores de suero (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) y luego se centrifugó a 2000 × g durante 20 min a temperatura ambiente. . Posteriormente, el suero separado se movió a un tubo nuevo y se almacenó en un congelador profundo. Se utilizó el kit ELISA Ang II (MyBioSource, San Diego, CA, EE. UU.) para analizar la presencia de suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ang II se midió dentro de 1 semana después de la extracción de sangre de los animales.
4.6. Análisis histológico
4.6.1. Tinción de tricrómico de Masson (MT)
La tinción de tricrómico de Masson (MT) valida la fibrosis de lariñón.Bloques de parafina incluidosriñónel tejido se seccionó a un espesor de 8 µm, se colocó en un portaobjetos y se secó a 37 ◦C durante 3 días. Los portaobjetos de tejido se desparafinizaron con xileno y alcohol y se volvieron a fijar con solución de Bouin durante 24 h y se enjuagaron con agua corriente durante 3 min. Los portaobjetos se sumergieron en solución de hematoxilina férrica de Weigert durante 10 min y en solución de fucsina ácida escarlata de Biebrich durante 15 min y luego se diferenciaron con solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico durante 10 min. Finalmente, los portaobjetos se transfirieron a una solución de azul de anilina durante 3 min y luego se lavaron con agua. Los portaobjetos teñidos se montaron con solución DPX basada en xileno (Sigma-Aldrich) y se visualizaron mediante microscopía óptica (Olympus). Las fibras de colágeno parecen ser de color azul en el área de fibrosis, mientras que lasrenalel epitelio parece ser de color rojo. Las áreas de fibrosis teñidas con MT se midieron utilizando el software ImageJ. Las imágenes originales del riñón teñido con MT se convirtieron en imágenes RGB, y luego estas imágenes se desconvolucionaron usando el software ImageJ usando el complemento de deconvolución de color.
4.6.2. Tinción de ácido peryódico de Schiff (PAS)
Una tinción de ácido peryódico de Schiff (PAS) validó el daño glomerular delriñón. Bloques de parafina incluidosriñónel tejido se seccionó a un espesor de 8 µm, se colocó en un portaobjetos y se secó a 37 ◦C durante 3 días. Los portaobjetos de tejido se desparafinizaron con xileno y alcohol, se hidrataron con agua, se oxidaron con 0solución de ácido peryódico al 0,5 % durante 5 min y se lavaron con agua. Los portaobjetos se sumergieron con el reactivo de Schiff durante 15 min y luego se lavaron con agua tibia del grifo durante 5 min. Finalmente, los portaobjetos se transfirieron a solución de hematoxilina de Mayer durante 1 min y luego se lavaron con agua. Los portaobjetos teñidos se montaron con solución DPX basada en xileno (Sigma-Aldrich) y se visualizaron mediante microscopía óptica (Olympus).
Los glomérulos se seleccionaron al azar y el daño glomerular se evaluó utilizando un método de puntuación semicuantitativo (Grados 0–4) usando teñidos con PAS.riñónportaobjetos de tejido.
(1) Grado 0: glomérulos normales; (2) Grado 1: esclerosis mínima (área esclerótica hasta el 25 por ciento); (3) Grado 2: esclerosis moderada (área esclerótica del 25 al 50 por ciento); (4) Grado 3: esclerosis moderada a grave (área esclerótica del 50 al 75 por ciento); (5) Grado 4: esclerosis severa (área esclerótica del 75 al 100 por ciento); El índice glomeruloesclerótico (GSI) se calculó mediante la siguiente ecuación: (4 × n4) más (3 × n3) más (2 × n2) más (1 × n1) / n4 más n3 más n2 más n1 más n0, donde n ( x) es el número derenalesclerosis glomerular en cada grado [46]. Este análisis fue realizado en los grupos de tratamiento por un observador enmascarado.
4.7. Mediciones de presión arterial sistólica, presión arterial diastólica y presión arterial media
La PA sistólica, la PA diastólica y la PA arterial media se midieron utilizando un sistema de manguito de cola no invasivo CODA (Kent Scientific Corp., Torrington, CT, EE. UU.). La sublimación de la rata se llevó a cabo durante 20 min durante 5 días y se midió la PA el último día.
4.8. Modelado in vitro utilizando células TCMK-1
Las células TCMK-1, una línea celular del túbulo proximal de ratón, se adquirieron de American Type Culture Collection (Washington, DC, EE. UU.). Como medios de cultivo se utilizaron medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (Gibco; Grand Island, NY, EE. UU.), suero fetal bovino (FBS) al 10 por ciento y penicilina-estreptomicina al 1 por ciento. Para validar los efectos inhibitorios de ECE y DK en células TCMK-1 tratadas con angiotensina II, tratamos ECE (5, 25, 50 µg/ml) y DK (1,8 µg/ml) con 100 nmol/l de angiotensina II (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) durante 12 h. Se usó telmisartán (1 µmol/L, Sigma-Aldrich) como antagonista del receptor AT1 y se pretrató antes de la angiotensina II durante 3 h [47].
LA CITANCHE MEJORARÁ EL DOLOR DE RIÑÓN/RENAL
4.9. Preparación de Proteínas y Western Blot
Para aislar la proteína de las células TCMK-1 tratadas con angiotensina II, las células se rasparon usando el tampón de lisis RIPA con inhibidor de fosfatasa y proteinasa (EzRIPA; ATTO; Tokio, Japón) y se incubaron en hielo durante 20 mín. Después de centrifugar a 13,000× g durante 20 min, a 4 ◦C, los sobrenadantes limpios se trasladaron a un tubo nuevo y se analizó la concentración de sobrenadantes con un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA kit; Thermo Fisher Scientifific, Inc.; Waltham, MA, EE. UU.). Para validar la expresión de proteínas de las células TCMK-1, se realizó la transferencia. Se separó una cantidad igual de proteínas de lisado (30 µg/carril) mediante gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico al 10 por ciento usando electroforesis. Luego, las proteínas de corrida se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno, que se incubaron con anticuerpos primarios diluidos (Anti- -actina, AGTR1, TGF-, SMAD2/3 y pSMAD2/3) a 4 ◦C. Las membranas incubadas con anticuerpos se lavaron a fondo con solución salina tamponada con Tris con Tween 20 al 0,1 por ciento y se incubaron con anticuerpos secundarios durante 2 ha temperatura ambiente. Todas las membranas se desarrollaron mediante quimioluminiscencia mejorada (LAS-4000s; GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.). La información de anticuerpos utilizada en este estudio se puede encontrar en la Tabla S2.
4.10. Análisis estadístico
Los resultados se presentan como media ± DE, y los valores de p de<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">
5. Conclusiones
En conclusión, AT1R estaba regulado al alza en los SHR, y la vía de la señal aumentó TGF y SMAD2 o 3, lo que indujo EMT. O ECE o DK regularon a la baja la vía de la señal y disminuyeron la EMT. Por lo tanto, ECE o DK disminuyeron los marcadores de células mesenquimales como la expresión de vimentina y -SMA, el tejido fibrótico de lariñón, y la relación albúmina/creatinina en orina y atenuaron la EMT. Es más,renalla fibrosis condujo a la restauración defunción renal(Figura 7).
