La inhalación breve de sevoflurano puede reducir la formación de cicatrices gliales después de una lesión cerebral hipóxico-isquémica en ratas neonatales, parte 1

Abstracto

Estudios anteriores han demostrado que el poscondicionamiento con sevoflurano puede proporcionar neuroprotección después de una lesión hipóxico-isquémica y mejorar la función de aprendizaje y memoria en cerebros de roedores en desarrollo.

La lesión hipóxico-isquémica se refiere a un estado patológico causado por isquemia cerebral, hipoxia, trastorno metabólico y daño de las células nerviosas debido a trastornos de los sistemas cardiovascular y cerebrovascular. Con el progreso social y los cambios en el estilo de vida, las lesiones hipóxicas-isquémicas son cada vez más comunes. Esta condición puede causar muchos daños a la salud humana, incluso afectar la inteligencia y la memoria.

Aunque la hipoxia y la isquemia pueden provocar una disminución de la función cerebral, eso no significa que la memoria se verá afectada negativamente. Por el contrario, podemos mejorar la memoria y aumentar la eficiencia del cerebro mediante los métodos adecuados. Aquí hay algunas maneras de ayudar a mejorar su memoria:

1. Dieta saludable: El impacto de la dieta en la memoria es muy importante. Los alimentos ricos en proteínas, vitaminas y minerales pueden ayudar a mantener un sistema nervioso y una función del pensamiento saludables.

2. Haga más ejercicio: el ejercicio físico puede promover la circulación sanguínea, aumentar el flujo de oxígeno, mejorar la inmunidad del cuerpo y reducir el riesgo de enfermedades. A través del ejercicio, puedes mejorar tu capacidad de memoria.

3. Fortalecer la confianza en uno mismo: la confianza es un factor importante en la memoria de una persona. Si cree que puede completar una determinada tarea, logrará fácilmente los resultados que desea y también podrá mejorar su memoria de manera efectiva.

Se puede ver que la lesión hipóxico-isquémica no es una condición que inevitablemente dañará la memoria humana. Mientras dominemos los métodos correctos y cuidemos bien nuestro cerebro, podremos abrazar un futuro saludable con una actitud positiva. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino que tiene muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de Cistanche deserticola proviene de los múltiples ingredientes activos que contiene, incluidos ácido tánico, polisacáridos, glucósidos flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro a través de una variedad de vías.

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Se utilizó el modelo clásico de Rice-Vannucci para inducir una lesión hipóxico-isquémica y las ratas recién nacidas (día 7 posnatal) fueron tratadas con sevoflurano al 2,4% durante 30 minutos después de la lesión hipóxico-isquémica.

Nuestros resultados mostraron que el poscondicionamiento con sevoflurano mejoró significativamente la función de aprendizaje y memoria de las ratas, disminuyó la astrogliosis y la formación de cicatrices gliales, aumentó el número de espinas dendríticas y protegió la histomorfología del hipocampo. Mecánicamente, el poscondicionamiento con sevoflurano disminuyó la expresión de von Hippel-Lindau del factor inducible por hipoxia -1 y aumentó la expresión de DJ -1.

La inyección de 1,52 ug del inhibidor del factor -1 inducible por hipoxia YC-1 (Lificiguat) en el ventrículo lateral izquierdo 30 minutos antes de la lesión hipóxico-isquémica revirtió la neuroprotección inducida por el sevoflurano. Este hallazgo sugiere que el sevoflurano puede aliviar eficazmente la astrogliosis en el hipocampo y reducir los trastornos del aprendizaje y la memoria causados ​​por la formación de cicatrices gliales después de una lesión hipóxico-isquémica.

El mecanismo subyacente puede estar relacionado con la expresión aumentada de DJ-1, la ubiquitinación reducida del factor inducible por hipoxia-1 y la expresión estabilizada del factor inducible por hipoxia-1. Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de China, China (n.º de aprobación 2016PS337K) el 9 de noviembre de 2016.

Palabras clave: lesión cerebral; cerebro; sistema nervioso central; en vivo; lesión; modelo; plasticidad; rata; recuperación; regeneración; reparaciónClasificación de biblioteca china No. R453; R741; R614.2+1.

Introducción

La encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal (EHI) es una complicación común en el período neonatal causada por muchos factores, como la asfixia neonatal, el sufrimiento intrauterino y la enfermedad de la membrana hialina (Douglas-Escobar y Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

La EHI es la principal causa de muerte infantil y la principal fuente de secuelas neurológicas (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). El noventa por ciento de los sobrevivientes de EHI tienen disfunciones neurológicas a largo plazo, como disfunciones de aprendizaje, cognitivas y motoras, y epilepsia (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). El tratamiento actual de la EHI se centra principalmente en el tratamiento sintomático, que incluye ventilación mecánica, corrección de la hipotensión, suplementación de glucosa y limitación de la ingesta de líquidos, según corresponda.

Sin embargo, se requiere un tratamiento eficaz capaz de revertir o reducir el daño cerebral a largo plazo (Stankowski y Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Como parte fundamental del aprendizaje y el reconocimiento, el hipocampo, incluido el giro dentado (DG) Las regiones , CA1 y CA3 participan en la transformación e integración de la información periférica en los centros nerviosos (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

El hipocampo es hipersensible al daño hipóxico-isquémico (HI), lo que puede provocar la apoptosis de las neuronas del hipocampo, estimular una gliosis reactiva excesiva y provocar la formación de cicatrices gliales (Hopkins y Haaland, 2004; Wang et al., 2012). La proliferación de astrocitos es crucial para sellar el sitio del infarto, remodelar la estructura del hipocampo y controlar temporalmente las respuestas inmunes locales durante la fase aguda (Rolls et al., 2009).

Sin embargo, la hipertrofia y la formación de cicatrices gliales contribuyen a una neurogénesis aberrante, obstruyen el crecimiento de la columna dendrítica y dificultan la forma de las sinapsis, perjudicando aún más las funciones de aprendizaje y reconocimiento (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda y Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi et al., 2017).

La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y los proteoglicanos de sulfato de condroitina, como el neurocan, son marcadores patológicos de astrogliosis y cicatrización glial cuya expresión puede regularse positivamente mediante astrocitos altamente activados (Pekny y Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Por tanto, la inhibición de la astrogliosis y la cicatrización glial puede ser un objetivo terapéutico para la EHI y sus secuelas neurológicas a largo plazo.

Se ha demostrado que la aplicación de sevoflurano mitiga la lesión por HI en roedores. Los estudios que investigan la importancia del poscondicionamiento con sevoflurano (SPC) para aliviar el daño del HI mediante la regulación positiva del factor inducible por hipoxia -1 (HIF -1) en roedores adultos y ratas neonatales han identificado varios mecanismos potenciales (Wang et al., 2019b; Yanget al., 2019; Du et al., 2020; Liu y Gong, 2020).

Como sensor fisiológico clave de la hipoxia, HIF-1 es un factor de transcripción con cientos de moléculas posteriores involucradas en mecanismos de tolerancia isquémica, como el factor de crecimiento endotelial vascular y la eritropoyetina (Na et al., 2015). Se ha verificado que el postcondicionamiento hipóxico reduce la activación de astrocitos y microglial después de HI en cerebros de ratas neonatales (Teo et al., 2015).

Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que HIF-1 puede contribuir a atenuar la formación de cicatrices gliales y astrogliosis. HIF-1 puede existir constitutivamente en las neuronas, por lo que su expresión aumenta rápidamente y se acumula en condiciones hipóxicas. Sin embargo, cuando el oxígeno vuelve a la normalidad, la expresión de HIF1 no puede mantenerse en un nivel lo suficientemente alto como para ejercer continuamente un efecto neuroprotector debido a la degradación dependiente de oxígeno por parte de las proteínas prolil-hidroxilasa y la posterior ubiquitilación por parte de las proteínas von Hippel-Lindau (VHL) (Berra et al., 2003; Zhang y otros, 2018).

Según se informa, DJ-1 (codificado por Park7) es una proteína neuroprotectora, especialmente en condiciones oxidativas (Aleyasin et al., 2007, 2010). La proteína VHL interactúa físicamente con DJ-1, según lo determinado mediante una pantalla de espectrometría de masas imparcial y confirmado en un modelo de enfermedad de Parkinson (EP). Además, Parsanejad et al. (2014) demostraron que DJ-1 inhibe la ubiquitilación dependiente de VHL y estabiliza la expresión de HIF-1.

Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el sevoflurano estabiliza la proteína HIF-1 en el hipocampo mediante la regulación positiva de DJ-1 para inhibir la ubiquitilación de HIF-1, mejorando así el aprendizaje a largo plazo y la función de la memoria.

Para investigar el papel de HIF-1 en la relación entre sevoflurano y astrogliosis, utilizamos YC-1 (Lificiguat), un antagonista selectivo de HIF-1, para inhibir completamente la expresión de HIF-1 en el nivel postranscripcional. En este estudio, investigamos el papel de HIF-1a en la neuroprotección de ratas neonatales HIE tratadas con SPC.

Materiales y métodos

animales
La investigación con animales se realizó en la etapa sináptica del desarrollo de las ratas, que comienza el día 7 posnatal (P7), correspondiente al período de crecimiento de los bebés humanos desde el final del embarazo hasta los 3 años después del nacimiento (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Se seleccionaron ratas Sprague-Dawley de siete días de edad que pesaban entre 12 y 16 g de 20 ratas preñadas (compradas en el Laboratorio del Hospital Shengjing, Universidad Médica de China, China; proporción macho/hembra, 1:1).

Todas las ratas pudieron acceder libremente al agua y a los alimentos, y se mantuvieron a una humedad y temperatura estándar en el laboratorio, con ciclos de luz/oscuridad de 12- horas (8 a. m./8 p. m.). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (Bethesda, MD, EE. UU.).

El Comité de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de China aprobó formalmente los experimentos descritos (Shenyang, China; aprobación n.° 2016PS337K) el 9 de noviembre de 2016.

De 25 ratas preñadas, se eligieron 249 ratas P7 y se dividieron aleatoriamente en grupos según una tabla de números aleatorios (Wang et al., 2019a). Nuestro análisis final incluyó un total de 201 ratas recién nacidas; la tasa de mortalidad después del tratamiento con HI fue del 19%.

Estas 201 ratas recién nacidas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: simulado(n=54), HI (n=54), HI + sevoflurano (HIS) (n=54) y HIS+ YC{{ 6}} (n=39) grupos. En cada grupo, se usaron 24 ratas para el ensayo de transferencia Western, 5 para inmunohistoquímica y tinción de Golgi, y 10 para pruebas de comportamiento. Las 45 ratas restantes en los grupos simulado, HI y HIS se usaron para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT- PCR).

Diseño experimental y exposición al anestésico.

El modelo HIE empleado se describió previamente (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Con base en la distancia entre el ano y los órganos reproductivos, se completó la identificación sexual de las ratas posnatales. Para establecer el modelo HIE, la cabeza de cada rata P7 se colocó en un tubo de plástico transparente, que se selló con algodón antes de liberar el sevoflurano (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

La arteria carótida común izquierda de cada rata se ligó permanentemente y entre las dos ligaduras se cortó la arteria; Cada cirugía finalizó en 5 minutos. Posteriormente, las ratas no se vieron afectadas por la anestesia y fueron colocadas nuevamente en las jaulas de sus madres durante 2 horas. Para la administración de SPC, las ratas se colocaron en una cámara transparente (Lingzhi Company, Hangzhou, China) conectada a un vaporizador de sevoflurano; un conducto ayudó a la ventilación, mientras que el otro transportaba la muestra de gas fuera de la cámara al monitor.

La cámara se ventiló con 30% O2 y 70% N2 durante 2 horas para el grupo simulado, mientras que se administró 8% O2 y 92% N2 durante 2 horas al grupo HI. El SPC se estableció rápidamente después de la HI: las ratas inhalaron sevoflurano al 2,4 % (1 concentración alveolar mínima) en la cámara con una atmósfera de 30 % de O2 y 70 % de N2 y un caudal de aire de 2 L/min durante 30 minutos. La piscina de calentamiento estabilizó la temperatura dentro de la cámara a 37 grados.

Administración de Drogas

Exactamente 30 minutos antes de la HI, se inyectaron 1,52 ug de inhibidor de HIF-1 (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en el ventrículo lateral izquierdo (Paxinos y Franklin, 2013) utilizando una jeringa 5-μLHamilton (Yingweida Technology, Beijing, China). Como se describió anteriormente, YC-1 se disolvió en líquido cefalorraquídeo artificial a una concentración de 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Análisis de Western Blot

Se anestesiaron ratas P7 con sevoflurano al 2% y se extrajeron tejidos del hipocampo de las crías a las 12, 24 y 48 horas y 28 días después de la cirugía. Después de la extracción, los tejidos se colocaron inmediatamente en hielo.

Las proteínas sobrenadantes totales se aislaron añadiendo un agente de ensayo de radioinmunoprecipitación (Beyotime, Haimen, China). Las concentraciones de proteínas se determinaron con un kit One BCA (Beyotime).

A continuación, las muestras se separaron en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 12,5% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear con albúmina sérica bovina al 5% (Sigma-Aldrich) a 4 grados, la membrana se incubó con los anticuerpos primarios apropiados, incluida la anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology). , Danvers, MA, EE. UU.), anti-DJ-1 (1:1000; Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-VHL (1:5000; policlonal; Cat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900; policlonal; Cat# ab2185; Abcam), anti-neurocan (1:200; monoclonal; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) , proteína de densidad anti-postsináptica 95 (PSD95; 1:1000; monoclonal; Cat. No 3409S; Cell Signaling Technology), proteína asociada al anticrecimiento 43 (GAP43; 1:2000; policlonal; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Chicago, IL, EE. UU.) y anti-GFAP (1:5000, policlonal, Cat# ab53554;Abcam).

Posteriormente, las transferencias se incubaron con IgG anti-conejo (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Beijing, China) o IgG anti-ratón (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) durante 2 horas a temperatura ambiente.

Las transferencias de proteínas se visualizaron con reactivos de detección de quimioluminiscencia mejorados (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). Las bandas de proteínas se cuantificaron con el software ImageJ (National Institutes of Health). Para el análisis de transferencias Western, los datos se normalizaron a GAPDH.

Inmunohistoquímica

Veintiocho días después de la cirugía, se administró anestesia a las ratas utilizando el método descrito anteriormente, perfundidas con formalina al 4%, y se les extrajeron los cerebros para realizar una tinción por inmunofluorescencia.

Los cerebros se sumergieron en paraformaldehído al 4% a 4 grados durante 48 horas, posteriormente se deshidrataron en una serie graduada de etanol y finalmente se incluyeron en parafina. A continuación, los tejidos incluidos en parafina se cortaron en secciones de 2,{5}}μm de espesor con un vibratomo y las secciones resultantes se almacenaron a temperatura ambiente.

Cada cerebro se seccionó de forma continua y se seleccionaron tres secciones de cerebro discontinuas para la tinción con NeuN (marcador de neuronas), GFAP (marcador de astrocitos) y neurocan (marcador de cicatrices gliales). Para el doble marcaje, las secciones de tejido se incubaron con dos anticuerpos primarios mixtos, incluidos anti-anticuerpos de cabra. GFAP (1:250; policlonal; Cat# ab53554; Abcam), antígenos de conejo (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) y/o antineurocan de ratón (1:200; monoclonal; Cat# sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) a 4 grados durante la noche en una cámara humidificada.

Posteriormente, las secciones se lavaron con solución salina tamponada con fosfato 0.1 M y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios apropiados, incluida la IgG anti-conejo conjugada con Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), IgG anti-ratón conjugada con Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies) e IgG anti-cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína (1:200; Life Technologies).

La contratinción de los núcleos celulares se implementó con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Beyotime) durante 5 minutos.

Se utilizó un microscopio Olympus BX51 (Olympus Corporation, Tokio, Japón) para la observación de las secciones teñidas. Se seleccionaron aleatoriamente tres campos de visión del hipocampo izquierdo de cada corte para la fotografía. Se utilizó el software ImageJ para estimar la colocalización cuantitativa y, por lo tanto, calcular el coeficiente de superposición de Manders.

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