Efectos beneficiosos de la fracción de glucósido feniletanoide total aislada de Cistanche Deserticola sobre la microestructura ósea en ratas ovariectomizadas Ⅰ

El presente estudio fue diseñado para estimar la actividad antiosteoporótica de la fracción total de glucósidos feniletanoides aislados deC. deserticola(CDP) en ratas inducida por ovariectomía (OVX), así como los mecanismos relacionados. Después de 3 meses de administración oral, eldisminución de la densidad mineral ósea, Ca y P séricos en ratas OVX y se recuperaron los niveles trabeculares deteriorados.microarquitectura óseamejoró parcialmente con la intervención de CDP (60, 120 y 240 mg/kg), las actividades de los marcadores de resorción ósea se regularon a la baja y el bioactivo del índice de formación ósea se reguló al alza; mientras tanto, el contenido de MDA disminuyó y el GSH aumentó con el tratamiento con CDP. Desde el punto de vista de la composición, se identificaron 8 compuestos de glucósidos feniletanoides.Fied en CDP, con el contenido total cuantificadoFied como 50,3% usando el método HPLC. Mecánicamente, CDP disminuyó los niveles de TRAF6, RANKL y RANK, suprimiendo así la activación inducida por RANKL/RANK/TRAF6-de NF-κB y PI3K/AKT y, en última instancia, previenen las actividades de las proteínas osteoclastogénicas clave de NFAT2 y c-Fos. Todos los datos anteriores implicaron que CDP exhibió beneficiosFicial efefectos sobre la microestructura ósea en ratas ovariectomizadas, y estos efects pueden estar relacionados con la NF-κB y PI3K/AKT vías de señalización que fueron desencadenadas por la unión de RANKL, RANK y TRAF6.

CISTANZA ORGÁNICA NATURAL PARA EL CRECIMIENTO ÓSEO

1. Introducción

La osteoporosis posmenopáusica, que padece 1 de cada 3 mujeres mayores de 50 años, se está convirtiendo en un importante peligro para la salud que afecta a más de 200 millones de mujeres en todo el mundo [1]. En la menopausia, la fuerte disminución del nivel de estrógeno suele provocar una resorción ósea excesiva causada por una mayor osteoclastogénesis; entonces, el equilibrio entre la formación ósea inducida por osteoblastos y la formación ósea inducida por osteoclastosResorción ósease altera y la resorción ósea acelerada finalmente causa osteoporosis e incluso fractura de cadera o columna [2]. Se creía que la diferenciación del osteoclasto se desencadenaba cuando el receptor activador del factor nuclear kappa B (RANK) se unía a RANKL, el ligando de RANK. Sin embargo, la combinación de RANK con RANKL no se puede activar a menos que se una la proteína factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF6) [3], seguido de la estimulación de las vías de señalización posteriores, incluidas PI3K/AKT y NF-κB. . Finalmente, se regularon las expresiones del factor nuclear de las células T activadas c2 (NFAT2) y c-Fos [4] para modular la diferenciación de los osteoclastos así como la resorción ósea. Por lo tanto, se creía que los factores y reguladores que están directa o indirectamente relacionados con la activación y diferenciación de los osteoclastos eran objetivos cruciales para prevenir la pérdida ósea.

De hecho, existen algunos fármacos de terapia de reemplazo hormonal clínicos y sintéticos, como el valerato de estradiol, que son eficaces en el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Desafortunadamente, algunos de ellos aumentaron el riesgo de cánceres graves, incluidos los de mama y de endometrio [5], lo que limitó sus aplicaciones clínicas. Por tanto, es necesario seleccionar otras alternativas con eficacia y mínimos efectos secundarios. Las medicinas tradicionales chinas (MTC), así como los compuestos bioactivos aislados y sus fracciones [6–9], demostraron ser eficaces en diversas dolencias, incluida la osteoporosis posmenopáusica. Entre estos componentes y fracciones bioactivos, se creía que los compuestos de glucósidos feniletanoides (PhG) con eficacia potencial eran agentes prometedores para el tratamiento de la osteoporosis [10-12]. Las estructuras de los PhG consisten en una aglicona del ácido cinámico, un grupo hidroxifeniletilo que se combina con -glucopiranosa, apiosa, galactosa, ramnosa o xilosa mediante un enlace glicosídico. Existen ampliamente en especies medicinales del género Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma es una medicina tradicional china oficial registrada en la farmacopea china y, además de ser una medicina tradicional china importante [14], C deserticola también es una hierba tónica antienvejecimiento con pocos efectos secundarios que se ha convertido en licor medicinal y líquido nutricional aprobado por la Administración Estatal de Alimentos y Medicamentos. Según el registro de la farmacopea china, los nativos habían utilizado tradicionalmente C. deserticola para tratar problemas de deficiencia de esencia renal, como debilidad muscular y debilidad lumbar, y los compuestos de glucósidos feniletanoides, incluidos el equinacósido y el acetónido, son los principales componentes bioactivos de esta hierba. Según la teoría de la MTC de "riñón-gobierno-hueso", el sistema óseo está gobernado por la esencia del riñón [15], y los problemas relacionados con los huesos, como la osteoporosis, podrían curarse con hierbas o compuestos que posean la actividad de nutrir la esencia del riñón. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la fracción total de glucósidos feniletanoides aislada de C. deserticola, al menos en parte, fue beneficiosa en el tratamiento de la osteoporosis. Por lo tanto, el experimento actual se ideó para validar nuestra hipótesis utilizando un modelo de rata ovariectomizada (OVX); Además de los marcadores de resorción y formación ósea que deben estimarse, también se emplearon el índice de antioxidación y las vías de señalización PI3K/AKT y NF-κB inducidas por RANKL/RANK/TRAF6- para investigar los principales mecanismos de la bioactividad antiosteoporótica. .

2. Materiales y Método

2.1. Materiales y Preparación Vegetal.

Se recolectaron un total de 30 kg de tallos de Cistanche deserticola YC Ma en el condado de Yongning el 2015 de septiembre con las coordenadas 106.026597 y 38.262816. Provincia de Ningxia, China. La hierba fue identificada por el Dr. Lin Dong (Departamento de Farmacognosia, Universidad Médica de Ningxia) y una muestra correspondiente (#20150901) se conservó en el Departamento. de Análisis Farmacéutico. En primer lugar, se extrajeron 30.0 kg de C. deserticola en polvo mediante el método de reflujo con etanol al 70% como solvente; la proporción de material a disolvente se estableció en 1:10 y el tiempo de reflujo fue de 2 h durante 3 veces. Luego, todos los filtrados se combinaron y se condensaron a presión reducida a 60 grados C. En segundo lugar, se usaron columnas de resina macroporosa AB-8 para la separación preliminar y diferentes proporciones de etanol en agua (0%, 20%, 30 %, 40 %, 50 % y 60 %, cada 60 l) se emplearon para eluir. En tercer lugar, los eluyentes al 40% y al 50% se combinaron y purificaron adicionalmente mediante el uso repetido de columnas de resina macroporosa AB-8 con los eluyentes de etanol al 0%, 20%, 30%, 40% y 50% en agua, y cada eluyente fue de 12 L. Finalmente, la fracción del 40 % se recogió y se condensó a presión reducida para obtener 150 g de fracción de glicósido feniletanoide de sedimento amarillo pálido de C. deserticola (CDP, el rendimiento fue del 0,5 %). Para experimentos in vivo, se empleó disolvente CMC-Na al 0,5% para disolver CDP; la administración oral a animales se fijó en 1 mL/100 g de peso corporal; para el análisis de transferencia Western in vitro, el CDP se disolvió con DMSO y luego se diluyó con DMEM para obtener las concentraciones finales de 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml y 0,001 mg/ml.

2.2. Productos químicos y disolventes.

El valerato de estradiol (EV) era de Delpharm Lille SAS, Francia; fosfatasa alcalina (ALP),proteína gla ósea(BGP), fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y kits ELISA de reticulación de desoxipiridinolina (DPD) de Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China, 201605; kits de reactivos de malondialdehído (MDA, 20181221), superóxido dismutasa (SOD, 20121218) y glutatión (GSH, 20181221) del Instituto de Ingeniería Biológica Jiancheng de Nanjing, Nanjing, China; Kits ELISA de reticulación de parathormona intacta (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonina (2L9ISN7AIU) y receptor alfa relacionado con estrógeno (ERR, Y3AY8QEWB3) de Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, China; kit de reactivos ELISA de catepsina K de BioVision, America, 1l300141; anticuerpos primarios de RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 quinasa p85 alfa (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -actina (17AV0411) y anticuerpos secundarios de IgG anticonejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante de ZSGB-BIO, China, 136080; kit de ensayo de proteína BCA total y el kit comercial para la detección de formación de osteoclastos y suero fetal bovino y medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) de HyClone, Logan, UT, EE. UU.; membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de Millipore Life Sciences, Billerica, MA, EE. UU.; penicilina y estreptomicina de Gibco, Rockville, MD, EE. UU. Todos los demás agentes químicos utilizados fueron de grado AR.

2.3. Cuantificación por HPLC de CDP.

Se empleó un instrumento de HPLC Agilent 1220 para identificar y cuantificar la composición de CDP. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: columna C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); la elución en gradiente contenía los disolventes A (acetonitrilo) y B (agua que contiene 0,5 % de ácido acético) (0-10 min: 17-20 % A; 10-30 min: 20-25 % A; y 30-40 mín: 25-30%A); la longitud de onda de detección fue de 333 nm; temperatura ambiente; el caudal fue de 1,0 ml/min; El volumen de inyección de la muestra fue de 5 μL. Se identificaron ocho compuestos de PhG, a saber, cistanósido F, echinacósido, 6′-acetilactósido, cistanósido C, cistanósido A, acteósido, 2′-acetilactósido e isoactósido; Utilizando las sustancias de referencia correspondientes y un método estándar externo, se cuantificaron los contenidos de los 8 PhG anteriores mediante análisis HPLC (Figura 1).

Figura 1: Huella digital HPLC de CDP. En esta fracción se encontraron ocho compuestos glicósidos feniletanoides y el contenido total se cuantificó en 50.7%. Los compuestos y sus contenidos fueron los siguientes: (1) acteósido F (3,6%), (2) equinacósido (8,8%), (3) cistanósido A (5,0%), (4) acteósido (13,3%), (5) isoacteosido (3,3%), (6) acteosido C (3,6%), (7) 2′-acetilacteosido (9,9%) y (8) 6′-acetilacteosido (3,2%).

2.4. Protocolo de experimentación con animales.

Se seleccionaron un total de 60 ratas Sprague-Dawley hembras adultas de 3 meses de edad del centro de pruebas con animales de la Universidad Médica de Ningxia, con un peso corporal inicial promedio de aproximadamente 234 ± 25 g. Las ratas se alojaron en un entorno estándar libre de patógenos específicos destinado a aclimatarse durante 1 semana. Luego, todas las ratas fueron anestesiadas (hidrato de cloral, 100 mg/kg, ip) únicamente o se les realizó una ovariectomización simulada (SHAM), o se extirparon dos ovarios y luego se dividieron aleatoriamente en 5 subgrupos: tratados por vía oral con vehículo (0,5% CMC- Na) se estableció como grupo modelo (OVX), valerato de estradiol (1 mg/kg/día) como grupo positivo (EV) y 60, 120 y 240 mg/kg/día de CDP como bajo (CDPL). grupos de dosis moderada (CDPM) y alta (CDPH), respectivamente. A todas las ratas se les administró por vía oral diariamente y duró 3 meses con la dosis ajustada cada 2 semanas, lo que dependió del cambio de peso corporal total. El último día del experimento con animales, se obtuvo orina de 24-horas utilizando jaulas metabólicas; se recogió suero de la arteria femoral de ratas anestesiadas; el fémur derecho, la tibia y todos los órganos se diseccionaron y almacenaron a -80 grados C para su posterior análisis. Los experimentos con animales que realizamos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica de Ningxia.

2.5. Determinación de la densidad mineral ósea y análisis por micro-CT.

En primer lugar, se utilizó una máquina de absorciometría de rayos X de energía dual (Lunar, EE. UU.) para estimar la densidad mineral ósea total del fémur derecho de cada rata; en segundo lugar, se utilizó el mismo fémur para estimar la imagen tridimensional de la microarquitectura del hueso trabecular empleando un aparato de escáner micro-CT (GE, Estados Unidos). La resolución isotrópica se estableció en 14 μm para obtener una imagen 3D ideal; la región de interés (ROI) se eligió estableciendo las mismas coordenadas en la placa de crecimiento del fémur de cada muestra; y los parámetros morfométricos óseos, incluida la separación trabecular (Tb.Sp), el número trabecular (Tb.N), el espesor trabecular (Tb. Th), el contenido mineral óseo (BMC), la densidad mineral tisular (TMD) y el contenido mineral tisular (TMC). ) se obtuvieron analizando el ROI.

2.6. Ensayo bioquímico en suero y orina.

Las actividades de catepsina K sérica, TRAP, SOD y GSH, así como los contenidos de PTH sérica, calcitonina, ERR, MDA, BGP y DPD en orina, se determinaron empleando los kits de reactivos correspondientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el El nivel de fosfatasa alcalina (ALP) y el contenido de calcio (Ca) y fósforo (P) en suero y orina se estimaron empleando una máquina automática (Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp., Oberlin, OH, EE. UU.).

2.7. Análisis de Western Blot.

Los osteoclastos se indujeron utilizando células RAW 264.7 a las que se les añadió factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) y RANKL. Brevemente, se cultivaron 1 × 107 células RAW 264.7 en una placa 6-pocillos en presencia de 30 ng/ml de MCSF y 25 ng/ml de RANKL. Después de 6 días de inducción, las células de osteoclastos madurados se identificaron mediante el método teñido con TRAP con el kit correspondiente, luego se trataron con CDP (0.1, 0.01 y 0,001 mg/mL). , respectivamente) durante 24 h; luego, las células se lisaron con un tampón de lisis que contenía 0,5 mmol de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, inhibidores de proteasa y fosfatasa. Luego, el lisado se separó utilizando SDS-PAGE al 10% y se transfirió a una membrana de PVDF, que se sondeó con AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos y -actina ( 1: 400) después de bloquear con leche descremada al 5% durante 2 h. Las mismas membranas se quitaron y se sondaron nuevamente con los 9 anticuerpos correspondientes anteriores, respectivamente, y luego fueron detectadas por el software Image Lab al final. Los experimentos se repitieron tres veces.

2.8. Análisis estadístico.

Todos los datos obtenidos de experimentos in vivo e in vitro, descritos como la media ± DE, se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett (software SPSS 22.0, SPSS, EE. UU.); p < 0 05 fue estadísticamente significativo.

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