La calpastatina previene la lesión de podocitos mediada por angiotensina II a través del mantenimiento de la autofagia
Mar 17, 2022
para más información:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, BlaiseRobin1,3, Joe¨lle Pérez2, Yann Salemkour1, Anna Chipon1, Marina Camus1,Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1, He´le`ne Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole He´nique1,Pierre-Louis Tharaux1y olivia lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, París, Francia; y2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, París, Francia
El fuerte valor predictivo de la proteinuria en las patologías glomerulares crónicas está firmemente establecido, así como el papel patogénico de la angiotensina II promoviendo la progresión de la enfermedad glomerular con una barrera de filtración glomerular alterada, lesión de los podocitos y cicatrización de los glomérulos. Aquí encontramos que la hipertensión inducida por angiotensina II crónica inhibióautofagiasalida en glomérulos de ratón. La eliminación de Atg5 (un gen que codifica una proteína involucrada en la autofagia) específicamente en el podocito dio como resultado una podocitopatía inducida por dangiotensina II acelerada, albuminuria acentuada y glomeruloesclerosis. Esto indica que la autofagia es un mecanismo protector clave en el podocito en esta condición. La actividad de calpaína inducida por angiotensina-II en podocitos inhibeautofagiasalida Podocitos de ratones con expresión transgénica del inhibidor de calpaína endógenocalpastatinamostró podocitos más altosautofagiaal inicio del estudio que era resistente a la inhibición dependiente de angiotensina II. Además, la autofagia sostenida concalpastatinadaño podocitario limitado y albuminuria. Estos hallazgos sugieren que la hipertensión tiene efectos patogénicos sobre la estructura y función glomerular, en parte a través de la activación de las calpaínas que conducen al bloqueo de la autofagia de los podocitos. Estos hallazgos descubren un mecanismo original por el cual la hipertensión mediada por angiotensina II inhibe la autofagia a través del reclutamiento de calpaína inducido por calcio con consecuencias patogénicas en caso de desequilibrio porcalpastatinaactividad. Por lo tanto, prevenir una disminución mediada por calpaína enautofagiapuede ser una nueva estrategia terapéutica prometedora para las nefropatías asociadas con una actividad elevada del sistema renina-angiotensina.
PALABRAS CLAVE: angiotensina II;autofagia; calpastatina; hipertensión; podocitos
Declaración de traducción
Dado el papel crucial de la autofagia en el desarrollo deriñónenfermedades, modulación farmacológica deautofagiapodría ser una estrategia prometedora para la prevención y el tratamiento de variosriñónenfermedades. Paralelamente, se descubrió que la sobreactivación de la actividad de la calpaína en los podocitos tiene efectos perjudiciales sobre la función de los podocitos, mientras que no se identificaron sus mecanismos de acción nocivos. Aquí, proporcionamos evidencia de que la calpaína vincula la acción deletérea de la angiotensina II con el bloqueo perjudicial deautofagiaen los podocitos y sugieren que la inhibición de la calpaína podría ser un objetivo terapéutico prometedor para las enfermedades de los podocitos, en parte a través del mantenimiento de la autofagia de los podocitos.
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La hipertensión ocupa el segundo lugar después de la diabetes como causa principal de enfermedad crónica progresiva.riñónenfermedad1–3 e incluso un aumento modesto de la presión arterial es un factor de riesgo independiente para la enfermedad renal en etapa terminal.4 Un número creciente de estudios experimentales han destacado la importancia de los podocitos en el desarrollo deriñónlesión. La pérdida progresiva de podocitos y las alteraciones microvasculares aparecen tempranamente con la disminución funcional del riñón en la nefropatía hipertensiva experimental.5 En pacientes, la excreción urinaria de podocitos viables demostró ser un marcador sensible y específico para la preeclampsia,6,7 y las pacientes con nefroesclerosis tuvieron una menor densidad de podocitos glomerulares queriñóndonantes.8,9 Además, el papel patogénico de la angiotensina II (AngII) en la promoción de la progresión de la enfermedad glomerular está bien establecido, no solo en condiciones hipertensivas sino también en varias enfermedades glomerulares.10–21
La hipertensión glomerular produce estiramiento de los capilares glomerulares, daño endotelial y aumento de la filtración de proteínas glomerulares, lo que provoca colapso glomerular y glomeruloesclerosis. También ejerce una acción directa sobre las estructuras glomerulares, provocando respuestas reguladoras de señalización encaminadas a compensar. Un sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) sistémico y local activado fomenta la hiperplasia mesangial y la síntesis de factores de permeabilidad vascular. Al mismo tiempo, los podocitos muestran señalización de calcio22,23 y modifican su forma ante la estimulación dependiente del receptor AngII tipo 1 (AT1).24–28 Estos mecanismos adaptativos se vuelven desadaptativos a largo plazo, lo que finalmente conduce a la glomeruloesclerosis. AT1 media la participación prominente de RAAS para la presión arterial y la homeostasis de sal y agua. Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y los bloqueadores de AT1 se usan clínicamente para el tratamiento de la hipertensión y la insuficiencia cardíaca en pacientes. Curiosamente, ambos bloqueadores también muestran un efecto protector sobreriñónfunción.
Se ha demostrado que la autofagia es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular, especialmente en las células posmitóticas29,30 y, sobre todo, en los podocitos31–34.autofagiaes un sistema de degradación asociado a los lisosomas para proteínas citoplásmicas de vida prolongada y orgánulos disfuncionales35,36 e implica el secuestro de proteínas y orgánulos en autofagosomas. La formación de autofagosomas depende de la inducción de varios genes, incluidos Map1lc3a/b, Beclin 1 y Tags. 37 Cada vez hay más pruebas de que la desregulación de la vía autofágica está implicada en la patogenia del envejecimiento renal y variasriñónenfermedades como la lesión renal aguda, la poliquistosis renal, el envejecimiento y la nefropatía diabética.31,32,38–41
Regulación deautofagiaen podocitos, fisiológico y, sobre todo, en un contexto patológico, no es bien conocido. Recientemente demostramos que la autofagia de los podocitos es independiente de la regulación de la diana mecanicista de la rapamicina (mTOR) en condiciones fisiológicas, lo que convierte a este tipo de célula en una excepción.42 La activación de AT1 estimula la síntesis de proteínas y el recambio de proteínas en las células. Por lo tanto, razonamos que la activación del RAAS también puede influir en la estimulación del recambio de proteínas y la proteostasis.
En el presente estudio, nos centramos en el papel de la señalización de AngII en podocitos.autofagiaregulación. Identificamos las calpaínas de proteasas activadas por calcio que median un efecto de bloqueo crónico de AngII en podocitos.autofagia. Además, encontramos que el inhibidor de calpaína endógenocalpastatinafue capaz de prevenir la inhibición de la autofagia dependiente de AngII y la lesión de los podocitos durante la hipertensión.
Estos hallazgos descubren un mecanismo original por el cual la hipertensión mediada por AngII inhibeautofagiaa través del reclutamiento de calpaína inducido por calcio con consecuencias patógenas en caso de desequilibrio por la actividad de calpastatina.
MÉTODOS
animales
calpastatinaLos ratones transgénicos (CSTTg) fueron proporcionados amablemente por el Dr. E. Letavernier.43 Se generaron ratones con una interrupción específica de podocitos del gen Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) como se describió previamente31 cruzando ratones Nphs2.cre44 con Atg5lox/lox mice45 en el fondo C57BL6/J. En este estudio se utilizaron ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox y machos de camada de control, de 10 a 12 semanas de edad. El modelo hipertensivo se indujo mediante infusión sc de AngII (Sigma-Aldrich, A9525) a una dosis de 1 mg/kg/min durante 4 a 6 semanas a través de minibombas osmóticas (Alzet Corp, modelo 2006). Se implantaron bombas sc en la espalda entre los omóplatos y las caderas. Los ratones recibieron suplementos de sal (3 por ciento de NaCl) en la comida. Se usaron ratones atg5lox/lox (de tipo salvaje [WT]) como controles en todos los estudios. Para la sal de acetato de desoxicorticosterona (DOCA) con el modelo de reducción de nefronas, los ratones macho adultos se sometieron a una nefrectomía izquierda unilateral. Dos semanas después de la nefrectomía, recibieron gránulos DOC con el 21-día de liberación (Innovative Research of America) implantados sc Se implantó un segundo gránulo 3 semanas después del primer implante. Todos los ratones recibieron NaCl al 0,9 por ciento en agua potable ad libitum y se sacrificaron después de 6 semanas de administración de DOC.46 Los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas veterinarias francesas y las formuladas por la Comunidad Europea para uso experimental en animales (L358-86/ 609EEC) y fueron aprobados por el Ministerio de Investigación francés y el comité de ética de investigación de la universidad local (APAFIS-7646 y -22373).
Experimento de cultivo primario de podocitos
Los podocitos primarios diferenciados se cultivaron como se describió previamente.47,48 Brevemente, la corteza renal recién aislada se mezcló y digirió con colagenasa I (Gibco, 17100-017) en Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). A continuación, los tejidos se pasaron a través de filtros de células de 70 mm y 40 mm (BD Falcon, 352340 y 352350). Los glomérulos, que se adhieren al filtro de células de 40 mm, se eliminaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Life Technologies, 10010023) + 0,5 % de albúmina sérica bovina (Eurobio, HALALB07-65) inyectada a presión y luego se lavaron dos veces en PBS. Los glomérulos recién aislados se sembraron en 6-placas de pocillos en Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) complementados con un 10 % de suero de ternera fetal y un 1 % de penicilina/estreptomicina (Life Technologies, 15140122) para permitir que los podocitos salieran de los glomérulos y crecer El enriquecimiento de podocitos se verificó mediante análisis de transferencia Western como se describió anteriormente 31,48,49 (Figura complementaria S1). Los podocitos se cultivaron en ausencia o presencia de bafilomicina A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) durante 4 horas. Para los experimentos de inmunofluorescencia, los podocitos primarios se colocaron en placas en etiquetas de 4 platos (Dutcher, 055071). Luego, los podocitos se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante 10 minutos y se procesaron para inmunofluorescencia.
Ensayo de actividad de calpaína
La actividad de la calpaína intracelular se determinó en los podocitos primarios, como se describió previamente.50–52 Se cultivó un total de 100000 células en 24-placas de cultivo de tejido en pozos en Roswell Park Memorial Institute 1640 complementadas con 10 por ciento de células fetales. suero de ternera y penicilina/estreptomicina al 1 por ciento. Después del período de cultivo indicado, el medio se reemplazó con solución de bicarbonato Krebs-Ringer HEPES (KRH) (pH 7,4) que contenía CaCl2 4 mM, con o sin inhibidor de calpaína 10 mM-1, y se incubó durante 10 minutos antes de la adición. de sustrato de calpaína 50 mM N-succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metilcumarina (Sigma-Aldrich, S6510). Después de un período de incubación de 90-minutos, la actividad de calpaína se determinó como la diferencia entre la fluorescencia FL (medida a 360 nm de excitación y 430 nm de emisión) con y sin inhibidor de calpaína-1.
mancha occidental
Los podocitos primarios se rasparon con 80 ml de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación que contenía fosfatasa e inhibidor de proteasa. La concentración de proteínas se midió con el kit de ensayo de proteínas BCA (Merck Biochemistry, 71285). Se sometieron a electroforesis veinte microgramos de proteínas en gel prefabricado Criterion XT (12 por ciento Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Thermo Fischer Scientific, 88518). Después de bloquear en leche al 5 % en Tris Buffer Saline 0,1 % Tween (TBS-T), las membranas se incubaron con anti-LC3 policlonal de conejo (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), anti-ATG5 policlonal de conejo (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), antisecuestrosoma 1 policlonal de conejillo de indias (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), dominio IV de anticalpaína 1 policlonal de conejo (1:1000, Abcam, ab39170 ), anti–calpaína 2 policlonal de conejo, extremo amino-terminal del dominio I (1:1000, Abcam, ab39165), anti–calpaína 4 monoclonal de IgG1 de ratón (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), conejo anticuerpo antipodocina (1:1000, Abcam, ab50339), antinefrina de cobayo (1:500, PROGEN, GP-N2) y anticuerpo monoclonal antitubulina de rata (1:5000, Abcam,ab6160). Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpo ligado a peroxidasa de rábano picante (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). La detección de señales específicas se realizó utilizando el kit quimioluminiscente ECL (Bio-Rad, 170-5070) en el dispositivo LAS 4000 (Fuji). Para la cuantificación se utilizó el análisis de densitometría con el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud).
Mediciones de presión arterial y evaluaciones fisiológicas
La presión arterial sistólica de los ratones se registró utilizando el método de manguito de cola (Visitech Systems Inc., BP-2000). Se tomaron diez medidas de cada ratón y luego se determinó un valor medio. La presión arterial sistólica se midió al inicio (12 semanas de edad) y luego semanalmente hasta el final del período de tratamiento. Todos los ratones se colocaron en jaulas metabólicas con libre acceso al agua para una recolección de orina de 6- horas. Las concentraciones de creatinina urinaria y urea plasmática se analizaron espectrofotométricamente utilizando un método colorimétrico (Olympus, AU400). La excreción de albúmina urinaria se midió utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas específico para la determinación cuantitativa de albúmina en orina de ratón (Crystal Chem, 80630).
Histología
Riñonesfueron cosechados y fijados en formalina tamponada con PBS al 4 por ciento. Las secciones incluidas en parafina (3-mm de espesor) se tiñeron con estricromo de Masson para evaluar la morfología renal. Las anomalías en los riñones se clasificaron según la presencia y la gravedad de las anomalías de los componentes, incluida la glomeruloesclerosis, la expansión mesangial, la atrofia tubular o los cilindros y la fibrosis. La proporción de glomérulos escleróticos se evaluó mediante un examen ciego de al menos 50 glomérulos porriñónsección.
Tinción de inmunofluorescencia de secciones de riñón y podocitos primarios
Los podocitos primarios fijos se bloquearon en TBS-T al 3 por ciento de albúmina sérica bovina y se incubaron durante la noche a 4 grados con anticuerpos primarios de cobayo anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) y conejo anti -proteína fluorescente FL verde (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Después de los enjuagues con TBS-T, anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo FL, anticuerpo conjugado con IgG AF de burro anti-conejillo de indias594- (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) y anticuerpo conjugado con IgG AF de burro anti-conejillo de indias488- ( Se aplicó Invitrogen, A21206). Las imágenes se tomaron con un microscopio fluorescente Zeiss de 2 pies, una cámara AxioCam HR y el software Axiovision 4.3.
Para fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE)riñones, las secciones (3 mm) se desparafinizaron e hidrataron y la recuperación del antígeno se realizó en tampón de citrato calentado (pH 6). Luego, las secciones se permeabilizaron con Triton 0.1 por ciento (Euromedex) y se bloquearon en TBS-T al 3 por ciento de albúmina de suero bovino antes de la incubación de anticuerpos durante la noche a 4 C. Usamos anti-nefrina de cabra (1: 100, PROGEN, GP -N2), anti-SQSTM1/P62 de cobaya (1:1000, PROGEN, GP-62C), anti-GFP de conejo (1:1000, Abcam, ab290), anti-Podocalyxin de cabra (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556), y anticuerpo anti-Tumor de Wilms 1 de conejo (WT1;1:100, Abcam, ab192). Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpos conjugados Alexa488 y Alexa 568 de Invitrogen. Los núcleos se tiñeron de azul usando Hoechst. Los portaobjetos se montaron utilizando un medio de montaje fluorescente (Dako, S3023). Las fotomicrografías se tomaron con un fotomicroscopio Zeiss Axiophot y el software Axiovision. Se usaron cuantificaciones semiautomáticas en Fiji para la cuantificación de áreas positivas para nefrina y PODXL+ por sección glomerular en al menos 30 glomérulos por ratón. El número de podocito se contó como el número de núcleos WT1+ por sección glomerular en al menos 30 glomérulos por ratón.
Procedimiento de microscopía electrónica de transmisión.
Se fijaron pequeños fragmentos de la corteza renal (1 mm3) en grado de glutaraldehído al 3 por ciento (Electron Microscopy Sciences) durante 1 a 30 días y se lavaron tres veces en PBS. Las muestras se posfijaron en tetróxido de osmio al 1 por ciento 0,1 M (Electron Microscopy Science) en PBS 0,1 M (pH 7,4) y se lavaron con agua. Las muestras se deshidrataron en grados alcohólicos y óxido de propileno al 100 por ciento (Electron Microscopy Science). La infiltración de resina se realizó de la siguiente manera: mezcle Epikote 812 y óxido de propileno en una proporción de 1:1 durante 30 minutos, seguido de una mezcla de Epikote 812 y óxido de propileno en una proporción de 1:2 durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se incrustaron en cápsulas de gelatina de 4 mm en 100 % Epikote 812 y se polimerizaron en un horno calentado a 60 °C. Se cortaron secciones ultrafinas con un ultramicrótomo UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) y se depositaron en malla Gilder Grids 200 (Electron Microscopy Science). Se contrastaron con acetato de uranilo al 7 por ciento (LFG Distribution) y citrato de plomo de Reynold (LFG). Las muestras se examinaron en el microscopio electrónico de transmisión JEM1011 (JEOL) con la cámara CCD Orius SC1000 (Gatan), operada con el software Digital Micrograph (Gatan) para la adquisición.
Cistanche-enfermedad renal
Matriz de reacción en cadena de polimerasa cuantitativa
Los glomérulos recién aislados se congelaron en reactivo QIAzol Lysis (Qiagen) a -80 grados. La extracción de ARN total utilizando el método basado en fenol se procesó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los cDNA se sintetizaron con el kit RT2 First Strand (Qiagen, 330401) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real se realizó con un Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) con RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Las placas de PCR cuantitativa se corrieron en un ciclador Applied Biosystems StepOnePlus. Cada matriz contiene control de calidad para la eficiencia de la transcripción inversa y la contaminación del ADN genómico. El análisis de PCR cuantitativo se realizó mediante el método 2-DDCT con la ayuda del Centro de análisis de datos GeneGlobe (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) y expresó como el cambio de veces Log2 en la expresión génica.
Análisis proteómico in silico
La predicción in silico del sitio de escisión de la calpaína se realizó con DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) y CaMPDB (http:// calpain.org/) herramientas en línea. La secuencia de aminoácidos de la proteína de ratón se obtuvo de Uniprot (https://www.uniprot.org). Los resultados se resumen en las tablas complementarias S1 y S2.
Análisis estadístico
Todos los gráficos representan valores individuales y media ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando el software GraphPad Prism, versión 9. La comparación entre los 2 grupos se realizó usando una prueba t de Student paramétrica cuando las muestras pasaron las pruebas de normalidad de Anderson-Darling y D'Agostino y la prueba F para igualdad de varianza. En caso contrario, se utilizó una prueba no paramétrica de Mann-Whitney. La comparación entre múltiples grupos se realizó utilizando un análisis de varianza de 1-modo o 2-modo seguido de una prueba de comparación múltiple con la corrección de Simak. Los valores de P < 0.05="" se="" consideraron="" significativos.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
Figura 1|La hipertensión inducida por la dieta rica en sal (HSD) por angiotensina II (AngII) D inhibe laautofagia. (a–c) Inmunofluorescencia de Podocalyxin (PODXL; rojo) y P62 (verde) en glomérulos (a,a0 ) de ratones de tipo salvaje (WT), (b,b0 ) de Ratones WT después de 6 semanas de AngII þ HSD, y (c,c0 ) de ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox que muestran la acumulación de P62 en podocitos durante la hipertensión y en ATG específico de podocitos{{1{{12 }}}}ratones deficientes. Las puntas de flecha indican puntos P62+ en WT en (a0). Los núcleos se contrastaron con Hoechst (azul). Las subpartes de la figura con prima indican mayor aumento. Barras=50 mm. d) Cuantificación asociada del área P62þ expresada como porcentaje del área glomerular. ratones n=4 WT y ratones n=5 WT con AngII þ HSD y ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Prueba de Mann-Whitney: *P=0.0159. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.riñón-internacional.org.
RESULTADOS
La hipertensión inducida por la dieta alta en sal AngII D inhibió la autofagia de los podocitos
Los podocitos presentan un alto nivel deautofagiain vivo, como lo demuestra la fuerte expresión de GFP en ratones transgénicos con fusión de GFP a LC3 (ratones GFP-LC3), un marcador clave de la autofagia (Figura complementaria S2A). La autofagia es un proceso dinámico con la formación constante de autofagosomas y la degradación de los autofagolisosomas. El bloqueo de la degradación autofagosomal con cloroquina resultó en la acumulación de puntos GFP+, lo que indica un alto flujo autofágico en los podocitos (Figuras complementarias S2A y B). La confirmación de que los puntos GFP+ eran autofagosomas se mostró mediante inmunofluorescencia FL doble para GFP y SQSTM1/P62, una proteína chaperona degradada porautofagia(Figura complementaria S2C y D). Una vez más, el tratamiento con cloroquina indujo la acumulación de puntos GFP+ P62+, demostrando un importante flujo autofágico en los podocitos. Finalmente, se conservó un alto flujo autofágico in vitro, como lo demuestra la expresión de GFP y P62 en podocitos primarios aislados de ratones GFP-LC3 y una fuerte acumulación de puntos GFP+ y P62+ bajo el tratamiento con bafilomicina A1, otro bloqueador de la degradación autofagosómica (Figura complementaria S2E-H) .
Luego se evaluó la capacidad de la hipertensión para modular las respuestas autofágicas de los podocitos en ratones infundidos con AngII con una dieta alta en sal (HSD) durante 6 semanas y en controles no hipertensos. Como se muestra en la Figura 1, AngII + HSD indujo la acumulación de P62 en los glomérulos con una fuerte acumulación en los podocitos, lo que sugiere que AngII + HSD fue responsable de la acumulación de P62 en los podocitos.autofagiabloqueo (Figura 1a-d). Curiosamente, la acumulación de P62 en los podocitos fue similar a la observada en ratones deficientes para la autofagia de los podocitos (ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox). En otro modelo de hipertensión, el modelo DOC-sal, también observamos una acumulación progresiva de P62 en los podocitos a lo largo del curso de la enfermedad (Figura complementaria S3).
La eliminación de Atg5 específicamente en los podocitos da como resultado un aumento de la albuminuria, pérdida de podocitos y lesión glomerular en el modelo AngII D HSD
Luego examinamos siautofagiael bloqueo solo en podocitos (ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox) afecta la lesión glomerular en el modelo AngII þ HSD. Primero confirmamos que Nphs2. Los ratones cre Atg5lox/lox tenían presión arterial normal, normalriñóny sin lesiones histológicas glomerulares hasta los 10 meses de edad, como se informó anteriormente (Figura complementaria S4).32 Luego, Atg5lox/lox (WT) y Nphs2. A los ratones cre Atg5lox/lox se les infundió AngII con HSD durante 6 semanas. Es importante destacar que la presión arterial sistólica fue similar en los 2 grupos después de la infusión de AngII durante el curso del estudio (Figura 2a), aunque el método de manguito de cola utilizado para medir la presión arterial podría no tener la capacidad de resolver pequeñas diferencias de presión arterial. La infusión de AngII con HSD aumentó notablemente la proporción de albúmina a creatinina urinaria en ratones WT, y este efecto aumentó significativamente en ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox (Figura 2b). Los ratones Nphs2.cre Atg5lox / lox hipertensos también mostraron un aumento significativo de la esclerosis glomerular en comparación con los compañeros de camada WT (Figura 2c-e). De acuerdo con la proteinuria medida, los cilindros proteináceos y la dilatación tubular fueron significativamente más frecuentes en ratones con deficiencia de podocitos en ATG5 (Figura 2f-h).
Figura 2|La eliminación de Atg5 específicamente en los podocitos da como resultado un aumento significativo de la albuminuria,riñónlesión y pérdida de podocitos después de 6 semanas de infusión de angiotensina II (AngII) D dieta alta en sal (HSD). ( a ) Presión arterial sistólica en ratones Atg5lox / lox y Nphs2.cre Atg5lox / lox durante 36 días de AngII þ HSD. n=9 ratones por genotipo. Los valores se presentan como media ± SEM. Análisis de varianza bidireccional (ANOVA): ns. En (b–m), n=10 ratones por genotipo. En (b, g, h, k), los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. (b) AngII + HSD (continuación)
Figura 2|(continuación) resultó en un aumento dramático de la albuminuria en Nphs2. cre ratones Atg5lox/lox en comparación con ratones de control Atg5lox/lox. ANOVA bidireccional: genotipo, P=0.013; tiempo, P=0.0018. ( c – f ) Imágenes representativas de secciones de glomérulos teñidas con tricrómico de Masson del control Atg5lox / lox y ratones Nphs2.cre Atg5lox / lox después de 6 semanas de AngII þ HSD. Barras=50 mm en (c,d). Barras=100 mm en (e,f). ( g, h ) Comparación ( g ) de la proporción de glomérulos escleróticos y ( h ) del número de cilindros tubulares por campo microscópico. Prueba de Mann-Whitney: **P=0.0026 en (h), ***P=0.0003 en (g). (i, j) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión del tumor de Wilms 1 (WT1; rojo) y podocalyxina (PODXL; verde) en glomérulos de ratones control Atg5lox/lox y Nphs2.cre Atg5lox/lox después de AngII þ HSD durante 6 semanas. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barras=50 mm. ( k ) Cuantificación del número de células WT1+ por sección glomerular. Prueba de Mann-Whitney: **P=0.0029 en (l,m). Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de CD44 (verde) en glomérulos de control Atg5lox/lox y ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox después de AngII þ HSD durante 6 semanas. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barras=50 mm. (n, o) Fotomicrografías de microscopía electrónica de transmisión representativas de secciones de glomérulos de control Atg5lox/lox y ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox después de AngII þ HSD durante 6 semanas, que muestran borramiento del proceso del pie de podocitos (puntas de flecha) en Nphs2 hipertensos. cre ratones Atg5lox/lox. Barras=1 mm. n=3 ratones por genotipo. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.kidney-international.org.
Figura 3|Expresión y actividad de calpaína en podocitos. (a) Análisis de transferencia Western de la expresión de calpaína-1, calpaína-2 y calpaína-4 en podocitos primarios. La expresión de tubulina sirve como normalización. (b) La actividad de calpaína se midió en podocitos primarios tratados o no tratados con angiotensina II (AngII; 100 nM) durante 24 horas con o sin calpeptina (10 mM). n=5 experimentos independientes. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Análisis de varianza de una vía (ANOVA): tratamiento, P=0.0035. Prueba de comparación múltiple de Sidak: *P=0.0128 para AngII frente al valor inicial, ##P=0.0056 para AngII + calpeptina frente a AngII. ( c ) La actividad de calpaína se midió en podocitos primarios de tipo salvaje (WT) ocalpastatinaratones transgénicos (CSTTg) tratados o no tratados con AngII (100 nM) durante 24 horas. n=7 experimentos independientes. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. ANOVA de dos vías emparejado para el tratamiento: genotipo, P=0.0483. Prueba de comparación múltiple de Sidak: ***P=0.0009 para WT AngII versus línea base, *P=0.0420 para CSTTg AngII versus línea base, #P=0.0424 para WT versus CSTTg AngII. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.riñón-internacional.org.
El número de podocitos por glomérulo disminuyó significativamente en Nphs2. cre Ratones Atg5lox/lox tratados con AngII þ HSD (Figura 2i–k). La lesión de podocitos en ratones Nphs2.cre Atg5lox/lox con infusión de AngII + HSD incluso progresó a glomeruloesclerosis focal y segmentaria como se muestra por la expresión del marcador de activación de células epiteliales parietales (PEC) CD44 en glomérulos (Figura 2l y m). El análisis de microscopía electrónica identificó cambios significativos asociados con la deficiencia de ATG5 tras la infusión crónica de AngII con HSD, incluido el borramiento del proceso del pie en Nphs2 hipertensos. cre ratones Atg5lox/lox. Por el contrario, se encontraron pocos defectos ultraestructurales en podocitos de ratones WT incluso después de 10 semanas de infusión de AngII con HSD (Figura 2n y o), lo que indica que se requiere la actividad autofágica de los podocitos para su resistencia al daño inducido por AngII + HSD. En conjunto, nuestros resultados indicaron que en el modelo AngII þ HSD,autofagiala inhibición agrava la lesión y pérdida de podocitos e induce una glomeruloesclerosis focal y segmentaria subsiguiente.
AngII D HSD activa la actividad de la calpaína en los podocitos que contribuye al bloqueo de la autofagia
Como se encontró que la actividad de la calpaína (i) es activada por AngII en varios tipos de células y (ii) escinde variasautofagia-proteínas relacionadas,53 nos preguntamos si el bloqueo de la autofagia mediado por AngII þ HSD podría atribuirse al aumento de la actividad de calpaína inducida por AngII. Primero encontramos que los podocitos primarios expresaban las 3 formas ubicuas de calpaínas (Figura 3a). Luego mostramos que AngII estimulaba la actividad de la calpaína en los podocitos primarios. Este aumento de la actividad de la calpaína fue bloqueado por un inhibidor selectivo de la calpaína (Figura 3b). Utilizamos un ratón knock-in concalpastatinaexpresión transgénica (que conduce a una disminución de la actividad de calpaína)43 para evaluar el papel de las calpaínas en AngII þ HSD mediada porriñónlesiones y bloqueo de la autofagia. Los podocitos primarios de ratones CSTTg mostraron una actividad de calpaína disminuida en respuesta a AngII en comparación con los podocitos de ratones de control (Figura 3c). De este modo,calpastatinala sobreexpresión en podocitos disminuyó la activación de calpaína mediada por AngII.
A continuación evaluamosautofagianiveles en podocitos de ratones CSTTg. Generamos ratones CSTTg con el transgén GFP-LC3. El reportero LC3-GFP permitió contar los autofagosomas como puntos GFP+/P62+. P62 se acumulará en agregados en las células cuando se bloquee la salida autofágica. En el estado basal, contamos menos puntos GFP+ P62+ (Figura 4a, b y e) y menos acumulación de P62 (Figura 4c, d y f) en podocitos de ratones CSTTg GFP-LC3 que en podocitos de ratones normales GFP-LC3 , lo que sugiere un aumento del flujo autofágico en podocitos de ratones con alta abundancia de calpastatina.
Figura 4|Evaluación del eflujo autofágico en podocitos decalpastatinaratones transgénicos (CSTTg). (a,b) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de la proteína fluorescente FL verde (GFP) (verde) y P62 (rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 de 12-semanas de edad. Las puntas de flecha indican autofagosomas GFPþ P62þ. (c, d) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de P62 (verde) y Podocalyxin (PODXL; rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 de 12- semanas de edad. Las subpartes de la figura con prima indican mayor aumento. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barras=50 mm. (e) Cuantificación del número de puntos LC3+P62+ por podocito. Prueba de Mann-Whitney: **P= 0.0065. (f) Cuantificación del área de P62þ por sección glomerular. Prueba de Mann-Whitney: *P=0.0420. En (e,f), n=5 ratones GFP-LC3 y n=8 ratones CSTTg GFP-LC3. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.riñón-internacional.org.
El flujo de salida autofágico se puede controlar mediante la medición de la conversión de la forma citoplásmica de LC3, LC3-I, a la forma acoplada a fosfatidiletanolamina y escindida autofagosómica de LC3, LC3-II, en el Western blot . Los podocitos de ratones CSTTg mostraron una mayor conversión de LC3-I a LC3-II y una disminución de la expresión de P62, tanto en presencia como en ausencia de bafilomicina A1 (Figura 5a yb), lo que indica un aumento del flujo autofágico en podocitos con sobreexpresión de calpastatina. Finalmente, la acumulación de puntos GFP+P62+ en podocitos después de la administración de cloroquina fue más importante en ratones CSTTg GFP-LC3 que en ratones GFP-LC3, lo que confirma quecalpastatinala sobreexpresión induce la salida autofágica en podocitos in vivo (Figura 5c-e). En conjunto, nuestros datos sugieren que AngII estimula la actividad de la calpaína en los podocitos, queautofagiaes inhibida por la calpaína en los podocitos, y que la inhibición de la actividad de la calpaína endógena por la sobreexpresión de calpastatina es suficiente para estimular la salida autofágica en los podocitos.
Los ratones CSTTg están protegidos de la lesión de podocitos inducida por AngII D HSD
Los ratones CSTTg no mostraron ningunariñónalteración hasta al menos 12 meses de edad (Figura complementaria S5). Analizamos la lesión de podocitos en ratones CSTTg durante el tratamiento con AngII þ HSD. Aunque los ratones WT desarrollaron glomeruloesclerosis leve y lesión de podocitos después de 4 semanas de hipertensión, como lo demuestra la expresión anormal de podocalixina y nefrina, los ratones CSTTg presentaron menos lesiones glomerulares escleróticas (Figura 6a yb) y conservaron la expresión de podocalixina y nefrina (Figura 6c-h) . Tales diferencias en el fenotipo de los podocitos se observaron en una etapa en la que la densidad de los núcleos de los podocitos no era diferente entre los ratones WT y CSTTg hipertensos (Figura 6i-k).
Figura 5|El bloqueo de la degradación autofagosómica confirmó un aumento del flujo autofágico de podocitos encalpastatinaratones transgénicos (CSTTg). ( a ) Análisis de transferencia Western de la expresión de LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1) / P62 y ATG5 en podocitos primarios de ratones de tipo salvaje (WT) o CSTTg. La expresión de tubulina sirve como normalización. Los podocitos se trataron o no con bafilomicina A1 (BafA1; 100 nM) durante 4 horas antes de la detención del cultivo. (b) Cuantificación de las relaciones LC{{10}}II/tubulina y P62/tubulina. n=10 ratones WT y n=8 ratones CSTTg. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Análisis de varianza bidireccional apareado para el tratamiento: para LC3-II/tubulina: genotipo, P=0.{{30}}008; tratamiento, P < 0,0001;="" para="" p62/tubulina:="" genotipo,="" p="0.0884;" tratamiento,="" p="">< 0,0001.="" prueba="" de="" comparación="" múltiple="" de="" sidak:="" para="" lc3-ii/tubulina:="" ***p="">< 0,0001="" para="" wt="" más="" bafa1="" frente="" a="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" para="" csttg="" más="" bafa1="" frente="" a="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" para="" wt="" þ="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1;="" para="" p62/tubulina:="" ***p="">< 0,0001="" para="" wt="" más="" bafa1="" versus="" wt="" +="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" para="" csttg="" más="" bafa1="" versus="" csttg="" +="" bafa1.="" (="" c,="" d="" )="" imágenes="" de="" inmunofluorescencia="" representativas="" de="" la="" expresión="" de="" la="" proteína="" fluorescente="" fl="" verde="" (gfp;="" verde)="" y="" p62="" (rojo)="" en="" glomérulos="" de="" ratones="" gfp-lc3="" y="" csttg="" gfp-lc3="" de="" 12-="" semanas="" de="" edad.="" las="" subpartes="" de="" la="" figura="" con="" prima="" indican="" mayor="" aumento.="" los="" núcleos="" se="" tiñeron="" con="" hoechst="" (azul).="" barras="50" mm.="" los="" ratones="" se="" trataron="" con="" cloroquina="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" horas="" antes="" de="" sacrificarlos.="" las="" puntas="" de="" flecha="" indican="" autofagosomas="" gfpþ="" p62þ.="" (e)="" cuantificación="" del="" número="" de="" puntos="" lc3+p62+="" por="" podocito.="" n="5" ratones="" por="" genotipo.="" los="" valores="" se="" presentan="" como="" parcelas="" individuales="" y="" la="">±SEM. Prueba t no pareada con SD igual: *P=0.0302. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.riñón-internacional.org.
Figura 6 |calpastatinala sobreexpresión previene la lesión de los podocitos mediada por la angiotensina II (AngII) D en la dieta alta en sal (HSD). (a,b) Imágenes representativas de secciones de glomérulos teñidas con tricrómico de Masson de ratones de tipo salvaje (WT) y transgénicos con calpastatina (CSTTg) después de 6 semanas de AngII þ HSD. Barras=50 mm. (c, d, f, g) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de (c, d) podocalyxina (PODXL) y (f, g) nefrina (NPHS1) en ratones WT y CSTTg después de 6 semanas de AngII þ HSD y (e ,h) cuantificaciones asociadas. Barras=50 mm. (i,j) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión del Tumor 1 de Wilms (WT1; verde) y PODXL (rojo) en glomérulos de ratones WT y CSTTg después de 6 semanas de AngII þ HSD y (k) cuantificación asociada del número de WT1þ células por sección glomerular. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barras=50 mm. En (e,h,k), los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. n=9 ratones WT y n=7 ratones CSTTg. Prueba t no pareada con SD igual: **P=0.0095 en (e), *P=0.0249 en (h), P=0.7891 en (k). Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.riñón-internacional.org.
De manera similar, después de 6 semanas de hipertensión, los ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 presentaron lesiones en los podocitos, pero las lesiones fueron más prominentes en los ratones GFP-LC3 (Figura 7). La proporción de albúmina a creatinina en orina fue mayor en ratones GFP-LC3 después de 4 semanas de AngII + HSD (Figura 7a). El número de podocitos no fue diferente entre los 2 genotipos, pero la expresión de nefrina disminuyó significativamente más en ratones GFP-LC3 (control) (Figura 7b-e). Correlacionando concalpastatinamediada por la protección, el análisis ultraestructural mostró un borramiento leve y focal del proceso del pie de los podocitos en ratones GFP-LC3 tratados con AngII þ HSD con una mejor conservación del borramiento del proceso del pie en ratones CSTTg, aunque la cuantificación global del número de procesos del pie por base glomerular la longitud de la membrana (GBM) no fue estadísticamente diferente, probablemente porque la lesión de los podocitos es focal y segmentaria en nuestro modelo (Figura 7f-h). Cabe destacar la infiltración de macrófagos y linfocitos T enriñonesno fueron diferentes entre los grupos (Figura complementaria S6). En conjunto, estos resultados demostraron quecalpastatinaprevino la lesión de podocitos inducida por AngII þ HSD.
La sobreexpresión de calpastatina restaura la salida autofágica en podocitos de ratones después del tratamiento con AngII D HSD
Finalmente, nos preguntamos sicalpastatina-La protección glomerular mediada en el modelo AngII þ HSD implicó el mantenimiento de la autofagia en los podocitos. Curiosamente, la acumulación de P62 inducida por AngII þ HSD en los podocitos se evitó en ratones CSTTg y GFP-LC3 CSTTg (Figura 8a-d), lo que indica que la calpastatina evitó el bloqueo de los podocitos.autofagia. Es de destacar que el número de puntos GFP+P62+ marcados de autofagosomas fue similar en podocitos de ratones hipertensos GFP-LC3 y GFP-LC3 CSTTg, lo que sugiere que AngII+ HSD indujo una desaceleración de la salida autofágica de podocitos en lugar de una detención completa (Figura 8e– gramo).
Predicción in silico del sitio de escisión de calpaína en proteínas de podocitos
Utilizamos varias herramientas in silico para predecir objetivos potenciales de calpaína en podocitos (Tablas complementarias S1 y S2). Se compararon tres bases de datos en línea: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 y DeepCalpain.56 El análisis in silico identificó varias proteínas de podocitos, nefrina y podocina entre ellas, que podrían ser escindidas por calpaínas. De este modo,calpastatina-la protección glomerular mediada podría estar relacionada con una reducción de la actividad enzimática de la calpaína, lo que lleva a una reducción de la degradación de algunas proteínas de los podocitos.
Además, al menos 3autofagiaLas proteínas relacionadas son dianas directas de las calpaínas. ATG5 es escindido por las calpaínas, lo que provoca una alteración en la formación del complejo ATG12-ATG5.57,58 La administración de inhibidores de calpaína in vivo también impidió la escisión de la proteína de autofagia Beclin-1.59 El análisis in silico de el sitio de división putativo en las proteínas relacionadas con la autofagia respalda la hipótesis de que la calpaína podría regular la autofagia a través de la división enzimática de las proteínas de la autofagia.
Cistanche-función renal
Expresión de ARNm de retículo endoplásmico (ER) y marcadores de estrés oxidativo en glomérulos de ratones tratados con AngII más HSD
Evaluamos el estrés del retículo endoplásmico (ER) y el estrés oxidativo mediante PCR cuantitativa en glomérulos durante el tratamiento con AngII + HSD (Tabla 1). Al inicio del estudio, no observamos ningún cambio en la expresión del ARNm de los genes analizados en los glomérulos de ratones WT y Nphs2.cre Atg5lox/lox (Figura complementaria S7). Después de 6 semanas de hipertensión, los glomérulos de Nphs2. Los ratones cre Atg5lox/lox mostraron un perfil de ARNm diferente de los genes de las vías de estrés oxidativo y estrés ER con una mayor expresión de Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 y Hsp90b1 en comparación con los glomérulos WT, lo que sugiere queautofagiael agotamiento en los podocitos favoreció el estrés oxidativo y el estrés oxidativo inducido por AngII þ HSD. Por el contrario, los glomérulos de ratones CSTTg presentaron una regulación a la baja de varios genes de las vías de estrés oxidativo y estrés ER, así como una expresión disminuida de algunos genes proapoptóticos (Figura 9).
En conjunto, estos resultados indican quecalpastatinala sobreexpresión podría prevenir la lesión glomerular al reducir la ER inducida por AngII þ HSD y el estrés oxidativo.
DISCUSIÓN
En el presente estudio, demostramos que en la hipertensión inducida por AngII þ HSD, la autofagia de los podocitos está marcadamente regulada a la baja. Además, los ratones con eliminación específica de podocitos de Atg5 eran más propensos a la glomeruloesclerosis inducida por AngII þ HSD y la pérdida de podocitos, lo que demuestra queautofagiaen podocitos previene el desarrollo de nefropatía hipertensiva, destacando el papel crítico de la autofagia en la lesión de podocitos inducida por AngII þ HSD. Poco se sabe sobre los estímulos extracelulares que regulan la autofagia celular, y estos resultados arrojan luz sobre la regulación fisiopatológica de la autofagia de podocitos por AngII.
En la mayoría de las glomerulopatías humanas, el borramiento del pie de los podocitos es un sello distintivo de la lesión glomerular que conduce a la proteinuria. Es probable que la autofagia desempeñe un papel esencial en el mantenimiento de la función de los podocitos porque estas células diferenciadas terminalmente muestran altas tasas deautofagiaincluso en ausencia de estrés. Un estudio anterior mostró que AngII promueve la autofagia a través de la generación de especies reactivas de oxígeno en una línea celular de podocitos murinos condicionalmente inmortalizados. poco claro. A diferencia de este último estudio, utilizamos podocitos de cultivo primario murino que retienen la expresión de podocina y nefrina y enfoques in vivo y no líneas celulares murinas. Confirmamos informes anteriores de que los podocitos posmitóticos exhiben un nivel inusualmente alto deautofagia. La medición del aumento de la cantidad de LC3-II después de la estimulación con AngII en presencia o ausencia de inhibidores lisosomales es necesaria para determinar si la salida autofágica aumenta o se bloquea. Estudios previos han descuidado este fenómeno.60
Figura 7 |calpastatinala sobreexpresión previene la lesión de podocitos mediada por la dieta rica en sal (HSD) de angiotensina II (AngII) D en ratones con proteína fluorescente FL verde (GFP)-LC3. (a) AngII þ HSD resultó en un aumento dramático de la albuminuria en ratones GFP-LC3 en comparación con ratones CSTTg (transgénicos con calpastatina) GFP-LC3. n=8 a 13 ratones por genotipo. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Análisis de varianza bidireccional: genotipo, P=0.0429; tiempo, P=0.0165. Prueba de comparación múltiple de Sidak: *P=0.0453 para ratones GFP-LC3 versus CSTTg GFP-LC3 en el día 28. (b,c) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión del Tumor 1 de Wilm (WT1; verde) y nefrina (NPHS1) (rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 de 18-semanas de edad después de 6 semanas de infusión de AngII + HSD. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barras=50 mm. Cuantificación de (d) área de NPHS1+ por sección glomerular y (e) el número de células WT1+ por sección glomerular en ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 de 18-semanas de edad después de 6 semanas de infusión de AngII + HSD. n=19 ratones GFP-LC3 y n=25 ratones CSTTg GFP-LC3. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Prueba t no pareada con SD igual: **P=0.0010 en (d), P= 0.1158 en (e). ( f, g ) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de glomérulos de ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 después de 6 semanas de AngII þ HSD. Las puntas de flecha indican el borramiento del proceso del pie. Barras=1 mm. ( h ) Cuantificación del número de procesos del pie por micrómetro de membrana basal glomerular (GBM). n=3 ratones por genotipo. Los valores se presentan como parcelas individuales y SEM medio. Cada gráfico representa el número medio de podocitos por micrómetro de GBM en 1 longitud continua de GBM. Prueba t no pareada con SD igual: P=0.7512. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.riñón-internacional.org.
Aquí, utilizamos un modelo hipertensivo basado en perfusión AngII y HSD. Los podocitos exhiben receptores AT1 y están expuestos a péptidos filtrados libremente como AngII.13,16,26,61–65 Se supone que los efectos renoprotectores observados de la inhibición de RAAS podrían deberse, al menos parcialmente, a un bloqueo de este podocito. RAAS específico. Del mismo modo, los estudios in vivo confirmaron el efecto de AngII sobre la lesión de los podocitos y la selección de genes específicos de podocitos de AT1 demostraron que la activación de los receptores AT1 en el glomérulo en la nefritis lúpica experimental es suficiente para acelerarriñónlesión en ausencia de hipertensión.66,67 Mediada por calpaínaautofagiala desregulación en nuestro modelo podría estar relacionada con la señalización directa de AngII-AT1 en los podocitos o ser consecuencia de la hipertensión. Podemos proporcionar una respuesta temprana a esta pregunta. De hecho, en el modelo DOC-sal, también encontramos acumulación de P62 en podocitos de ratones hipertensos (Figura complementaria S3). Esto sugiere que el bloqueo de la autofagia ocurre en los podocitos en este modelo, que se supone que es independiente de AngII. de la autofagia de los podocitos depende de los efectos directos o indirectos de AngII.
Figura 8 |calpastatinala sobreexpresión previene la angiotensina II (AngII) D inducida por una dieta rica en sal (HSD)autofagiaRegulación a la baja en los podocitos. ( a, b ) Imágenes representativas de inmunofluorescencia de la expresión de P62 (verde) y Podocalyxin (PODXL; rojo) en glomérulos de proteína fluorescente FL verde (GFP) –LC3 y CSTTg (calpastatinatransgénicos) ratones GFP-LC3 después de 6 semanas de AngII þ HSD. Las subpartes de la figura con prima indican mayor aumento. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barras=50 mm. ( c, d ) Cuantificación del área de P62þ por sección glomerular. n=9 ratones de tipo salvaje (WT) y n=7 ratones CSTTg en (c), y n=16 ratones GFP-LC3 y n=16 ratones CSTTg GFP-LC3 en (d). Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Prueba de Mann-Whitney: **P=0.0033 en (c), **P=0.0011 en (d). ( e, f ) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de GFP (verde) y P62 (rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 después de 6 semanas de AngII þ HSD. Las subpartes de la figura con prima indican mayor aumento. Las puntas de flecha indican autofagosomas GFPþ P62þ. (g) Cuantificación del número de puntos LC3+P62+ por podocito. n=11 ratones GFP-LC3 y n=16 ratones CSTTg GFP-LC3. Los valores se presentan como parcelas individuales y media ± SEM. Prueba t no pareada con SD igual: P=0.1014. Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo en www.riñón-internacional.org.
Tabla 1|Matriz de PCR perfiladora RT2 personalizada
La calpaína-1 y la calpaína-2 son proteasas proinflamatorias ubicuas, cuya actividad está controlada porcalpastatina, su inhibidor específico. De hecho, la calpastatina inhibe selectivamente las calpaínas y ninguna otra proteasa hasta la fecha. La activación de calpaína se ha relacionado recientemente conriñónen varios contextos patológicos.69,70 Se encontró que el canal C6 del receptor potencial transitorio del transportador del canal de calcio activa la calpaína-1 en los podocitos a través de la activación de Ca2+/calcineurina. Los riñones de pacientes con glomeruloesclerosis focal y segmentaria tenían un aumento de la expresión del canal C6 del receptor potencial transitorio, un aumento de la actividad de la calpaína y la calcineurina, y una expresión reducida de la talina objetivo de la calpaína-1, que es fundamental para la estabilidad del citoesqueleto de los podocitos.71 Canal del receptor potencial transitorio C6 también se une directamente a calpain-1 y calpain-2. Esta interacción es crucial para la regulación de la escisión de talin-1 y la motilidad de control de los podocitos.72
Ratones transgénicos sobreexpresandocalpastatinaestán protegidos contra la remodelación vascular y la inflamación dependiente de AngII73; frente a la inflamación en modelos de glomerulonefritis,43 sepsis74 o rechazo del aloinjerto75; y contra la inflamación relacionada con la edad.76 No se ha explorado la lesión de los podocitos en estos ratones. Peltier et al. mostró que la sobreexpresión decalpastatinaprevino la inflamación perivascular dependiente de AngII en los riñones43. Por lo tanto, la protección renal en ratones CSTTg podría estar mediada, al menos parcialmente, por un mecanismo antiinflamatorio. Evaluamos la infiltración de macrófagos y linfocitos en nuestro modelo y no encontramos diferencias significativas enriñóninflamación entre CSTTg y ratones de control al analizar globalriñóninfiltración de leucocitos (Figura complementaria S6).
La calpaína estuvo involucrada recientemente en la regulación de la autofagia (revisada recientemente en Weber et al.53) con interesantes propiedades bioprotectoras de la inhibición de la calpaína en el contexto diabético a través de la restauración deautofagia.77 Aquí, informamos que la inhibición de calpaína a través decalpastatinala sobreexpresión (i) previno la lesión de los podocitos durante la hipertensión y (ii) restauró la autofagia en los podocitos, destacando así un nuevo papel nocivo de la activación de la calpaína durante la hipertensión a través de la inhibición deautofagia.
Casi todas las proteínas ATG demostraron ser escindidas por calpaínas in vitro. 78 Aquí postulamos queautofagiael mantenimiento en ratones CSTTg hipertensos estuvo mediado por la inhibición de la calpaína. Para respaldar nuestra hipótesis, mostramos que los podocitos de CSTTg tienen una actividad de calpaína disminuida cuando se los desafía con AngII in vitro (Figura 3c). Encontramos un aumento del nivel de proteína ATG5 en podocitos de ratones CSTTg, lo que sugiere que la sobreexpresión de calpastatina previno la escisión de ATG5 mediada por calpaína en este contexto (Figura 5a). Por el contrario, se demostró quecalpastatina-la inhibición mediada por calpaína podría ser independiente de la inhibición de su actividad proteasa79; por lo tanto, no pudimos excluir la regulación de la autofagia por calpastatina independiente de la actividad enzimática de calpaína.
En resumen, estos hallazgos revelaron un papel previamente no reconocido decalpastatinaen la regulación de podocitosautofagiay proporcionó una pista para la investigación de nuevas estrategias terapéuticas para mejorar la supervivencia de los podocitos durante las nefropatías hipertensivas.
DIVULGACIÓN
Todos los autores declararon no tener intereses en competencia.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) y la Université de Paris. El IB recibió el apoyo de una beca de posgrado del Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL fue financiado a través de un premio de la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (EFSD) apoyado por el Programa EFSD/Novo Nordisk para la Investigación de la Diabetes en Europa y una subvención de la Société Francophone duDiabète (SFD). BR y CH fueron financiados por la subvención inicial 107037 del Consejo Europeo de Investigación y la Unión Europea (P-LT). YS recibió el apoyo de una beca de posgrado de la Fondation de France.
Agradecemos a Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac y al equipo ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France) por su asistencia en el cuidado y manejo de animales, Nicolas Sorhaindo por las mediciones bioquímicas (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , París, Francia) y Alain Schmitt y Jean-Marc Masse para microscopía electrónica de transmisión (Institut Cochin, París, Francia). Agradecemos a Morgane Le Gall (instalación proteómica de Cochin 3P5, París, Francia) por su ayuda en el análisis in silico. Reconocemos el apoyo administrativo de Véronique Oberweis, Bruno Pillard y Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, París, Francia).
MATERIAL SUPLEMENTARIO
Archivo complementario (PDF)
Figura S1. El cultivo primario de podocitos expresa marcadores de podocitos. Análisis de transferencia Western de la expresión de los marcadores de podocitos NPHS1 y NPHS2 en cultivo primario de podocitos de ratones WT y CSTTg. La tubulina (TUBA) sirve como control de carga. Representante de n=4 ratones por genotipo.
Figura S2. El alto nivel basal de podocitosautofagia. (A, B) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de GFP (verde) y NPHS1 (rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 tratados o no con CQ (80mg/kg) 4 horas antes de matarlos. Las puntas de flecha muestran autofagosomas GFPþ. (C, D) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de GFP (verde) y P62 (rojo) en glomérulos de ratones GFP-LC3 tratados o no con CQ (80 mg/kg) 4 horas antes de matarlos. Las puntas de flecha muestran los autofagosomas GFPþ P62þ. (A–D) (0 ) representan mayor aumento. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barra=50 mm. N=4 ratones por condición (E–H) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de GFP (verde) y P62 (rojo) en podocitos primarios de ratones GFP-LC3 tratados (F, H) o no (E, G ) con Bafifilomicina A1 (100 nM) durante 4 horas. N=5 ratones por condición.
Figura S3. P62 se acumula en los podocitos en el modelo DOC-sal de hipertensión. (A–C) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de P62 (verde) y PODXL (rojo) en glomérulos de ratones WT después de 2 a 6 semanas del modelo DOC-sal. (0 ) representan un mayor aumento. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Barra ¼ 50 mm. (D) Cuantificación del área de P62 por área de podocitos (porcentaje). N=5–6 ratones por condición. Análisis de varianza unidireccional: tiempo P=0.0059, prueba de comparación múltiple de Sidak: D42 versus D14 **P=0.0055, D28 versus D14 P=0.8590.
Figura S4. Podocitoautofagiaes prescindible para el desarrollo de los podocitos. (A) Presión arterial sistólica, (B) proporción de albúmina a creatinina en orina y (C) niveles de nitrógeno ureico en sangre en ratones Atg5lox/lox y Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 ratones por genotipo. Los valores se presentan como parcelas individuales y medias.±SEM. Prueba de Mann-Whitney: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) y P=0.6623 (C). (D–E) Imágenes representativas de secciones de glomérulos teñidas con tricrómico de Masson de ratones Atg5lox/lox y Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F–G) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de PODXL (verde) y WT1 (rojo) en ratones Atg5lox/lox y Nphs2.cre Atg5lox/lox. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). (D–G) Barra=50 mm. N=6 ratones por genotipo. (H–I) Fotomicrografías representativas de secciones de microscopía electrónica de transmisión de glomérulos de ratones Atg5lox/lox y Nphs2.cre Atg5lox/lox. Barra=1 mm. N=3 ratones por genotipo.
Figura S5.calpastatinala sobreexpresión no influyeriñónfunción en la línea de base. (A) nitrógeno ureico en sangre y (B) niveles de albúmina en plasma en ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 de 12-semanas de edad. N=5 GFP-LC3 y N=6 CSTTg GFP-LC3. Los valores se presentan como parcelas individuales y medias.±SEM. Prueba de Mann-Whitney: P=0.6623 (A) y P=0.9307 (B). (C,D) Imágenes representativas de secciones de glomérulos teñidas con tricrómico de Masson de ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3. (E–H) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de la expresión de PODXL (E, F) y NPHS1 (G, H) en ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3. (C–H) Barra=50 mm. (I, J) Cuantificación asociada del área de PODXL y NPHS1 por sección glomerular. N=5 GFP-LC3 y N=6 CSTTg GFP-LC3. Los valores se presentan como parcelas individuales y medias.±SEM. Prueba de Mann-Whitney: P=0.1898 (A) y P=0.8413 (B).
Cistanche-función renal
Figura S6.calpastatinala sobreexpresión no influye en la inflamación renal global. Inmunohistoquímica representativa de la expresión de F4/80 (A, B) y CD3 (D–E) en ratones GFP-LC3 y CSTTg GFP-LC3 después de 6 semanas de Angiotensina II þHSD. Barra=200 mm. (C, F) Cuantificación asociada de área F4/80 y CD3 porriñónsección. Ratones N=7 CSTTg GFP-LC3 y N=8 GFP-LC3. Los valores se presentan como parcelas individuales y medias SEM. Prueba de Mann-Whitney: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Figura S7. Podocitoautofagiadeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Tabla S1. Previsión in silico de sitios de escisión de calpaína. Los sitios de escisión de calpaína se predijeron en proteínas relacionadas con podocitos y autofagia con GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP://calpain.org) y DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio.info/help.php). Archivo complementario (Excel)
Tabla complementaria S2. El archivo completo de predicción in silico de los sitios de escisión de calpaína. Los sitios de escisión de calpaína se predijeron en enfermedades relacionadas con podocitos yautofagiaproteínas relacionadas con GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) y DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Los sitios de división de predicción se reanudan para cada proteína para GPS-CCD y DeepCalpain Predict.
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