Dihidroflavonas Benciladas Y Alcaloides Derivados De Isoquinolina De La Corteza De Diclinanona Calycina (Annonaceae) Y Sus Citotoxicidades

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Resumen: Diclinanona calycina RE Fries conocida popularmente como "enviro", es una especie de la familia Annonaceae endémica de Brasil. En nuestra búsqueda continua de compuestos bioactivos de las plantas amazónicas Annonaceae, se investigó la corteza de D.calycina mediante técnicas de cromatografía clásicas que arrojaron trece compuestos (alcaloides y flavonoides) descritos por primera vez en D. calycina, así como en el género Diclinanona. La estructura de estos compuestos aislados se estableció mediante un extenso análisis utilizando espectroscopia 1D/2D-NMR en combinación con MS. Los alcaloides aislados se identificaron como pertenecientes a las subclases: isoquinolina simple, thali online (1); aporfina, anonaína (2); oxoaporfina, liriodenina (3); benciltetrahidroisoquinolinas, (S)-( más )-reticulina(4); dehidro-oxonorreticulina (3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinilo)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanona)(5 );( más )-1S,2R-reticulina Ng-óxido (6); y ( más )-1S,2S-reticulina N-óxido (7); tetrahidroprotoberberina, coreximina(8); y pavina, bisnorargemonina (9). Mientras que laflavonoidespertenecen a los benciladosdihidroflavonas, isorhamnetina (10), dichamanetina (11) y una mezcla de uvarinol (12) e isouvarinol (13). El compuesto 5 se describe por primera vez en la literatura como un producto natural. Se evaluó la actividad citotóxica de los principales compuestos aislados frente a líneas celulares cancerosas y no cancerosas. Entre los compuestos probados, los resultados más prometedores se encontraron para las dihidroflavonas benciladas dichamanetina (10), y la mezcla de uvarinol (12) e isouvarinol (13), que presentaron actividad citotóxica moderada frente a los compuestos probados.célula cancerosalíneas(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetina (11) mostró actividad citotóxica frente a HL-60 y HCT116 con valores de IC50 de 15,78 ug·mL-I(33,70 umol·LI) y 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, respectivamente, mientras que la mezcla de uvarinol（12） e isouvarinol (13) demostró actividad citotóxica contra HL-60, con un valor de IC5 de 9.74 ugs.mL-1, y HCT116, con un IC50 valor de 17,31 ug. mL-I. Estas actividades citotóxicas se pueden atribuir a la presencia de uno o más grupos hidroxibencilo presentes en estas moléculas, así como a la posición en la que se unen estos grupos. Las actividades citotóxicas de reticulina, anonaína y liriodenina se han establecido previamente, siendo la liriodenina el compuesto más potente.

Palabras clave: Diclinanona calycina; alcaloides y dihidroflavonas benciladas; actividad citotóxica

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1. Introducción

Annonaceae es una gran familia de árboles y arbustos tropicales y subtropicales, que comprende alrededor de 112 géneros y 2440 especies [1]. Varias especies son conocidas por sus frutos comestibles y sus propiedades medicinales ]2]. La investigación fitoquímica previa con algunas especies de Annonaceae condujo al aislamiento y caracterización de diferentes clases de metabolitos secundarios, tales como monoterpenos, diterpenos, triterpenos, lignanos,flavonoides, fenilpropanoides derivados de la asarona, acetogeninas y, principalmente, alcaloides típicos derivados de la isoquinolina [3-7]. Algunos de estos metabolitos secundarios aislados de especies de Annonaceae exhibieron importantes actividades biológicas, como propiedades antiinflamatorias e inhibidoras de la ureasa [8,9], tripanocidas [10,11], leishmanicidas [11,12], antipalúdicos [4,13] , antimicrobiana [4,14,15], antioxidante y antirreumática [9,15] y, en particular, actividad citotóxica frente a diferentes líneas celulares tumorales humanas [4,6,11,16-21].

Aunque la familia Annonaceae se considera una familia primitiva y bien estudiada, se han realizado pocos estudios fitoquímicos y/o farmacológicos con sus especies[3]. Los estudios fitoquímicos y/o farmacológicos se han centrado principalmente en especies de los géneros Annona, Asimina y Cananga, por su gran importancia económica, y en algunas especies de los géneros Duguetia, Guatteria y Xylopia[5]. A pesar del gran crecimiento de los últimos 20 años en relación a los estudios fitoquímicos y farmacológicos, el número de especies investigadas es aún muy pequeño en relación a la gran cantidad de especies reconocidas. Actualmente, según las bases de datos científicas Web of Science, Scopus y SciFinder, solo alrededor del 15 por ciento de las especies de Annonaceae descritas tienen algún estudio fitoquímico y/o farmacológico correspondiente.

Entre las especies poco estudiadas se encuentran las pertenecientes al género Diclinanona Diels. Este género pertenece a la tribu Annoneae, de la subfamilia Annonoideae, y se presenta únicamente en América del Sur tropical (principalmente en la región amazónica). Es un género que consta de solo tres especies, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas y Diclinanona tessmannii Diels, que se presentan como árboles [22-24].D.calycina (sinónimo Xulopia calycina Diels) es un 8 a Árbol de 30 m de altura, conocido popularmente como "envireira" y "enviro", distribuido en la cuenca amazónica de Brasil, Perú y Venezuela [23]. D.calycina es superficialmente similar a Xylopia por sus flores con pétalos alargados y angostos, pero se diferencia por sus monocarpos leñosos, indehiscentes, globosos y de paredes gruesas [23,24].

Estudios previos con D. calycina reportan solo estudios farmacológicos. El primer estudio describe la investigación de la actividad antimicrobiana de los extractos metanólico, cloroformo y acuoso contra los microorganismos Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus y Candida albicans utilizando el método de difusión en gel [25]. El segundo reporta la investigación de la actividad antimicrobiana de extractos orgánicos (diclorometano:metanol 1:1) y acuosos contra el microorganismo Enterococcus faecalis utilizando el ensayo de caldo de microdilución (MDBA) y ensayo de difusión en disco (DDA)[26]. Por lo tanto, en nuestra búsqueda continua de nuevos productos naturales bioactivos de Annonaceae de la selva amazónica, este estudio tuvo como objetivo investigar las propiedades fitoquímicas y farmacológicas de la corteza de D.calycina. En este informe, trece compuestos (nueve alcaloides y cuatro benciladosdihidroflavonas) fueron aislados e identificados por primera vez en D.calycina, así como en el género Diclinanona. Además, se investigó la citotoxicidad de los principales compuestos frente a B16-F10, HepG2, K562 y HL{{ 4}} líneas de células tumorales utilizando el ensayo Alamar blue.

2. Resultados y Discusión

2.1.Elucidación estructural de los compuestos

Una vez descubierta la presencia de compuestos nitrogenados en el extracto metanólico mediante el reactivo de Dragendorff, se sometió a un tratamiento ácido-base según la metodología de Costa et al. [12] resultando en fracciones alcaloidales y neutras. Se observó una alta concentración de compuestos nitrogenados en la fracción alcaloidal que se sometió al análisis cromatográfico. Las sucesivas separaciones cromatográficas, como se describe en la sección de Extracción y Aislamiento, condujeron al aislamiento e identificación de trece constituyentes químicos (1-13, Figura 1), nueve alcaloides derivados de isoquinolina 1-9 y cuatro dihidroflavonas benciladas 10-13. Las estructuras de estos compuestos aislados (Figura 1) se establecieron mediante un análisis exhaustivo utilizando espectroscopía de RMN 1D y 2D en combinación con MS (datos complementarios), así como la comparación con datos de la literatura.

El compuesto 5 se obtuvo como un polvo amorfo marrón y resultó positivo para el reactivo de Dragendorff. Mostró una molécula protonada en m/z328 [M más H]' en el LR-ESI( más )MS compatible con la fórmula molecular C18H1NO5. Los espectros de 'H y 13C-NMR de 5 (Tabla 1) fueron consistentes con los de la reticulina (4) [27, excepto por la ausencia del grupo metilo unido al nitrógeno (CH3-N) y la señal de el grupo metino en la posición 1, que fue reemplazado por una señal en δc 165,1 en el espectro de 13C-NMR típico del grupo imina conjugado con un grupo carbonilo en bc 192,8. En el espectro 'H-NMR, tres hidrógenos campo abajo en δH 6,88（1H,d, J=8,4 Hz, H-5'）,5H7,57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）y δH 7.60（1H, dd, J=8.4 y 2.0 Hz, H-6'） , reveló la presencia de un sistema de acoplamiento ABX. Dos señales singlete en 6H 6.90(1H,s, H-8) y 6.71(1H, s, H-5) indicaron la presencia del anillo de fenilo 1,2,4,5-tetrasustituido. Además, el espectro H-NMR de 5 también mostró señales para dos grupos metoxi que resuenan en bH 3.93 (3H, s) y 6H 3.95 (3H, s), y señales para dos grupos metileno que resuenan en δμ 2.79 (2H, t, J=7.8 Hz） y 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Hz), atribuidos a H-4 y H-3, respectivamente (Tabla 1) . Estos datos indicaron que el alcaloide 5 tiene un esqueleto de benciltetrahidroisoquinolina [28-30].

Estos grupos se establecieron en base al mapa de correlación 'H-13C de dos y tres enlaces del experimento HMBC-NMR (Figura 2 y Tabla 1). Este análisis reveló que el hidrógeno en δH 3.89 （H-3）mostraba una correlación 'H-13C de tres bandas con los carbonos en 6c130.1（4a） y δc165.{ {42}}（C-1）y correlación de lH-13C de dos enlaces con el carbono en δc 25.4(C-4), lo que confirma la presencia del grupo imina en la molécula. Por otro lado, las señales en δH 7.57 （H-2'） y δH 7.60（H-6'）mostraron una correlación de lH-13C de tres enlaces con los carbonos en δc 124.3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）y δc192.8（C-7）,y5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') y c 192.8(C-7'), respectivamente, estableciendo el grupo carbonilo en la molécula (Figura 2 y Tabla 1). Por lo tanto, en base a estos datos de RMN, el compuesto 5

se estableció como el alcaloide de benciltetrahidroisoquinolina 34-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanona, que fue nombrada como dehidro-oxonorreticulina. Este alcaloide se describe por primera vez en la literatura como un producto natural. Su primer y único registro fue descrito por Dörnyei et al. en 1982 【31】como producto de origen sintético. Sólo se describen los datos de 'H-NMR con algunas multiplicidades indeterminadas. Por lo tanto, las asignaciones completas para todos los desplazamientos químicos de 1H- y 13C-NMR se establecieron mediante experimentos de correlación de H-13C-NMR de un enlace (HSOC) y de dos y tres enlaces (HMBC), y se describieron en Tabla 1.

Los compuestos 6 y 7 se identificaron como los alcaloides de benciltetrahidroisoquinolina (más)-1S,2R-N-óxido de reticulina y(más)-1S,2S-N-óxido de reticulina, respectivamente. Los datos de H-NMR de estos alcaloides se compararon con los datos descritos por Lee et al. [28]utilizando el mismo solvente deuterado (CD3OD) y se observaron algunas inconsistencias (Tabla 1), principalmente en relación con H-1, H-8 y H, C-NO. No hay datos de 13C-NMR descritos para estos alcaloides en la literatura. Sobre la base de los datos limitados de 1H- y 13C-NMR, así como de las ambigüedades observadas para estas moléculas, se realizaron experimentos de 'H y 13C 1D y 2D NMR para determinar sus asignaciones y multiplicidades correctas.

La posición correcta del hidrógeno H{{0}} y H-1 de ambos isómeros 6 y 7 se estableció en base al mapa de correlación de tres enlaces 'H-13C del HMBC -Experimento de RMN (Figura 2). Para el isómero 6, el análisis reveló que el hidrógeno en δH 5,78 (H-8) mostró una correlación de tres enlaces 'H-13C con los carbonos en 6c 79,8 (C-1), δc120 .6（4a）, y δc 149.4 （C-6）, mientras que el hidrógeno en δH 4,13 （H-1）mostró correlación de tres enlaces 'H-13C con los carbonos en c 60.7（C-3）,6c 115.7 （C-8）, δc 120.6（C-4a）, y 131.2 （C-1'）, estableciendo así el posiciones correctas de los hidrógenos H-8 y H-1 para el isómero 6. Esta atribución puede ser confirmada por el análisis del hidrógeno en δH 6.76（H-5）que mostró tres enlaces Correlación de H-13C con los carbonos en δc 27,0 (C-4), δc 127,1 (C-8a) y δc 145,7 (C-7) (Figura 2). Para el isómero7, el análisis reveló que el hidrógeno en δH 6,30 （H-8）mostraba una correlación 'H-13C de tres enlaces con los carbonos en δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a）, y δc 148.9 （C-6）, mientras que el hidrógeno en δH 4.46 （H-1）mostró correlaciones H-13C de tres enlaces con los carbonos en δc 62.9 （C{ {82}}）,5c 115.5（C-8）, bc 122.8（C-4a）, y 131.4（C-1'）, estableciendo así las posiciones correctas de los hidrógenos H -8 y H-1 para el isómero 7. Esta atribución también fue confirmada por el análisis del hidrógeno en δH 6.71 （H-5）que mostró tres enlaces lH-13C correlaciones con los carbonos en δc 26,3 （C-4）, δc 126,9 （C-8a） y 6c 146,1 （C-7） (Figura 2). También se llevó a cabo el experimento NOESY para establecer la estereoquímica correcta de los isómeros 6 y 7. En este experimento, la fuerte correlación NOE de H-1（δH 4.13） y H, CN(5 3.15) indicó la -orientación del oxígeno en el isómero 6. Por otro lado, no se pudo encontrar una correlación NOE obvia entre H-1(6H 4.46) y HAC-N(5H 3.20) en el experimento 2D-NOESY para 7, indicando la orientación - del oxígeno en el isómero 7 (Figura 2). Estas pequeñas diferencias en los desplazamientos químicos de estos isómeros se observan claramente debido a la estereoquímica del nitrógeno afectado por las posiciones y del oxígeno. Las comparaciones de los datos de RMN H y 13C obtenidos para los compuestos 6 y 7 con datos de moléculas con estructuras cercanas como hexapetalina A y hexapetalina B [30] respaldan los datos descritos en la Tabla 1 sin ambigüedad.

Los compuestos 1-4 y 8-13 se identificaron como talifolina (1) [32], anonaína (2) [33] liriodenina (3) [10,34], (S)-( más )-reticulina ( 4)[27], coreximina (8) [34,35], bisnorargemonina (9)[36], isochamanetina (10) [37], dichamanetina (11) [37] y una mezcla de uvarinol (12) e isouvarinol (13) [37] en base a sus perfiles espectroscópicos y comparación con valores en la literatura. Los espectros 1D y 2D-NMR de 1H y 13C, así como los espectros de masas de todos los compuestos aislados, están disponibles como materiales complementarios.

Desde un punto de vista quimiofenético (un nuevo término para la quimiosistemática de plantas/quimiotaxonomía de plantas), es importante tener en cuenta que la presencia de flavanonas C-benciladas y dihidrocalconas C-benciladas son un tipo especial de flavonoides derivados de la conocida flavanona pinocembrina. y han sido descritas particularmente en especies del género Uoaria pertenecientes a la familia Annonaceae [3,38-42]. La presencia de estos compuestos en D. calycina sugiere estrechas relaciones quimiofenéticas con Uoaria. Por otro lado, se deben realizar más investigaciones con otras partes de la planta, así como con otras especies de Diclinanona, para confirmar esta relación quimiofenética. Las flavanonas y las chalconas están muy extendidas en las plantas superiores, pero la adición de grupos bencilo es bastante rara y parece estar limitada en Annonaceae al género Uoaria [3,39-42] y ahora al género Diclinanona. Los grupos bencilo presumiblemente surgen de una ruta C6-C1, pero la funcionalidad o-hidroxi es inusual. La ausencia de sustituyentes en el anillo B en todos estos flavonoides de Uoaria y Diclinanona se puede vincular con la observación anterior sobre los flavonoides de Popowia cauliflora [38].

Los alcaloides derivados de isoquinolina aislados y descritos en este trabajo ya han sido registrados en varias especies de Annonaceae en diferentes géneros. Algunos de estos, como la liriodenina y la anonaína, se consideran marcadores quimiofenéticos, y la presencia de estos alcaloides en D.calycina refuerza aún más la relación de estos marcadores quimiofenéticos en la familia Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35, 43].

Cabe mencionar que, según Zidorn [44], los estudios quimiofenéticos se definen como estudios destinados a describir el conjunto de metabolitos secundarios especializados en un taxón dado, como ya se observó en varios trabajos publicados [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Así, los estudios quimiofenéticos contribuyen a la descripción fenética de los taxones, de forma similar a los enfoques anatómicos, morfológicos y cariológicos, que ya han sido reconocidos como de gran importancia para el establecimiento de sistemas "naturales", y que continúan siendo de extrema importancia para la descripción de organismos clasificados con la ayuda de métodos moleculares modernos [44].

2.2. Ensayo citotóxico

La actividad citotóxica in vitro de los compuestos aislados (Cuadro 2), a excepción de los compuestos 2, 3, 5 y 8 (por su bajo rendimiento), se evaluó frente acélula cancerosalíneas HL-60 (leucemia promielocítica humana), MCF-7(adenocarcinoma de mama humano), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), HCT116 (carcinoma de colon humano) y línea celular no cancerosa MRC{{5} } (fibroblasto de pulmón humano) utilizando el ensayo azul de Alamar después de 72 h de incubación.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetina (11) mostró actividad citotóxica contra HL-60 y HCT116 con valores IC50 de 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1） y 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L-1）, respectivamente. La mezcla de uvarinol (12) e isouvarinol(13) demostró actividad citotóxica contra HL-60, con un valor ICs0 de 9.74ug∶mL-1, y HCT116, con un valor ICs0 de 17.31 ug∶mL{ {30}}. Entre las dihidroflavonas benciladas, solo la isorhamnetina (10) mostró actividad citotóxica contra HepG2 con un valor de IC50 de 19,79 ugs:mL-1(54,65 umol.L-1). Según la literatura, las dihidroflavonas benciladas se describen con propiedades citotóxicas [39-42]. Entre las descritas en este trabajo, la isorhamnetina (10), la dichamanetina (11) y el uvarinol (12) se describen dentro de las propiedades citotóxicas in vitro frente a líneas celulares tumorales humanas de carcinoma de nasofaringe (KB) y leucemia linfocítica P-388 (PS) con valores IC50 de 5.3 y 4.1,4.8 y 1.8, y 5.9 y 9.7, ug.mL-1, respectivamente [39,40]. Estas diferentes actividades se pueden atribuir a la presencia de uno o más grupos hidroxibencilo presentes en las moléculas, así como a la posición en la que se unen estos grupos. Sin embargo, se necesita más investigación para confirmar esta observación.

La actividad citotóxica in vitro de los alcaloides derivados de la isoquinolina anonaína (2), liri-adenina (3) y (S)-( plus )-reticulina (4) ha sido descrita recientemente por Menezes et al.[2{{16] }}], Souza et al. [6] y Costa et al. [43] con énfasis en la liriodenina, que demostró una potente actividad citotóxica contra las líneas celulares de cáncer B{{10}}F10(melanoma de ratón), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), HL{{13 }} (leucemia promielocítica humana) y K562 (leucemia mielocítica crónica humana） con valores de IC5s0 inferiores a 10,0 μmol.L-1【43】. La anonaína mostró una actividad moderada contra B16-F10, HepG2, HL60 , y K562 con valores de IC50 inferiores a 19,0 umol.L-1[20].(S)-( plus )-Reticulina mostró actividad moderada solo frente a HepG2 con valores de IC50 de 15,35 μmol L-1【 6,20].

3. Materiales y Métodos

3.1. Procedimientos Experimentales Generales

Las rotaciones ópticas en metanol (MeOH) se registraron con un polarímetro P{{0}} (Jasco, Tokio, Japón) a 589 nm. Los experimentos de RMN 1D y 2D se adquirieron en CDCl. (cloroformo-d) o CDCl más una gota de CD, OD (metanol-du y CD, COCD3(acetona-d6) a 298 K en un espectrómetro AVANCE I HD NMR (Bruker, Billerica, MA, EE. UU.) que funciona a 11,75 T (Manual 13C a 500 y 125 MHz, respectivamente) y en un espectrómetro de RMN Bruker AVANCE I 600 que funciona a 14,1 T('H y 13Cat 60{ {63}} y 150 MHz respectivamente). Todos los desplazamientos químicos de RMN de 13C y 1H （δ）se presentan en ppm en relación con la señal de tetrametilsilano a 0.00 ppm como referencia interna, y las constantes de acoplamiento (D) se dan en Hz. El espectrómetro de RMN estaba equipado con una sonda de detección inversa multinuclear de 5- mm (experimentos de RMN 1D y 2D) con un gradiente z. Un enlace (HSQC) y dos y Los experimentos de correlación de tres enlaces (HMBC)1H-13C-NMR se optimizaron para la constante de acoplamiento promedio' JcH y LRJ(cH de 140 y 8 Hz, respectivamente. Para el análisis de espectrometría de masas de baja resolución (LC-MS), el las muestras de los compuestos aislados se resuspendieron en metanol (grado HPLC), creando el estoc k soluciones(1 mg·mL-1). Se diluyeron alícuotas (5 uL) de las soluciones madre hasta 5 ug·mL y se analizaron por infusión directa en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, modelo TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San José, CA, EE. UU.), equipado con ionización por electropulverización. (ESI) o fuentes de ionización química a presión atmosférica (APCI). Condiciones de ESI-MS: voltaje de pulverización, 5 kV; gas envolvente, 10 unidades arbitrarias (arb); gas auxiliar, 5arb; gas de barrido, 0arb; temperatura capilar, 250 grados; voltaje capilar, 40 V; lente de tubo, 70 V; rango de masa, m/z 100 a 1000. Condiciones APCI-MS: corriente de descarga, 5 μA; temperatura del vaporizador, 350 grados; presión del gas envolvente, 25 unidades arbitrarias （arb）; presión de gas de barrido de iones, 0,0 arb; presión de gas auxiliar, 10 arb; temperatura capilar, 250 grados C; compensación de lente de tubo, 70 V; desviación del skimmer, 0 V; rango de masas, m/z 100 a 1000. Se usó argón como gas de colisión, y los espectros MS/MS se obtuvieron usando energías de colisión en el rango de 25 a 30 eV. Para la cromatografía en columna (CC) se utilizó gel de sílice 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU., malla 70-230), mientras que gel de sílice 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Alemania, 0,25 mm, aluminio) se utilizó para análisis y preparación con cromatografía de capa fina (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, vidrio). Los compuestos se visualizaron por exposición bajo luz UV254/365, por pulverización con reactivo de p-anisaldehído seguido de calentamiento en una placa caliente y por pulverización de reactivo de Dragendorff.

3.2.Material vegetal

En la presente investigación, el material botánico (corteza) de D.calycina fue recolectado el 27 de mayo de 2017 en la Reserva Adolpho Ducke (coordenadas geográficas: 02 grado 53'36.1S y 59 grado 58'28.9"O), Manaus, Estado de Amazonas. , Brasil, e identificado por el Prof. Dr.Antonio Carlos Webber, taxónomo de plantas del Departamento de Biología de la Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM).Un espécimen comprobante número 10.810 fue depositado en el Herbario de DB/UFAM. el acceso (espécimen) fue registrado en el Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) con el registro A70EDCD.

3.3. Extracción y Aislamiento

La corteza de D.calycina se secó inicialmente a temperatura ambiente durante 24 h y luego se secó en un horno de circulación de aire durante 48 h a una temperatura de 40 grados, y posteriormente se pulverizó en un molino de cuatro cuchillas (Marconi, Piracicaba, SP). , Brasil) para obtener el material en polvo (1340 g). Luego se realizó una maceración exhaustiva con hexano (8x4 L) seguida de MeOH (8x4 L). Las soluciones extractivas obtenidas se concentraron en un rotavapor a presión reducida (40-50 grados) para dar los extractos de hexano (24,85 g) y MeOH (199,43 g), respectivamente.

El análisis de TLC revelado con el reactivo de Dragendorff indicó una alta presencia de alcaloides en el extracto de MeOH. Por lo tanto, una alícuota de extracto de MeOH (188,30 g) se sometió inicialmente a una extracción ácido-base para dar fracciones alcaloidales (5,46 g) y neutras (4,47 g). Posteriormente, parte de la fracción alcaloidal (5.0g) se sometió a columna cromatográfica de gel de sílice (CC) previamente tratada con una solución de NaHCO3 al 10 por ciento [12], eluida con hexano (100 por ciento), hexano-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 y 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 por ciento), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 y 10:90,0/u), EtOAc (100 por ciento), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 y 10:90, v/o), y finalmente MeOH dando 250 fracciones (30 mL cada una). Después de la evaluación por TLC usando una mezcla de CH2Cl2-MeOH en las proporciones de 95:05, 90:10, 85:15 y 80:20 como sistema eluyente (v/o), las muestras similares se agruparon para dar 16 fracciones (F1 a F16).

La fracción F5 (181,2 mg) del CC inicial eluido con hexano-CH,Cl2 (50:50 a 10:90, v/o) se sometió a un nuevo CC de gel de sílice usando la misma metodología anterior eluida con hexano (100 por ciento), hexano -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 y 10:90, v/o), CH,Cl ,(100 por ciento), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 y 10:90 ,o/), EtOAc (100 por ciento), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 y 15:85, /o) y MeOH (100 por ciento), lo que da 118 fracciones ( 15 mL cada uno) que se agruparon en 12 subfracciones (F5.1 a F5.12), según evaluación de análisis TLC usando una mezcla de CH2Cl2-MeOH en las proporciones de 95:05 y 90:10. Subfracción F5 .1 (28,9 mg) eluido con hexano (100 %) se sometió a una TLC preparativa eluida con CH,Cl-MeOH (95:05, v/v, dos eluciones) que proporcionó 2 (1,4 mg) y 3 (1,7 mg), respectivamente. Subfracciones F5.4 (21,5 mg) eluidas con hexano-CH,C(80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) eluidas con hexano-CH,Cl(80:20,70:30,60;40 y 50:50 ,v/) y F5.6 (15,4 mg) eluidos con hexano-CHCl2 (50:50, 40:60 y 30:70, v/o) se combinaron (53,6 mg) y también se sometieron a una TLC preparativa eluida con CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, dos eluciones) dando 3 (8,9 mg).

Fracción F6(2099,1 mg) del CC inicial eluido con hexano-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 por ciento), y CH,Cl2-EtOAc (90:10 a 10:90, o/o) se sometió a un nuevo CC de gel de sílice usando la misma metodología anterior eluida con los mismos sistemas de solventes, proporcionando 140 fracciones (30 ml cada uno). Después de la evaluación por TLC utilizando una mezcla de CH2Cl2-MeOH en proporciones de 95:05, 90:10 y 85:15 como sistema eluyente (o/o), las muestras similares se agruparon para dar 13 subfracciones (F6 .1 a F6.13). La subfracción F6.6 (1541,3 mg) se sometió a una nueva CC de gel de sílice utilizando la misma metodología anterior eluida con los mismos sistemas de disolventes, lo que proporcionó 120 fracciones (30 ml cada una) que se analizaron por TLC (utilizando la misma metodología anterior) proporcionando 12 nuevas subfracciones (F6.6.1 a F6.6.12). La subfracción F6.6.2 (17,0 mg) eluida con hexano-CH,Cl (60:40 y 50:50, v/v) se sometió a una TLC preparativa eluida con CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o, una elución) que da como resultado 3 (1,4 mg). La subfracción F6.6.3 (643,3 mg) eluida con hexano-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 y 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 por ciento) y CH2Cl2-EtOAc (90:10 y 80:20,o/o) se sometió a una TLC preparativa eluida con CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, una elución) que produjo una nueva subfracción F6.6.3.1 (161,8 mg) que se sometió a una nueva TLC preparativa eluida con EtOAc-MeOH (90:10, v/o, una elución) que proporcionó 4 (148,2 mg). La subfracción F6.6.4 (90,2 mg) eluida con CH2Cl2-EtOAc (70:30 y 60:40,o/o) se sometió a una TLC preparativa eluida con CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, una elución) dando 1 (1,4 mg) y 4 (50,1 mg), respectivamente. La subfracción F6.6.5 (83,4 mg) eluida con CH,Cl-EtOAc (60:40 y 50:50, o/o) también se sometió a una TLC preparativa eluida con CH,Cl2-MeOH (90:10, ufo, una elución) proporcionando de nuevo 1 (1,5 mg) y 4 (45,5 mg), respectivamente. La subfracción F6.6.6 (101,4 mg) eluida con CH,Cl2-EtOAc (50:50 y 40:60, v/)) se sometió a una TLC preparativa eluida con CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, una elución) dando 8 (3,4 mg) y otra subfracción F6.6.6.1 (48,8 mg). :15, vo, una elución) y posteriormente CHCl-MeOH (90:10, v/v, una elución) dando como resultado nuevamente 4 (37,4 mg). Para este procedimiento, la placa cromatográfica se eluyó inicialmente con la fase móvil EtOAc-MeOH (85:15, v/o, una elución). Tras esta elución, la placa cromatográfica se secó para eliminar el disolvente y posteriormente se sometió a una nueva elución con la fase móvil CH,Cl,-MeOH (90:10,vf, una elución) obteniéndose 4. Subfracción F6.6.7 ( 109,0 mg) eluido con CH,Cl2-EtOAc (40:60,30:70,20:80 y 10:90,vfo) se sometió a una TLC preparativa eluida con CH,Cl2-MeOH (90:10,vo, una elución) dando otra subfracción F6.6.7.1 (24,8 mg) que se sometió a una nueva TLC preparativa eluida inicialmente con EtOAc-MeOH (85:15, v/o, una elución) y posteriormente CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, una elución) que da como resultado 9 (11,1 mg). El procedimiento de aislamiento utilizado para 9 fue el mismo que se describió previamente para 4. La subfracción F6.6.10 (92,0 mg) eluida con EtOAc-MeOH (60:40 y 50:50, v/o) se sometió a una TLC preparativa eluida con CH, Cl-MeOH (90:10, v/o, una elución) produciendo 5 (1,7 mg) y 6 (7,8 mg), respectivamente. La subfracción F6.6.11 (326,0 mg) eluida con EtOAc-MeOH (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 y 10:90, v/o) se sometió a una TLC preparativa eluida con CHCl- MeOH (90:10, v/o, una elución) produciendo 1 (2,4 mg) y 7 (12,5 mg), respectivamente.

La fracción F7 (692,4 mg) de la CC inicial eluida con EtOAc (100 por ciento) y CHCl2-EtOAc (95:05, 90:10, 85:15 y 75:25, ofo) se sometió a un nuevo gel de sílice CCusando la misma metodología que se describió para CC inicial con los mismos sistemas de solventes proporcionando 110 fracciones (30 mL cada una).Después de la evaluación por TLC usando una mezcla de CH2Cl2-MeOH en las proporciones de 95:05, 90:10 y 85 :15 como el sistema eluyente (o/o), las muestras similares se agruparon para dar 12 subfracciones (F7.1 a F7.12).F7.8 (147.4 mg) eluido con CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 y 30:70, porcentaje v/o) se sometió a una TLC preparativa eluida con CHCl-MeOH (95:05, vfo, una elución) proporcionando 10 (5,4 mg) y 11 ( 120,6 mg), respectivamente. F7.9 (144,2 mg) eluido con CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 y 10:90, porcentaje v/o) también se sometió a una TLC preparativa eluida con CH,Cl,-MeOH( 95:05,vo, una elución) proporcionando 11 (91,2 mg) y una mezcla de 12 y 13 (39,4 mg), respectivamente.

talifolina (1): polvo marrón amorfo;' H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura [32]; LR-ESI( más )-MS [M más H]* más m/z 208.

Anonaine (2): Polvo amorfo marrón; 1H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura [33]; LR-ESI( más )-MS [M más H] más m/z 266.

Liriodenina (3): cristales amarillos (CH,Cl-MeOH 3:1); 1H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura [10,34]; LR-ESI( más )-MS [M más H] más m/z 276.

(S)-( más )-Reticulina(4): Polvo amorfo marrón; [ ]p25 más 71,60(c 0,05 g/100 ml, MeOH); 1H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura [27;LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 30.

3,4-Dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinilo)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanona (Dehidro-oxonorreticulina)(5 ): polvo amorfo marrón; 'H y 13C-NMR datos, véase la Tabla 1; LR-ESI( más )-MS [M más H] más m/z 328.

( más ){{0}}S,2R-N-óxido de reticulina(6): Polvo amorfo marrón; [ lp25 más 136,4 (c0,146 g/100 mL, MeOH); Datos de 13C-NMR de 1 mano, consulte la Tabla 1; LR-APCI (más)-MS [M más H] más m/2346

( más ){{0}}S,2S-N.-óxido de reticulina (7): Polvo amorfo marrón; [ ]p25 más 394,5 (c 0,03 g/100 ml, MeOH); datos de 1H y 13C-NMR, véase la Tabla 1; LR-APCI( más )-MS [M más H] más m/z346.

Coreximina (8): Polvo amorfo amarillo claro;[ ]p25 más 201.1(c 0.08g/100mL, MeOH)'H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura[34,35];LR- ESI( más )-MS [M más H] más m/z 328.

Bisnorargemonina (9): Polvo amorfo marrón; 1H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura [36]; LR-APCI( más )-MS [M más H] más m/z 328.

Isochamanetina (10): polvo amorfo de color amarillo claro; [ p25-12.4(c 0,5 g/100 mL, MeOH)'H-RMN y 13C-RMN de acuerdo con la literatura[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetin (11): Polvo amorfo amarillo;[ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura [37]; LR-ESI(-)-EM [MH]-m/z467.

Mezcla de uvarinol(12) e isouvarinol(13): Polvo amorfo amarillo; H-NMR y 13C-NMR de acuerdo con la literatura [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z 573.

3.4.Ensayo citotóxico in vitro

3.4.1.Células

HL-60 (leucemia promielocítica humana), MCF-7 (adenocarcinoma de mama humano), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), HCT116 (carcinoma de colon humano) y MRC-5 (fibroblasto de pulmón humano) las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron según lo recomendado por la guía de cultivo de células animales de la ATCC. Todas las líneas celulares se analizaron para micoplasma utilizando un kit de tinción de micoplasma (Sigma-Aldrich) para validar el uso de células libres de contaminación.

3.4.2. Ensayo de citotoxicidad

Para el ensayo de citotoxicidad, la viabilidad celular se cuantificó mediante el método azul de Alamar, como se describió anteriormente [{{0}}]. Para todos los experimentos, las células se sembraron en 96-placas de pocillos. Los constituyentes químicos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brasil) y se agregaron a cada pocillo y se incubaron durante 72 h. Como control positivo se utilizó doxorrubicina (clorhidrato de doxorrubicina, pureza mayor o igual al 95 por ciento, Laboratorio IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina）. Al final del tratamiento, se utilizaron 20 μL de una solución madre (0,312 mg/mL) de resazurina (Sigma-Aldrich Co.) a cada pocillo. Se midieron las absorbancias a 570 nm y 600 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). La concentración inhibidora media (IC50) se obtuvo mediante regresión no lineal con intervalos de confianza del 95 por ciento (IC95 por ciento) utilizando el software GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, EE. UU.).

4. Conclusiones

La investigación fitoquímica de la corteza de D.calycina condujo al aislamiento e identificación de trece compuestos(1-13); nueve alcaloides derivados de isoquinolina (1-9) y cuatroflavonoides(10-13). Los alcaloides pertenecen a las siguientes subclases: isoquinolina simple, thali en línea (1); aporfina, anonaína (2); oxoaporfina, liriodenina (3); bencil-tetrahidroisoquinolinas, (más)-reticulina(4), dehidro-oxonorreticulina(3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinilo)({{13} }hidroxi-4-metoxifenil)-metanona)(5), 1S,2R-reticulina Ng-óxido(6) y 1S,2S-reticulina N.-óxido (7); tetrahidro protoberberina, coreximina (8); y pavina, bisnorargemonina (9). Mientras que los flavonoides pertenecen a las dihidroflavonas benciladas, isorhamnetina (10), dichamanetina (11) y una mezcla de uvarinol (12) e isouvarinol (13). Los compuestos aislados se describen por primera vez en D.calycina así como en el género Diclinanona.

La actividad citotóxica de los compuestos aislados (excepto anonaína, liriodenina, 1,2-dihidro-oxonorreticulina y coreximina) se evaluó contra el cáncer (HL-60, MCF-7, HepG2 y HCT116) y líneas celulares no cancerosas (MRC-5). Entre ellos, los resultados más prometedores se observaron para las dihidroflavonas benciladas dichamanetina (10), y

la mezcla de uvarinol(12) e isouvarinol (13) que mostró actividad citotóxica moderada contra las líneas celulares de cáncer probadas （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetin (11) mostró actividad citotóxica contra HL-60 y HCT116 con valores de IC50 de 15,78 ug·mL-1 (33,70 μmol-L-1) y 18,99 ug·mL-I (40,56 μmol) .L-1）, respectivamente, mientras que la mezcla de uvarinol （12） e isouvarinol (13) demostró actividad citotóxica frente a HL-60, con valor de IC50 de 9,74 ug∶mL-I, y HCT116, con IC50 valor de 17,31 ug·mL-1. Estos resultados sobre las líneas celulares tumorales también se describen por primera vez para las dihidroflavonas benciladas. Las actividades citotóxicas de reticulina, anonaína y liriodenina se establecieron previamente, en las que la liriodenina es el compuesto más potente.

Los resultados obtenidos en este trabajo indican que las especies de la familia Annonaceae son una fuente prometedora de compuestos biológicamente activos con propiedades citotóxicas, y sugieren la continuación de su investigación en otros modelos de ensayos biológicos.

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