Efectos beneficiosos de la fracción de glucósido feniletanoide total aislada de Cistanche Deserticola sobre la microestructura ósea en ratas ovariectomizadas

El presente estudio fue diseñado para estimar la actividad antiosteoporótica de la fracción de glucósido feniletanoide total aislada de C. deserticola (CDP) en ratas inducidas por ovariectomía (OVX), así como los mecanismos relacionados. Después de 3 meses de administración oral, se recuperó la disminución de la densidad mineral ósea, Ca sérico y P en ratas OVX y la microarquitectura ósea trabecular deteriorada mejoró parcialmente con la intervención de CDP (60, 120 y 240 mg/kg), las actividades de los marcadores de resorción ósea estaban regulados negativamente y el bioactivo del índice de formación ósea estaba regulado positivamente; mientras tanto, el contenido de MDA disminuyó y el GSH aumentó mediante el tratamiento con CDP. En términos de composición, se identificaron 8 compuestos de glucósido de feniletanoide en CDP, con un contenido total cuantificado en 50,3 por ciento utilizando el método de HPLC. De manera mecánica, la CDP disminuyó los niveles de TRAF6, RANKL y RANK, lo que suprimió la activación inducida por RANKL/RANK/TRAF6-de las vías de señalización posteriores de NF-κB y PI3K/AKT y, en última instancia, impidió las actividades de las proteínas osteoclastogénicas clave de NFAT2 y c-Fos. Todos los datos anteriores implicaban que CDP exhibió efectos beneficiosos sobre la microestructura ósea en ratas ovariectomizadas, y estos efectos pueden estar relacionados con las vías de señalización de NF-κB y PI3K/AKT que se desencadenaron por la unión de RANKL, RANK y TRAF6.

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1. Introducción

La osteoporosis posmenopáusica, que sufrirá 1 de cada 3 mujeres mayores de 50 años, se está convirtiendo en el principal peligro para la salud que afecta a más de 200 millones de mujeres en todo el mundo [1]. En la menopausia, la fuerte disminución del nivel de estrógeno generalmente conduce a una reabsorción ósea excesiva causada por una osteoclastogénesis mejorada; luego, el equilibrio entre la formación ósea inducida por osteoblastos y la resorción ósea inducida por osteoclastos se interrumpió, y la resorción ósea acelerada finalmente causó osteoporosis e incluso fracturas de cadera o columna [2]. Se creía que la diferenciación del osteoclasto se desencadenaba cuando el receptor activador del factor nuclear kappa B (RANK) se unía a RANKL, el ligando de RANK. Sin embargo, la combinación de RANK con RANKL no se puede activar a menos que se le una el factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral proteico (TRAF6) [3], seguido de la estimulación de las vías de señalización aguas abajo, incluidas PI3K/AKT y NF-κB. Y finalmente, se regularon las expresiones del factor nuclear de células T activadas c2 (NFAT2) y c-Fos [4] para modular la diferenciación del osteoclasto así como la resorción ósea. Por lo tanto, los factores y reguladores que están directa o indirectamente relacionados con la activación y diferenciación de los osteoclastos se consideraron objetivos cruciales para prevenir la pérdida ósea.

De hecho, existen algunos medicamentos de terapia de reemplazo hormonal sintéticos y clínicos, como el valerato de estradiol, que son efectivos en el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Desafortunadamente, algunos de estos aumentaron el riesgo de cánceres graves, incluidos los cánceres de mama y de endometrio [5], lo que limitó sus aplicaciones clínicas.

Por lo tanto, es necesario seleccionar otras alternativas con eficacia y efectos secundarios mínimos. La medicina tradicional china (MTC), así como los compuestos y fracciones bioactivos aislados [6–9], demostraron su eficacia en diversas dolencias, incluida la osteoporosis posmenopáusica. Entre estos componentes y fracciones bioactivos, se creía que los compuestos de glucósido feniletanoide (PhG) con eficacia potencial eran agentes prometedores para el tratamiento de la osteoporosis [10-12]. Las estructuras de las PhG consisten en aglicona de ácido cinámico, un grupo hidroxil fenil etilo que se combina con -glucopiranosa, apiosa, galactosa, ramnosa o xilosa a través de un enlace glucosídico. Existen ampliamente en especies medicinales del género Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma es una medicina tradicional china oficial registrada en la farmacopea china, y además de ser una medicina tradicional china importante [14], C deserticola también es una hierba tónica antienvejecimiento con pocos efectos secundarios que se ha convertido en licor medicinal y líquido nutricional aprobado por la Administración Estatal de Alimentos y Medicamentos.

Según el registro de la farmacopea china, los nativos habían utilizado tradicionalmente C. deserticola para tratar problemas de deficiencia de esencia renal como debilidad muscular y debilidad lumbar, y los compuestos de glucósido feniletanoide, incluidos el equinacósido y el acteósido, son los principales componentes bioactivos de esta hierba. De acuerdo con la teoría de la MTC de "riñón-gobierno-hueso", el sistema óseo está gobernado por la esencia del riñón [15], y los problemas relacionados con los huesos, como la osteoporosis, podrían curarse con hierbas o compuestos que posean la actividad de nutrir la esencia del riñón. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la fracción de glucósido feniletanoide total aislada de C. deserticola, al menos en parte, era beneficiosa en el tratamiento de la osteoporosis. Por lo tanto, el experimento actual fue diseñado para validar nuestra hipótesis mediante el uso de un modelo de rata ovariectomizada (OVX); Además de los marcadores de resorción y formación ósea que deben estimarse, el índice de antioxidación, así como las vías de señalización RANKL/RANK/TRAF6- inducidas por PI3K/AKT y NF-κB, también se emplearon para investigar los principales mecanismos de la bioactividad antiosteoporótica

2. Materiales y Método

2.1. Materiales Vegetales y Preparación. Se recolectó un total de 30 kg de tallos de Cistanche deserticola YC Ma del condado de Yongning en septiembre de 2015 con las coordenadas 106.026597 y 38.262816, provincia de Ningxia, China. La hierba fue identificada por el Dr. Lin Dong (Departamento de Farmacognosia, Universidad Médica de Ningxia), y se conservó una muestra correspondiente (#20150901) en el Departamento de Análisis Farmacéutico.

En primer lugar, se extrajeron 30.0 kg de C. deserticola en polvo usando el método de reflujo con 70 por ciento de etanol como solvente; la relación de material a solvente se fijó en 1: 10, y el tiempo de reflujo fue de 2 h por 3 veces. Luego, todos los filtrados se combinaron y condensaron bajo presión reducida a 60 grados C. En segundo lugar, se usaron columnas de resina macroporosa AB-8 para la separación preliminar y diferentes proporciones de etanol en agua ({ {34}} por ciento, 20 por ciento, 30 por ciento, 40 por ciento, 50 por ciento y 60 por ciento, cada 60 L) se emplearon para eluir. En tercer lugar, los eluyentes al 40 % y al 50 % se combinaron y purificaron aún más utilizando columnas de resina macroporosa AB-8 repetidas con los eluyentes de 0 %, 20 %, 30 %, 40 % y 50 % de etanol en agua, y cada eluyente fue de 12 L. Finalmente, la fracción del 40 por ciento se recogió y condensó a presión reducida para obtener 150 g de fracción de glucósido feniletanoide de sedimento amarillo pálido de C. deserticola (CDP, el rendimiento fue del 0,5 por ciento). Para los experimentos in vivo, se empleó disolvente de CMC-Na al 0,5 por ciento para disolver CDP; la administración oral a los animales se fijó en 1 mL/100 g de peso corporal; para el análisis de transferencia Western in vitro, se disolvió CDP con DMSO y luego se diluyó con DMEM para obtener las concentraciones finales de 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL y 0,001 mg/mL.

2.2. Químicos y Disolventes. El valerato de estradiol (EV) era de Delpharm Lille SAS, Francia; kits de ELISA de entrecruzamiento de fosfatasa alcalina (ALP), gla-proteína ósea (BGP), fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y desoxipiridinolina (DPD) de Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghái, China, 201605; kits de reactivos de malondialdehído (MDA, 20181221), superóxido dismutasa (SOD, 20121218) y glutatión (GSH, 20181221) del Instituto de Ingeniería Biológica Jiancheng de Nanjing, Nanjing, China; Kits ELISA de entrecruzamiento de parathormona intacta (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonina (2L9ISN7AIU) y receptor alfa relacionado con estrógeno (ERR, Y3AY8QEWB3) de Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, China; kit de reactivos ELISA de catepsina K de BioVision, America, 11300141; anticuerpos primarios de RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 quinasa p85 alfa (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -actina (17AV0411) y anticuerpos secundarios de IgG anticonejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante de ZSGB-BIO, China, 136080; el kit de ensayo de proteína BCA total y el kit comercial para la detección de formación de osteoclastos y suero bovino fetal y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) de HyClone, Logan, UT, EE. UU.; membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de Millipore Life Sciences, Billerica, MA, EE. UU.; penicilina y estreptomicina de Gibco, Rockville, MD, EE. UU. Todos los demás agentes químicos utilizados fueron de grado AR.

2.3. Cuantificación por HPLC de CDP. Se empleó un instrumento HPLC Agilent 1220 para identificar y cuantificar la composición de CDP. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: columna C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); la elución en gradiente contenía los disolventes A (acetonitrilo) y B (agua que contenía un 0,5 por ciento de ácido acético) (0-10 min: 17-20 por ciento de A; 10-30 min: 20-25 por ciento de A; y 30-40 min: 25-30 por ciento A); la longitud de onda de detección fue de 333 nm; temperatura ambiente; el caudal fue de 1,0 ml/min; el volumen de inyección de la muestra fue de 5 μL. Se identificaron ocho compuestos de PhG, a saber, cistanosido F, echinacósido, 6'-acetilactosido, cistanosido C, cistanosido A, acteosido, 2'-acetilactosido e isoactosido; mediante el uso de las sustancias de referencia correspondientes y un método estándar externo, los contenidos de los 8 PhG anteriores se cuantificaron mediante análisis HPLC (Figura 1).

2.4. Protocolo de Experimentación Animal. Se seleccionaron un total de 60 ratas Sprague-Dawley adultas hembra de 3 meses de edad del centro de pruebas con animales de la Universidad Médica de Ningxia, con un peso corporal inicial promedio de aproximadamente 234 ± 25 g. Las ratas se alojaron en un entorno libre de patógenos específico estándar para aclimatarlas durante 1 semana. Luego, se anestesiaron todas las ratas (hidrato de cloral, 100 mg/kg, ip) únicamente o se sometieron a ovariectomía simulada (SHAM), o se extirparon dos ovarios y luego se dividieron al azar en 5 subgrupos: tratados por vía oral con vehículo (0,5 por ciento de CMC- Na) como grupo modelo (OVX), valerato de estradiol (1 mg/kg/día) como grupo positivo (EV) y 60, 120 y 240 mg/kg/día de CDP como bajo (CDPL), grupos de dosificación moderada (CDPM) y alta (CDPH), respectivamente. Todas las ratas se administraron por vía oral diariamente y duraron 3 meses con la dosis ajustada cada 2 semanas que dependía del cambio de los pesos corporales totales. En el último día del experimento con animales, se obtuvo orina de 24- horas utilizando jaulas metabólicas; se recogió suero de la arteria femoral de ratas anestesiadas; el fémur derecho, la tibia y todos los órganos fueron disecados y almacenados a -80 grados C para su posterior análisis. Los experimentos con animales que realizamos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Ningxia.

2.5. Determinación de la Densidad Mineral Ósea y Análisis Micro-CT. En primer lugar, se utilizó una máquina de absorciometría de rayos X de energía dual (Lunar, EE. UU.) para estimar la densidad mineral ósea total del fémur derecho de cada rata; en segundo lugar, se utilizó el mismo fémur para estimar la imagen 3D de la microarquitectura del hueso trabecular empleando un aparato de escáner micro-CT (GE, Estados Unidos). La resolución isotrópica se fijó en 14 μm para obtener una imagen 3D ideal; la región de interés (ROI) se eligió estableciendo las mismas coordenadas en la placa de crecimiento del fémur de cada muestra; y los parámetros morfométricos óseos, incluida la separación trabecular (Tb. Sp), el número trabecular (Tb. N), el espesor trabecular (Tb. Th), el contenido mineral óseo (BMC), la densidad mineral tisular (TMD) y el contenido mineral tisular (TMC). ) se obtuvieron analizando el ROI.

2.6. Ensayo bioquímico de suero y orina. Las actividades de catepsina K, TRAP, SOD y GSH en suero, así como los contenidos de PTH en suero, calcitonina, ERR, MDA, BGP y DPD en orina se determinaron empleando los kits de reactivos correspondientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el nivel de La fosfatasa alcalina (FAL) y los contenidos de calcio (Ca) y fósforo (P) en suero y orina se estimaron empleando una máquina automática (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, EE. UU.).

2.7. Análisis de Western Blot. Los osteoclastos se indujeron mediante el uso de células RAW 264.7 añadidas con factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) y RANKL. Brevemente, se cultivaron 1 × 107 células RAW 264.7 en una placa de 6-pocillos en presencia de 30 ng/mL de MCSF y 25 ng/mL de RANKL. Después de 6 días de inducción, las células osteoclásticas maduras se identificaron utilizando el método de tinción TRAP con el kit correspondiente, luego se trataron con CDP (0.1, 0.01 y 0.001 mg/mL , respectivamente) durante 24 h; luego, las células se lisaron con un tampón de lisis que contenía 0,5 mmol de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, inhibidores de proteasa y fosfatasa. Luego, el lisado se separó usando SDS-PAGE al 10 % y se transfirió a una membrana de PVDF, que se sondeó con AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos y -actina (1 : 400) después de bloquear con leche descremada al 5 por ciento durante 2 h. Las mismas membranas fueron despojadas y sondeadas nuevamente con los 9 anticuerpos correspondientes anteriores, respectivamente, luego fueron detectadas por el software Image Lab al final. Los experimentos se repitieron tres veces.

2.8. Análisis estadístico. Todos los datos obtenidos de los experimentos in vivo e in vitro, descritos como la media ± DE, se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett (SPSS 22.0 software, SPSS, EE. UU.); p < 0 05 fue estadísticamente significativo.

2.7. Análisis de Western Blot. Los osteoclastos se indujeron mediante el uso de células RAW 264.7 añadidas con factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) y RANKL. Brevemente, se cultivaron 1 × 107 células RAW 264.7 en una placa de 6-pocillos en presencia de 30 ng/mL de MCSF y 25 ng/mL de RANKL. Después de 6 días de inducción, las células osteoclásticas maduras se identificaron utilizando el método de tinción TRAP con el kit correspondiente, luego se trataron con CDP (0.1, 0.01 y 0.001 mg/mL , respectivamente) durante 24 h; luego, las células se lisaron con un tampón de lisis que contenía 0,5 mmol de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, inhibidores de proteasa y fosfatasa. Luego, el lisado se separó usando SDS-PAGE al 10 % y se transfirió a una membrana de PVDF, que se sondeó con AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos y -actina (1 : 400) después de bloquear con leche descremada al 5 por ciento durante 2 h. Las mismas membranas fueron despojadas y sondeadas nuevamente con los 9 anticuerpos correspondientes anteriores, respectivamente, luego fueron detectadas por el software Image Lab al final. Los experimentos se repitieron tres veces.

2.8. Análisis estadístico. Todos los datos obtenidos de los experimentos in vivo e in vitro, descritos como la media ± DE, se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett (SPSS 22.0 software, SPSS, EE. UU.); p < 0 05 fue estadísticamente significativo.

3. Resultados

3.1. Composición química de CDP. Mediante el uso del método HPLC, se encontraron ocho compuestos glucósidos feniletanoides en esta fracción, como muestra la Figura 1. Mediante el uso de referencias estándar y un método estándar externo, los compuestos y sus contenidos se identificaron y cuantificaron de la siguiente manera: (1) acteósido F (3,6 por ciento), (2) equinacósido (8,8 por ciento), (3) cistanosido A (5).{ {11}} por ciento), (4) actósido (13,3 por ciento), (5) isoactósido (3,3 por ciento), (6) actósido C (3,6 por ciento), (7) 2′-acetilactósido (9,9 por ciento) y (8 ) 6′-acetilacteoside (3.2 por ciento ). El contenido total de estos ocho componentes se cuantificó en 50,7 por ciento.

3.2. Efectos de la CDP sobre la densidad mineral ósea y la microarquitectura de la trabecula. La densidad mineral ósea total de las ratas en diferentes subgrupos se muestra en la Figura 2. Se observó una tendencia decreciente en el contenido de densidad mineral ósea en las ratas del grupo modelo OVX, que disminuyó en casi un 12,0 por ciento después 12 semanas de la operación en comparación con las ratas del grupo SHAM (p < 0 001). Todas las ratas tratadas con CDP exhibieron un aumento significativo de la densidad mineral ósea en un 11,2 %, 12,0 % y 10,7 % (p <0 01), respectivamente, en comparación con las ratas del grupo modelo OVX. .

Además, de acuerdo con los datos de la densidad mineral ósea total, la reconstrucción por micro-CT, así como la determinación histomorfométrica del fémur, mostró que las ratas en el grupo OVX mostraron un deterioro evidente en la arquitectura trabecular evidenciada por el número y el área de trabécula notablemente disminuidos. así como un marcado aumento de Tb. Entonces, cuando se compara con las ratas del grupo SHAM. El tratamiento con CDP evitó el deterioro inducido por OVX en la arquitectura trabecular; como muestra la Figura 3, el BMC, TMC y Tb. Los valores de N aumentaron significativamente y el área de Tb. Sp se redujo notablemente, mientras que los valores de TMD y Tb. No parecían afectados significativamente por la operación OVX y nuestra intervención CDP.

3.3. Efectos de CDP en parámetros bioquímicos de orina y suero. Como muestra la Figura 4, se detectaron tendencias significativas de disminución del nivel urinario de P y el contenido sérico de calcitonina en ratas del grupo modelo OVX, que fue casi un 30 por ciento y un 60 por ciento menor que las ratas SHAM (p < 0 001 ), respectivamente, mientras que no se observaron tendencias obvias de aumento o disminución en los niveles urinarios de Ca y Ca sérico, así como P en suero y PTH en suero entre los grupos OVX y SHAM. El tratamiento con CDP evitó significativamente la pérdida de P y Ca séricos en ratas OVX, evidenciado por los niveles de P y Ca séricos notablemente regulados al alza (p < 0 05) en comparación con las ratas del grupo modelo OVX. Además, se observaron tendencias aumentadas pero no estadísticamente significativas de calcitonina en los grupos de dosis baja y alta de CDP en comparación con el grupo modelo OVX.

3.4. Efectos de la CDP sobre la formación ósea y los marcadores de resorción ósea. Los efectos beneficiosos de la CDP sobre el índice de formación ósea, así como las influencias de inhibición sobre los marcadores de resorción ósea, se describen en la Figura 5. Con respecto a los marcadores de formación ósea, los niveles de BGP sérica casi no se vieron influenciados por la cirugía ovariectomizada evidenciada por cambios no significativos observados en todos los grupos tratados, mientras que se obtuvieron mejoras estadísticamente significativas de la ALP sérica tanto en dosis bajas (60 mg/kg) como moderadas (120 mg/kg) de los grupos de intervención de CDP en comparación con las ratas del grupo SHAM (p < 0 01). Con respecto al índice de resorción ósea, los niveles de catepsina K sérica y DPD, así como TRAP en ratas del grupo modelo OVX aumentaron significativamente en aproximadamente un 75,0 %, 41,4 % y 21,0 %, respectivamente, en comparación con las ratas SHAM, y cuando se trató con CDP, especialmente la dosis baja de 60 mg/kg, las propiedades de la catepsina K y DPD, así como TRAP en el grupo del modelo OVX, se inhibieron notablemente en un 67,3 %, 41,4 % y 25,9 %, respectivamente, en comparación con las ratas en el grupo modelo OVX.

3.5. Efectos de CDP en la vagina y el útero, así como en el peso corporal total. Se observaron diferencias no significativas en los pesos corporales totales iniciales de las ratas antes del tratamiento en seis grupos (Figura 6). Sin embargo, la operación de ovariectomización condujo a un aumento significativo en el peso corporal final de las ratas en el grupo del modelo OVX, que es de casi un 36,0 por ciento, mientras que el peso húmedo del útero y la vagina se redujo drásticamente en casi un 9{{6} }.0 por ciento y 60,0 por ciento, respectivamente, en comparación con las ratas SHAM (p < 0 001). Aunque el contenido de ERR no mostró una diferencia significativa entre los grupos OVX y SHAM, todos los grupos de tratamiento, incluidos CDP y EV, aumentaron significativamente el nivel de ERR. Además, cuando se trató con EV, lo anterior aumentó el peso corporal total, así como la pérdida de peso de la vagina y el útero de las ratas OVX se revirtió parcialmente (p < 0 001) pero no se vio afectado por la intervención de CDP.

3.6. Efectos de CDP en los niveles de suero MDA, SOD y GSH. No hubo diferencias estadísticamente significativas en las propiedades de SOD y GSH en suero entre los grupos modelo SHAM y OVX; como se describe en la Figura 7, se puede observar una tendencia creciente en GSH entre los dos grupos anteriores. Además, el nivel de MDA en suero aumentó considerablemente en casi un 50 por ciento en las ratas del grupo modelo OVX en comparación con las ratas SHAM. La actividad de SOD no se vio afectada por el tratamiento con CDP, mientras que la propiedad de GSH mejoró significativamente con la intervención de CDP, y CDP disminuyó notablemente el nivel de MDA en un 33,9 % y un 42,4 % a las dosis de 60 y 240 mg/kg, respectivamente ( pag < 0 001).

3.7. Efectos de CDP en los niveles de expresión de proteínas. Nuestros datos, que se muestran en la Figura 8, sugirieron que el tratamiento con CDP disminuyó significativamente los niveles de proteína de TRAF6, RANK y RANKL en comparación con el control. Las vías de señal aguas abajo, incluida la supresión de NF-κB, y la intervención de CDP estimularon PI3K/AKT, evidenciado por la expresión de la regulación negativa de NF-κB-p65, mientras que PI3Kp85 y AKT1 se regularon positivamente. En consecuencia, la expresión de NFAT2 disminuyó significativamente y la cFos aumentó después del tratamiento con CDP a una concentración de 0,001-0,1 mg/mL. Un mecanismo sugerido se describe en la Figura 9, donde CDP reguló a la baja los niveles de RANKL y RANK, lo que llevó a la reducción de las cantidades de unión de este ligando con su receptor, y la conexión de RANKL con RANK se redujo aún más por la regulación a la baja de TRAF6, seguido de la supresión de las vías aguas abajo, incluida la vía NF-κB, mientras que se estimuló la vía de la señal PI3K/AKT, lo que finalmente condujo a la disminución de la expresión de NFAT2 y al aumento del nivel de c-Fos.

4. Discusión

Los glucósidos feniletanoides son componentes solubles en agua que existen de forma natural en el reino de las plantas medicinales [11]. Hasta el momento, los compuestos de glucósidos de feniletanoide han atraído a más y más investigadores debido a su papel evidente en el manejo de diversas dolencias y anomalías humanas [13]. Se identificaron y aislaron varias fracciones y compuestos bioactivos antiosteoporóticos, incluidos polifenoles y glucósidos feniletanoides, de docenas de hierbas medicinales naturales [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola es conocida como el "ginseng del desierto", lo que implica el perfil de seguridad de esta medicina tradicional china comestible [18, 19]. Como hierba tónica general y alimento saludable natural que se ha utilizado durante mucho tiempo en los países asiáticos, C. deserticola exhibió una función beneficiosa para mejorar la fuerza de los riñones.

Se encontró que la MTC, tradicionalmente usada para vigorizar y mantener la esencia del riñón, se usaba generalmente para tratar la osteoporosis, tanto in vitro como in vivo, los datos publicados habían demostrado la actividad antiosteoporótica de C. deserticola [20–23], y los constituyentes de glicósido feniletanoide, incluidos el equinacósido y el acteósido, son los principales componentes bioactivos que existen en esta planta medicinal comestible; todo lo cual sugería que no solo el echinacósido y el acteosido en sí mismos, sino también otros componentes glucósidos feniletanoides contenidos en C. deserticola se consideraban responsables de la propiedad antiosteoporótica de esta hierba. En nuestro presente estudio, se utilizó una resina macroporosa de seguridad favorable para aislar y enriquecer la fracción de glucósido feniletanoide de C. deserticola y, mediante el método de HPLC, ocho componentes principales de glucósido feniletanoide, a saber, acteoside F, echinacoside, cistanoside A, acteoside, Se encontraron isoactósido, actósido C, 2′-acetilactósido y 6′-acetilactósido en la fracción de glucósido feniletanoide aislado, y los contenidos fueron 3,6 %, 8,8 %, 5,0 %, 13,3 %, 3,3 %, 3,6 %, 9,9 %, y 3,2 por ciento, respectivamente. Se ha demostrado que el echinacósido, uno de los principales compuestos de actividad registrados en C. deserticola [14], posee actividad antiosteoporótica; sin embargo, la dosis de 270 mg/kg fue tan alta que limitó su aplicación clínica posterior [24]. En los experimentos actuales, la fracción de glucósido de feniletanoide total con una dosis más baja de 60-240 mg/kg de peso corporal/día se usó en ratas OVX, y el contenido de los constituyentes identificados fue casi un 50 por ciento puro en esta fracción usando el método HPLC.

Era bien sabido que OVX puede causar osteoporosis, y se creía que una rata OVX era un modelo clásico y adecuado para simular la osteoporosis posmenopáusica humana. Al mismo tiempo, se observó una disminución significativa en la densidad mineral ósea, la microarquitectura del hueso trabecular, los pesos húmedos del útero y la vagina y el nivel de estrógeno, así como una mejora evidente en la reabsorción ósea y el peso corporal después de la cirugía de ovariectomía, de los cuales fueron en en parte debido a la pérdida de estrógenos [25]. Nuestros datos, hasta el momento, demostraron claramente que OVX de hecho indujo osteoporosis posmenopáusica y siempre se acompaña de una fuerte disminución de la calidad ósea, la microarquitectura ósea y los pesos húmedos del útero y la vagina. Como EV es un agente de reemplazo hormonal general que se ha usado en la práctica clínica, se usó como control positivo en nuestro experimento in vivo, y el aumento de peso corporal y el peso del útero atrofiado, así como el deterioro de la densidad mineral ósea y la microarquitectura del hueso trabecular. se espera que se revierta con la suplementación con EV.

A diferencia del control positivo, la disminución del peso de la vagina y el útero, así como la ganancia de peso corporal total de las ratas en el grupo modelo OVX no se vieron afectados por el tratamiento con CDP, lo que implica que la CDP podría mejorar la formación ósea sin inducir los efectos secundarios en el cuerpo y tejidos orgánicos uterinos. Aunque los niveles de ERR aumentaron significativamente con el tratamiento con CDP, fue como un efecto de fitoestrógenos en el sentido de que no se observaron efectos secundarios en los tejidos orgánicos del útero y la vagina. Además, el tratamiento de CDP fortaleció significativamente la calidad del hueso en ratas OVX que se había deteriorado por la cirugía de ovariectomía.

Además, los niveles de P y Ca en la orina y el suero de ratas OVX también se utilizaron para reflejar el efecto antiosteoporótico, y las concentraciones de Ca y P inorgánico generalmente dependían de los niveles de calcitonina y PTH [26]. En el presente estudio, aunque no se obtuvieron tendencias significativas decrecientes o crecientes en el nivel de excreción urinaria de Ca, P sérico, Ca sérico y PTH en ratas del grupo modelo OVX, los niveles urinarios significativos de P y calcitonina (p < { {1}}) fueron observados. De acuerdo con los datos publicados de que la deficiencia de estrógenos causada por la cirugía de ovariectomía siempre condujo a una disminución del nivel de calcitonina en la sangre, esta disminución de la calcitonina sérica finalmente condujo a un aumento del nivel de PTH, donde se creía que el Ca era el principal regulador de la secreción de PTH. Debido a que la concentración de PTH no mostró diferencias significativas entre los grupos OVX y SHAM en el presente estudio, el nivel de Ca tanto en suero como en orina tampoco mostró cambios evidentes entre los dos grupos anteriores.

Sin embargo, se obtuvo una tendencia significativamente decreciente en el nivel de calcitonina entre los grupos OVX y SHAM y, en consecuencia, el contenido de P en la orina de OVX disminuyó significativamente. Creemos que los datos anteriores pueden explicar el fenómeno contradictorio de por qué la excreción urinaria del nivel de Ca en ratas OVX no mostró cambios evidentes en comparación con las ratas SHAM, y este fenómeno también puede estar relacionado con el aumento de la tasa de recambio óseo [27]. . Después del tratamiento con CDP, los niveles de P y Ca en el suero aumentaron notablemente, y el contenido de P en la orina disminuyó en ratas OVX, lo que refleja que la CDP no solo puede prevenir la excreción de elementos minerales óseos sino que también mejora el contenido sérico de esas ratas. elementos, suprimiendo así indirectamente la pérdida ósea.

Además, los marcadores de formación y resorción ósea, así como las enzimas antioxidantes, incluidas SOD y GSH, también se emplearon para explicar los mecanismos antiosteoporóticos subyacentes de la CDP. De manera similar a los datos publicados, el nivel de ALP en ratas del grupo modelo OVX exhibió una tendencia creciente no estadísticamente significativa que indica una tasa acelerada de recambio óseo en la osteoporosis posmenopáusica [10]. Sin embargo, después del tratamiento con CDP (60, 120 y 240 mg/kg/día), la propiedad de ALP mejoró significativamente. Era bien sabido que OVX causaba una fuerte disminución de los niveles de estrógeno que generalmente conduce a una reabsorción ósea y estrés oxidativo excedidos [28], evidenciado por los niveles de TRAP, catepsina K y DPD, así como MDA notablemente regulados al alza en ratas del Grupo modelo OVX.

Sin embargo, esos deterioros mejoraron en parte con la intervención de CDP. Además, el tratamiento de ratas OVX con CDP (60 y 240 mg/kg) demostró un aumento significativo en la actividad de GSH (p < 0 05). Los resultados anteriores implicaban que la CDP exhibió un efecto terapéutico sobre la osteoporosis inducida por OVX, y estos efectos fueron tanto al mejorar la formación ósea y suprimir la reabsorción ósea como al mejorar el sistema antioxidante óseo.

La activación de RANK por su ligando RANKL estimuló las expresiones de NFAT2 y c-Fos a través de la señalización de PI3K/AKT y NF-κB [29]. Se demostró que NF-κB es esencial para la osteoclastogénesis, ya que la interrupción de NF-κB podría conducir a una diferenciación de osteoclastos alterada con un fenotipo osteoporótico, y NF-κB regulaba al alza las expresiones de c-Fos y NFAT2 reguladas a la baja durante la osteoclastogénesis inducida por RANKL/RANK/TRAF. Para estimar la influencia beneficiosa de CDP en NFAT2 y osteoclastogénesis mediada por c-Fos, se analizaron los niveles de expresión de RANKL y RANK. Como era de esperar, CDP inhibió significativamente NFAT2 y estimuló los niveles de c-Fos al regular a la baja las expresiones de RANKL y RANK.

Mientras tanto, RANK en sí mismo carecía de la propiedad intrínseca de la quinasa a menos que se uniera a TRAF6 para activar la señalización posterior [3]. CDP también reguló a la baja la expresión de TRAF6, lo que llevó a que las cantidades de unión de RANKL y RANK se redujeran significativamente. Un mecanismo antiosteoporótico hipotético de CDP en ratas OVX cubría las vías de señalización anteriores, y los reguladores se describieron en la Figura 9. De manera concisa, CDP disminuyó los niveles de TRAF6, RANKL y RANK, suprimiendo así las vías de señalización aguas abajo, incluidas PI3K/AKT y NF-κB que son desencadenados por RANKL/RANK, y finalmente reducen las expresiones y actividades de las proteínas osteoclastogénicas clave NFAT2 y c-Fos. Por lo tanto, múltiples pistas de datos implicaron el efecto beneficioso de CDP en el metabolismo óseo de ratas OVX principalmente a través de las vías PI3K/AKT y NF-κB mediadas por RANKL/RANK/TRAF6-.

5. Conclusión

En resumen, los glucósidos feniletanoides totales, aislados de C. deserticola, exhibieron efectos beneficiosos significativos sobre la osteoporosis posmenopáusica de ratas OVX, y el potencial terapéutico en la supresión de la pérdida ósea se debió principalmente a la estimulación de la formación ósea y la inhibición de la resorción ósea, así como a la mejora del antioxidante óseo. sistema; los mecanismos pueden estar relacionados con la activación de NF-κB inducida por RANKL/RANK/TRAF6-y la inactivación de PI3K/AKT, así como la estimulación de c-Fos y la supresión de NFAT2 y, finalmente, se inhibió la diferenciación de osteoclastos.

abreviaturas

AKT: proteína quinasa B

ALP: Fosfatasa alcalina

BGP: gla-proteína ósea

BMC: contenido mineral óseo

CDP: fracción de glucósido feniletanoide de C. deserticola

CK: catepsina K

CT: Calcitonina

DPD: Desoxipiridinolina

ERR : Receptor alfa relacionado con el estrógeno

EV: valerato de estradiol

GSH: Glutatión

l-PTH: parathormona intacta

MCSF: factor estimulante de colonias de macrófagos

MDA: malondialdehído

NFAT2: Factor nuclear de células T activadas c2

NF-κB: factor nuclear kappa B

OPG: Osteoprotegerina

OVX: Ovariectomizada

PhG: glucósidos feniletanoides

PI3K: Fosfoinositido 3-quinasa

RANGO: Activador del receptor del factor nuclear kappa B

RANKL: Ligando activador del receptor del factor nuclear kappa B

ROI: Región de interés

SOD: superóxido dismutasa

Tuberculosis. N: número trabecular

Tb.Sp: Separación trabecular

Tb.Th: Grosor trabecular

MTC: medicina tradicional china

TMC: Contenido de minerales tisulares

DTM: Densidad mineral tisular

TNF: factor de necrosis tumoral

TRAF6: factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral

TRAP: Fosfatasa ácida tartrato resistente.

Disponibilidad de datos

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

Conflictos de interés

Los autores no tuvieron ningún conflicto de intereses.

Contribuciones de los autores

XM diseñó y supervisó los experimentos; SD y LY realizaron la mayoría de los experimentos y redactaron el manuscrito; BZ y JL realizaron el análisis de transferencia Western y participaron en experimentos con animales; YD analizó los datos; QT y PY revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito. Lingling Yang y Shuqin Ding contribuyeron igualmente al manuscrito.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Tecnología Científica de Educación Superior de Ningxia (NGY2017090), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81560684), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2018BHF2001), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia Programa de Invenciones de Cooperación Científica y Tecnológica de Oriente y Occidente (Nos. 2017BY084 y 2017BY079), y la Fundación West Light de la Academia China de Ciencias-Jóvenes Científicos de Occidente 2017.

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