¿Puede el extracto de Cistanche Deserticola promover la respuesta inmune?

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Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

a Laboratorio clave de recursos biológicos e ingeniería genética de Xinjiang, Facultad de ciencias biológicas y tecnología, Universidad de Xinjiang, Urumqi, 830046, Xinjiang, China

b Key Lab of Medical Molecular Virology, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina de Shanghái, Universidad de Fudan, Shanghái, 200032, China

Relevancia etnofarmacológica:Los polisacáridos de hierbas han mostrado un gran potencial para mejorar el sistema inmunológico. Los adyuvantes son una herramienta clave para desarrollar vacunas eficaces. En nuestro estudio anterior, un polisacárido soluble en agua extraído de la naturalezaCistanchedeserticolaYC Ma mostró una potente actividad inmunoestimuladora.

Objetivo del estudio:En este estudio, los perfiles inmunes y la eficacia de los extractos acuosos de cultivosCistanchedeserticolaSe investigó YC Ma (AECCD) en ratones ICR contra ovoalbúmina (OVA). En experimentos in vitro se evaluó el posible mecanismo de activación de DC por AECCD.

Materiales y métodos:Los AECCD se extrajeron usando agua caliente, después de lo cual los polisacáridos brutos se precipitaron con etanol. Los ratones se inmunizaron en primer lugar por vía subcutánea con OVA (10 ug por ratón) solo u OVA (10 ug por ratón) que contenían respectivamente diferentes dosis de AECCD (200, 400 y 800 ug por ratón) en los días 1 y 14 y la magnitud y la cinética de Luego se evaluaron los anticuerpos y las respuestas mediadas por células.

Resultados:AECCD provocó respuestas IgG vigorosas y a largo plazo con respuestas mixtas Th1/Th2 y niveles regulados al alza de citocinas asociadas a Th (CD4 más IL-4, CD4 más IFN- y CD8 más IFN-). Por otra parte, AECCD indujo la fuerte celularinmunerespuestacaracterizada por una mayor proliferación de esplenocitos así como por la respuesta de células T activadas. En particular, AECCD mejoró significativamente la maduración de las células dendríticas (DC) e inhibió las Treg. Los experimentos in vitro, las pruebas preliminares indicaron que AECCD indujo la activación de DC al promover la maduración fenotípica, la sección de citoquinas y la actividad aloestimuladora. El receptor tipo Toll 4 (TLR4) era un receptor esencial para que las DC se unieran directamente a AECCD. Los inhibidores de NF-κB disminuyeron los niveles de expresión de CD40, CD80, CD86 y MHC-II y la producción de IFN-, TNF- e IL-6 a través de DCS.

Conclusiones:Finalmente, estos hallazgos sugirieron que el AECCD podría provocar un antígeno específico potente y duradero.inmunerespuestasa través de la activación de DC, que participó en la regulación de los marcadores de maduración y la expresión de citoquinas a través de la vía NF-κB relacionada con TLR4-. El estudio indica que AECCD es un inmunomodulador potencial.

Palabras clave:Adyuvante de polisacárido Cultivado,Cistanchedeserticola, Inmunomodulador, Células dendríticas Toll-like receptor 4, Vía de señalización NF-κB

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1. Introducción

Muchos estudios han sugerido que los adyuvantes pueden mejorar la eficacia de las vacunas contra diversas enfermedades infecciosas como el VIH, la COVID-19, la influenza y la fiebre aftosa (Cao et al., 2020; Giuseppe et al., 2018). ). Los adyuvantes pueden inducir diferentes tipos y magnitudes deinmunerespuestas, por lo que un adyuvante adecuadamente seleccionado puede inducir lainmunerespuestarequerido para un patógeno o antígeno dado (Reed et al., 2013). Los extractos herbáceos naturales se han utilizado ampliamente durante mucho tiempo en la vida diaria o en el cuidado de la salud. En muchos casos, la medicina tradicional china (MTC) y sus componentes activos, especialmente los múltiples adyuvantes derivados de polisacáridos de la MTC, mejoraron significativamente la eficacia de las vacunas. Los polisacáridos de la MTC (Advax™, polisacárido de Astragalus, polisacárido de Ginseng, polisacárido de Lycium barbarum y polisacárido de Ganoderma lucidum) tenían varias ventajas sobre otros adyuvantes, como una mejor seguridad, biocompatibilidad, fuerte mejora inmunológica y baja reactogenicidad (Li y Wang, 2015; Schijns et al., 2020). Los compuestos y formulaciones basados ​​en polisacáridos de TCM, por lo tanto, tienen potencial como candidatos adyuvantes.

Cistanche deserticolaYC Ma (Roucongrong en chino) es una medicina tradicional china registrada en la Farmacopea China y se ha utilizado como alimento tónico durante cientos de años en China (Comisión de la Farmacopea China, 1992). Estudios farmacológicos modernos han demostrado sus múltiples aplicaciones farmacológicas e inmunomoduladoras (Dong et al., 2007; Fu et al., 2017). En nuestro estudio anterior, los polisacáridos crudos derivados deCistanchedeserticolaYC Ma promovió las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno y reguló la maduración de las células dendríticas (DC) (Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019). Sin embargo, salvajeCistanchedeserticolaYC Ma ha sido excesivamente explorado y catalogado como especie en peligro de extinción.CistanchedeserticolaYC Ma se ha plantado a gran escala y se usa ampliamente en el desarrollo y aplicación de recursos de TCM. Sin embargo, el potencial adyuvante de los cultivosCistanchedeserticolaYC Ma aún no está claro.

Los DCS son reguladores esenciales contra las enfermedades infecciosas. Después de que se activan las DC, las moléculas de superficie y las citocinas proinflamatorias en las DC interactúan con los receptores correspondientes para activar las células T y provocar respuestas específicas de antígeno y la producción de citocinas que dirigen la adaptación.inmunerespuestas(Banchereau y Steinman, 1998). Se ha informado que el receptor tipo toll 4 (TLR4) en las CD funciona como un importante receptor de polisacáridos (Park et al., 2014; Qi et al., 2016). De hecho, muchos polisacáridos pueden interactuar directa o indirectamente con TLR4 en las CD para activar el factor nuclear kappa B aguas abajo (NF-κB), que puede inducir la expresión de varios genes proinflamatorios como IFN-, TNF- e IL{{11 }} y la respuesta inflamatoria para eliminar patógenos (Tian et al., 2019; Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2013). Por lo tanto, DCS y NF-κB se han estudiado ampliamente como objetivos potenciales para la terapia de enfermedades.

En el estudio, con la estrategia in vivo (ratones ICR), primero evaluamos los efectos inmunoestimuladores de extractos acuosos de cultivosCistanchedeserticolaYC Ma (AECCD) con diferentes dosis (baja, media y alta) para provocar unainmunerespuestacontra OVA y explicar la forma in vitro de activar las DC y las vías relacionadas con el receptor aguas abajo. Con un modelo de ratón, revelamos que AECCD promovió la respuesta de anticuerpos a largo plazo con mayores títulos de IgG y celular.inmunerespuesta. Es importante destacar que AECCD indujo citocinas asociadas a Th, especialmente la producción de IFN-, lo que condujo a la respuesta Th1 contra las infecciones. El efecto de inducción se correlacionó estrechamente con una mayor maduración de DC y una disminución de Tregs. Mecánicamente, AECCD promovió la activación de DC a través de la vía NF-κB relacionada con TLR4-. En resumen, el estudio confirmó la potente actividad adyuvante de AECCD en la promoción de la respuesta adaptativa. El estudio sentó las bases para el desarrollo de adyuvantes de polisacáridos AECCD.

2. Materiales y métodos

2.1. reactivos

Ovoalbúmina (OVA), 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT), polimixina B (PMB), concanavalina A (ConA), lipopolisacárido (LPS), mitomicina C y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) se obtuvieron de Sigma (EE. UU.). El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Biological Industries. El kit de recuento celular-8 (CCK-8) se adquirió de Biosharp (China). Los conjugados de cabra anti-ratón IgG/IgG1/IgG2a-HRP eran de Southern Biotech (EE.UU.). Inject Alum era de Thermo Scientific Pierce (EE. UU.). GM-CSF era de Peprotech (EE.UU.). Anticuerpos marcados con fluorescencia (anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD62L-PE, anti-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL-4-PE, anti–IFN– -PE, anti-CD86-APC, anti-CD40-FITC/PE, anti- CD11c-PE/FITC, anti-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm y Perm/Wash buffer fueron todos de BD Bioscience (EE. UU.). El kit de tinción de células T reguladoras era de eBiosciences (EE. UU.). TAK-242 era de MedchemExpress (Shanghai, China). PDTC era de Beyotime Biotechnology (China). El kit de ensayo de flujo de múltiples analitos era de Biolegend (EE. UU.).

2.2. Preparación de AECCD C. deserticola

(Un espécimen de comprobante No. CD10041602) fue identificado por el profesor Jiang He. El AECCD se obtuvo mediante extracción con agua, precipitación con etanol y el método de desproteinización con algunas modificaciones menores (Zhang et al., 2018). Brevemente, cultivadoCistanchedeserticolaprimero se extrajo con agua muchas veces y luego los polisacáridos crudos se precipitaron durante la noche agregando etanol según una relación de volumen de 1:4. Luego los polisacáridos crudos obtenidos fueron desproteinizados por el método Sevag (Liu et al., 2012). Se detectó que el contenido total de azúcar era del 76,82 por ciento con el método de antrona-ácido sulfúrico (Dubois et al., 1951).

2.3. Análisis espectroscópico infrarrojo

Con el fin de analizar los grupos funcionales orgánicos, se prensó AECCD con KBr en gránulos para la medición del espectro infrarrojo (IR). Los espectros IR de las muestras se determinaron entre 4000 y 400 cm−1.

Cistanchehierbaspromoverinmunerespuesta

2.4. Experimentos in vivo

2.4.1. Inmunización de animales

Ratones hembra C57BL/6 y ratones ICR (6 semanas de edad) de la Universidad Médica de Xinjiang (Urumqi, China) se aclimataron durante 3 días. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las normas del Comité de Ética de Experimentos con Animales del Laboratorio Clave de Recursos Biológicos e Ingeniería Genética de Xinjiang en la Universidad de Xinjiang (BRGE-AE001).

Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con OVA solo u OVA con diferentes concentraciones de AECCD y se reforzaron el día 14 de acuerdo con diferentes grupos de la siguiente manera (6 ratones en cada grupo): grupo de control (0, 9 por ciento NaCl), grupo OVA ( 10 ug OVA), grupo AECCD-H (AECCD 800 ug), grupo OVA/ AECCD-L (10 ug OVA, AECCD 200 ug), grupo OVA/AECCD-M (10 ug OVA, AECCD 400 ug ), grupo OVA/AECCD-H (10 ug OVA, AECCD 800 ug) y grupo OVA/Alum (10 ug OVA, Alum100 ug). Se inyectaron formulaciones de vacunas en 100 μL de NaCl al 0,9 por ciento en dos sitios diferentes (50 μL en cada sitio) en la piel de la espalda de cada ratón. Después de la vacunación, se recolectaron muestras de sangre del plexo retroorbitario, y los sueros se adquirieron y almacenaron a -80 ◦C para el análisis posterior de detección de IgG. La proliferación de esplenocitos y la detección de citoquinas, subconjuntos de células T, marcadores de superficie de DC y Treg se realizaron después del mismo protocolo de vacunación.

2.4.2. Análisis de anticuerpos

Los títulos de IgG en suero contra OVA se determinaron mediante ELISA los días 14, 28, 42 y 56 después de la vacunación primaria mencionada anteriormente (Zhang et al., 2018). Se midieron IgG1 e IgG2a el día 21. La absorbancia a 450 nm/630 nm se obtuvo utilizando un lector (Bio-Rad, EE. UU.). Los resultados de la respuesta de anticuerpos se expresan como títulos de IgG y los isotipos de IgG1 e IgG2a se expresan como absorbancias correspondientes.

2.4.3. Ensayo de proliferación de esplenocitos

El ensayo de proliferación de esplenocitos en ratones se realizó con un kit de ensayo CCK-8 según las instrucciones del fabricante. El día 21 después de la primera inmunización, los esplenocitos se aislaron del bazo de los ratones inmunizados y los eritrocitos se lisaron después de triturarlos. Los esplenocitos (1 × 106 células/pocillo) se estimularon con OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (10 ug/mL) y LPS (10 ug/mL) para dos días y se usaron células en blanco como control. La actividad de proliferación se expresó como índice de estimulación (SI), que se calculó como la relación de absorbancia de una célula estimulada a una célula no estimulada bajo la longitud de onda de 570/630 nm.

2.4.4. Análisis del fenotipado de linfocitos T en ganglios linfáticos de drenaje y bazo

Se obtuvieron suspensiones de esplenocitos de ganglios linfáticos y bazo en ratones inmunizados según el método mencionado anteriormente (Zhang et al., 2018). Después del lavado, las muestras (1 × 106 células/pocillo) se tiñeron durante 30 min con anticuerpos para marcadores de superficie, incluidos anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE y anti-CD62L-PE. Los niveles de linfocitos T se examinaron mediante citometría de flujo. Los resultados de los fenotipos de linfocitos T se expresan como porcentajes de CD4 más células T (porcentaje), CD8 más células T (porcentaje), CD44 más células T (porcentaje) y CD62L más (porcentaje) células T.

2.4.5. Análisis de citometría de flujo de los niveles de citoquinas

Para el análisis de tinción de citoquinas intracelulares, los linfocitos esplénicos se separaron y procesaron en una suspensión de una sola célula el día 21 después de la primera inmunización (Zhang et al., 2017). Las muestras (2 × 106 células/mL) estimuladas con OVA (10 ug/mL) se incubaron durante 4 h. Posteriormente se añadió Golgistop durante 12 h. A continuación, las muestras se lavaron, bloquearon y tiñeron con anticuerpos anti-CD4-APC o anti-CD8a-FITC durante 30 min. Después de la fijación y permeabilización con Cytofix/Cytoperm, las muestras se marcaron con anticuerpos anti-IL-4-PE o anti –IFN– -PE. Se realizó un análisis de flujo para determinar el nivel de citocina.

2.4.6. Estimación de la activación de DC y células Treg en un bazo

Para investigar si las DC y las Treg juegan un papel en la mejorainmunerespuestacontra OVA, el día 3 después de la primera vacunación, se recolectaron linfocitos esplénicos de ratones inmunizados para evaluar la maduración de DC (Zhang et al., 2017). Las células se bloquearon e incubaron respectivamente con anti-CD11c-PE/FITC, anti-CD40-PE, anti-CD86-APC, anti-CD80-APC y anti-MHCII- FITC por 30 min. Las células se analizaron por citometría de flujo. El día 21 después de la primera inmunización, se analizaron las células Treg con el kit de tinción de células T reguladoras de ratón. Los esplenocitos se tiñeron con anti-CD4-FITC para marcadores de superficie celular, seguido de tinción intracelular con anti-CD25-APC y anti-Foxp3-PE de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de células CD4 más CD25 más Foxp3 más se determinó mediante citometría de flujo.

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2.5. Experimentos in vitro

2.5.1. Generación de CD, viabilidad celular y niveles de endotoxinas

Las CD derivadas de la médula ósea de ratones C57BL/6 se obtuvieron según el método descrito previamente (Inaba et al., 1992). Brevemente, las células se cultivaron con medio completo RPMI-1640 (20 ng/ml de GM-CSF y 5 ng/ml de IL-4). Después de seis días, todas las células suspendidas se recogieron como DC inmaduras para ensayos posteriores. Se determinó que el porcentaje de CD11c más DC en las células no adherentes era del 94 por ciento mediante citometría de flujo.

La viabilidad celular de las CD y los esplenocitos de ratones con AECCD se detectó con el kit CCK{{0}} de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células de DCS y los esplenocitos se obtuvieron y luego se estimularon con diferentes concentraciones de AECCD (0, 10, 100, 400, 800 y 1600 ug/mL). La viabilidad celular se expresó como la proporción de la absorbancia del grupo tratado a la absorbancia del grupo de control) × 100 por ciento.

Con el fin de excluir el efecto de la endotoxina en AECCD, después de pretratar AECCD (100, 200 y 400 ug/mL) y LPS (100 ng/mL) con PMB (100 ug/mL) durante 60 min, DC (5 × 105 células/ml) se incubaron con AECCD pretratado (100, 200 y 400 ug/ml) y LPS durante 12 h. Después del tratamiento anterior, se evaluaron los niveles de CD40, CD86, CD80 y MHCII.

2.5.2. Análisis del fenotipo DC

Se determinaron los niveles de moléculas coestimuladoras para evaluar la maduración a través de experimentos in vitro. El día seis, las CD se trataron con AECCD (20, 100, 200 y 400 ug/mL) o LPS (100 ng/mL) durante 12 h. Luego, las CD se tiñeron con moléculas de superficie y se analizaron mediante citometría de flujo.

2.5.3. Producción de citocinas por DC in vitro

El sobrenadante del cultivo celular se recogió para medir el nivel de citocinas utilizando un kit ELISA o un kit de ensayo de flujo de analitos múltiples con el método CBA. Todos los pasos experimentales se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.5.4. Reacción alogénica de linfocitos mixtos (MLR)

Los esplenocitos de ratones BALB/c se obtuvieron asépticamente en medio RPMI- 1640 (Zhang et al., 2018). Las DC C57BL/6 maduras (maduradas en presencia de diferentes concentraciones de AECCD o LPS) se pretrataron con 50 ug/ml de mitomicina C durante 60 min a 37 ◦C. Después del lavado, las DC se mezclaron con los esplenocitos en una proporción de 1:5 o 1:10 durante 2 días. La proliferación celular se determinó por ensayo MTT.

2.5.5. Experimentos de neutralización de inhibidores

Para investigar la ruta de NF-κB relacionada con TLR4-, las CD recolectadas se cargaron en una 24-placa de pocillos y luego se pretrataron con TAK-242 (5 μM) o PDTC (5 μM) , respectivamente. Después de 1- h de incubación, las células se estimularon con diferentes concentraciones de AECCD (100, 200 y 400 ug/mL) o LPS (100 ng/mL) durante 24 h. Luego, se determinaron los niveles de expresión de moléculas de superficie y citoquinas en los sobrenadantes de cultivo de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.

3. Resultados

3.1. espectroscopia FTIR

Los principales picos de absorción de AECCD en la Fig. 1 fueron picos de absorción característicos de estructuras glucosídicas correspondientes a la vibración de estiramiento O–H en 3342,95 cm−1. La banda en 2933,54 cm−1 tenía la absorción débil característica de las vibraciones de estiramiento C–H. El pico de 1657,39 cm-1 se atribuyó a la vibración de flexión O-H. La absorción en 1411.00 cm− 1 se atribuyó a las vibraciones de estiramiento O–H o C–H y C–O. Los picos en 1018,38 cm−1 también indicaron vibraciones de banda glucosídica de CO y C–O–C.

Fig. 1. Espectros FTIR de AECCD.

3.2. Respuesta de anticuerpos séricos específicos de OVA

Se analizaron los sueros de los ratones inmunizados para comprobar la presencia de anticuerpos generados (IgG, IgG1 e IgG2a) contra OVA. Como se muestra en la Fig. 2A, los títulos de IgG en ratones inmunizados con OVA/AECCD-M provocaron IgG total más alta (títulos: 220,000, 25{{30}}, 000 y 250,000) con respecto a los del grupo OVA (títulos: 100,000, 100,000 y 120,000), y fue cerca del grupo Alum (títulos: 250,000, 250,000 y 270,000) los días 28, 42 y 56 después de la vacunación primaria. OVA/AECCD-M/H aumentó significativamente los niveles de IgG1 en comparación con el grupo OVA (P < 0,05)="" y="" la="" diferencia="" entre="" el="" grupo="" ova/aeccd-m/h="" y="" el="" grupo="" alum="" no="" fue="" significativa="" (p=""> 0,05). OVA/AECCD-M/H también mejoró notablemente los niveles de IgG2a en comparación con el grupo OVA y el grupo Alum (Fig. 2B y C) (P < 0,05).="" los="" niveles="" mejorados="" de="" igg2a="" podrían="" prevenir="" una="" enfermedad="" que="" requiera="">inmunerespuesta.

Fig. 2. Títulos de anticuerpos específicos de OVA e isotipos de IgG en suero. Las muestras de suero se recogieron después de las inmunizaciones primarias y de refuerzo para anticuerpos con ELISA. (A) Los títulos de IgG del suero agrupado se evaluaron los días 14, 28, 42 y 56 después de la primera inmunización. (B–C) IgG1 e IgG2a se midieron el día 21 después de la primera inmunización. Los datos se presentan como media ± SD (n=6). *P < 0.05="" en="" comparación="" con="">

3.3. Respuestas inmunitarias celulares

La proliferación de linfocitos de bazo se investigó mediante ensayo MTT bajo reestimulación con OVA u OVA{{0}}. El análisis de proliferación reveló que OVA/AECCD-M aumentaron notablemente la proliferación de esplenocitos después de la exposición a OVA, OVA323-339, Con A o LPS en relación con el grupo OVA. OVA y OVA323-339 mejoraron significativamente la mayor respuesta de proliferación que la del grupo Alum (Fig. 3) (P <>

Fig. 3. Proliferación de esplenocitos tras el tratamiento con AECCD in vivo. Los esplenocitos se reestimularon con OVA, OVA323-339, ConA o LPS y se midieron mediante el método MTT el día 21 después de la primera inmunización. La proliferación celular se mostró como índice de estimulación (SI): (A–B) Índice de estimulación de OVA y OVA323-339. (C-D) Índice de estimulación de ConA y LPS. Los datos se presentan como media ± SD (n=5). *PAGS<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. Activación de subconjuntos de células T en los ganglios linfáticos de drenaje y el bazo

Se recogieron los ganglios linfáticos y el bazo de los ratones inmunizados para detectar subconjuntos de células T el día 21 después de la vacunación primaria. El porcentaje de subconjuntos de células T (CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus T) de los ganglios linfáticos en el grupo OVA/AECCD-M fue significativamente mayor que el del grupo OVA y el grupo Alum (Fig. 4A–D) (P < 0.05).="" los="" porcentajes="" de="" subconjuntos="" de="" células="" t="" (cd4="" plus,="" cd8="" plus,="" cd44="" plus="" y="" cd62l="" plus="" t)="" en="" un="" bazo="" fueron="" significativamente="" más="" altos="" que="" los="" del="" grupo="" ova="" (fig.="" 4e-j)="" (p="">< 0.05).="" estos="" resultados="" indicaron="" que="" aeccd="" promovió="" la="" mediación="">inmunerespuesta.

Fig. 4. Niveles de subconjuntos de células T en ganglios linfáticos de drenaje y bazo in vivo. El día 21 después de la primera vacunación, se usaron células de ganglios linfáticos y bazo para detectar subconjuntos de células T mediante citometría de flujo. (A–D) Porcentajes de células T CD4 plus, CD8 plus y CD44 plus en los ganglios linfáticos. (E–J) Porcentajes de células T CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus y CD62L plus en un bazo. Los datos se presentan como media ± SD (n=5). *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" y="" ***p="">< 0,001="" en="" comparación="" con="" ova;="" #p="">< 0,05="" y="" ##p="">< 0,01="" en="" comparación="" con="">

3.5. Citocinas secretadas por esplenocitos reestimulados in vivo

Las citocinas Th1/Th2 del bazo de ratones inmunizados se determinaron mediante tinción intracelular el día 21 después de la primera vacunación. Los niveles de CD4 más IL-4, CD4 más IFN- y CD8 más IFN- en el grupo OVA/AECCD-M fueron significativamente más altos que en el grupo OVA y el grupo Alum (P < 0="" .05,="" figura="" 5).="" las="" diferencias="" indicaron="" que="" aeccd="" podría="" estimular="" las="" respuestas="" th1/th2,="" especialmente="" las="" mediadas="" por="" células="">inmunerespuesta.

Fig. 5. Análisis de citocinas específicas de antígeno en células T in vivo. Los esplenocitos de los ratones inmunizados se examinaron el día 21 después de la primera inmunización mediante tinción con citoquinas intracelulares. (A) Porcentajes de CD4 más IL-4. (B–C) Porcentajes de CD4 más IFN- y CD8 más IFN-. Los datos se presentan como media ± SD (n=5). *P < {{10}}.05="" y="" **p="">< 0,01="" en="" comparación="" con="" ova;="" #p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="">

3.6. Maduración de DC y Tregs in vivo

La activación de CC puede iniciar la inmunidad adaptativa. Los efectos de AECCD sobre la maduración de DC en ratones inmunizados se evaluaron el día 3 después de la primera inmunización. OVA/AECCD-M indujo los niveles más altos de CD40, CD80, CD86 y MHCII en DC en relación con el grupo OVA, y la diferencia entre OVA/AECCD-M El grupo y el grupo Alum fueron significativos (Fig. 6A-D) (P <0.05). la="" frecuencia="" de="" cd4="" más="" cd25="" más="" foxp3="" más="" tregs="" en="" el="" grupo="" ova/aeccd-m="" fue="" dramáticamente="" más="" baja="" que="" en="" el="" grupo="" ova="" (fig.="" 6e)="" (p="">< 0.05).="" estos="" datos="" sugirieron="" que="" aeccd="" podría="" activar="" dc="" y="" disminuir="" la="" frecuencia="" de="">

Fig. 6. Efectos de AECCD sobre la maduración de DC y Tregs in vivo. Se usaron esplenocitos de ratones ICR para detectar moléculas coestimuladoras en DC y Treg el día 3 o 21 después de la primera inmunización. (A–D) Porcentajes de CD40, CD86, CD80 y MHCII en CD11c más DC. (E) Porcentajes de CD4 más CD25 más Foxp3 más Tregs. Los datos se presentan como media ± SD (n {{10}}). *P < 0.05="" y="" **p="">< 0.01="" en="" comparación="" con="" ova;="" #p="">< 0,05="" y="" ##p="">< 0,01="" en="" comparación="" con="">

3.7. Ensayos de citotoxicidad y contaminación por endotoxinas

Después del tratamiento con diferentes concentraciones de AECCD durante 2 días, las células de DCS y esplenocitos de ratones se utilizaron para determinar la citotoxicidad potencial con el kit CCK-8. No hubo una respuesta de proliferación inhibida significativa en la viabilidad celular de las DC y los esplenocitos en comparación con la de los grupos de control (Fig. 7A–B) (P > 0.05). Estos resultados mostraron que AECCD a la concentración de 10–1600 ug/mL no mostró una citotoxicidad significativa para las DC y los esplenocitos en comparación con el control (P > 0,05). Por lo tanto, la concentración de AECCD en experimentos posteriores se fijó por debajo de 1600 ug/mL.

Para excluir la interferencia de la contaminación por endotoxinas en los efectos de AECCD sobre la activación de DC, se utilizó PMB, un antibiótico ampliamente reconocido por su efecto neutralizador de LPS, para excluir la contaminación por endotoxinas (Morrison y Jacobs, 1976). Como se muestra en la Fig. 7C–F, los niveles de expresión de CD40, CD80, CD86 o MHC-II en CD tratadas con AECCD en presencia de PMB no mostraron cambios significativos ( P > 0,05). Sin embargo, se observó una disminución drástica de los niveles de expresión de CD40, CD80, CD86 y MHC-II en DC tratadas con LPS en presencia de PMB (P < 0,001).="" estos="" resultados="" demostraron="" que="" aeccd="" estaba="" libre="" de="" contaminación="" por="">

Fig. 7. Citotoxicidad y efectos de PMB sobre la maduración de DC inducida por AECCD. (A–B) Se cultivaron DCS y esplenocitos de ratones en presencia de AECCD durante 2 días para determinar la viabilidad celular con el método MTT. (C–F) Las DC se incubaron durante 12 h con AECCD o LPS pretratadas en presencia o ausencia de PMB durante 60 min. Se determinaron los porcentajes de CD40, CD80, CD86 y MHCII en CD11c más DC. Los datos se presentan como medias ± SD (n =3). **P < 0,01="" y="" ***p="">< 0,001="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" con="">

3.8. Maduración fenotípica y activación funcional de DCs in vitro

Sobre la base de los experimentos de inmunización anteriores, la maduración fenotípica de las CD se exploró más a fondo después del tratamiento con AECCD in vitro. El día 6, se estimularon las DC inmaduras con una concentración determinada de AECCD o LPS para analizar las moléculas de superficie. AECCD indujo la maduración celular caracterizada por un aumento significativo en los porcentajes de CD40, CD80 CD86 y MHC II de manera dependiente de la dosis (P < 0,001,="" fig.="" 8a-d).="" también="" se="" observó="" una="" maduración="" fenotípica="" similar="" de="" las="" cd="" después="" de="" la="" estimulación="" con="" 100="" ng/ml="" de="" lps.="" los="" datos="" del="" análisis="" revelaron="" que="" aeccd="" mejoró="" la="" maduración="" de="">

A partir de los resultados anteriores, AECCD mejoró la maduración fenotípica de las CD. Con el fin de observar el efecto de AECCD en la función de DC in vitro, se estudió la capacidad de las DC tratadas con AECCD para estimular la proliferación de células T alogénicas en una MLR con una relación DC-esplenocitos de 1:5 o 1:10. investigado. Las DC tratadas con diferentes concentraciones de AECCD indujeron una proliferación significativa de células T en comparación con las DC no tratadas (Fig. 8E-F) (P < 0.001).="" la="" maduración="" de="" dc="" podría="" inducir="" la="" producción="" de="" citoquinas.="" a="" continuación,="" los="" sobrenadantes="" de="" las="" cd="" tratadas="" con="" aeccd="" o="" lps="" se="" detectaron="" mediante="" el="" kit="" elisa.="" los="" niveles="" de="" il-12="" y="" tnf-="" en="" los="" sobrenadantes="" de="" las="" cd="" aumentaron="" drásticamente="" de="" manera="" dependiente="" de="" la="" dosis="" (p="">< 0,001,="" fig.="">

Fig. 8. Maduración fenotípica y activación funcional de DC tras el tratamiento con AECCD in vitro. (A–D) El día 6, las CD se trataron con una concentración dada de AECCD o LPS durante 12 h. Las células se tiñeron con anticuerpos y se determinaron mediante citometría de flujo. Intensidad de fluorescencia media (MFI) de CD40, CD80, CD86 y MHCII en CD11c más DC. (E–F) Las CD C57BL/6 tratadas con diferentes concentraciones de AECCD o LPS se mezclaron con esplenocitos de ratones BALB/c en una proporción de 1:5 o 1:10 en una MLR durante 2 días. La proliferación celular se determinó por ensayo MTT. (G–H) Los sobrenadantes de cultivo de DC se analizaron para IL-12 y TNF-a mediante el kit ELISA. Los datos se presentan como medias ± SD (n =3). *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" y="" ***p="">< 0.001="" en="" comparación="" con="" dc="" sin="" tratar;="" #p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="">

3.9. TLR4, un receptor para AECCD en DC

DCS puede iniciar la señalización celular por receptores de membrana. Adeterminarel papel de TLR4 en la participación en la maduración de DC tratadas con AECCD, después del pretratamiento con el inhibidor de TLR4 TAK-242, las DC se estimularon con una concentración determinada de AECCD y luego se examinó el estado de activación de las DC mediante un citómetro de flujo . Los niveles de expresión de citocinas en los sobrenadantes de cultivo se analizaron mediante un kit de ensayo de flujo de múltiples analitos. La regulación positiva de CD40, CD80, CD86 y MHC-II inducida por AECCD se inhibió significativamente al bloquear las vías de TLR4 (P < 0,01,="" fig.="" 9a-d).="" además,="" en="" comparación="" con="" el="" control="" no="" tratado,="" el="" bloqueo="" de="" tlr4="" con="" tak-242="" tuvo="" un="" efecto="" de="" inhibición="" más="" significativo="" en="" la="" producción="" de="" ifn-,="" tnf-="" e="" il-6="" (p="">< 0,01,="" fig.="" 9e–g)="">

Fig. 9. Activación de la señalización de TLR4 en DC tratadas con AECCD. Después de tratar las CD inmaduras con AECCD en ausencia o presencia de TAK-242 durante 12 h, se examinó la maduración fenotípica mediante un citómetro de flujo y los niveles de citocinas en los sobrenadantes mediante el método CBA. (A–D) Porcentajes de CD40, CD80, CD86 y MHCII en CD11c más DC. (E–G) Niveles de IFN-, TNF- e IL-6. Los datos se presentan como medias ± SD (n=3). **P < 0,01="" y=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. Activación de DC por AECCD a través de la vía NF-κB relacionada con TLR4-

Para investigar si las expresiones de las moléculas de superficie y las citoquinas de las CD tratadas con AECCD estaban reguladas por NF-κB después de que las CD inmaduras pretratadas con el inhibidor de NF-κB PDTC se estimularan con AECCD durante 12 h, los niveles de expresión de las moléculas coestimuladoras y las citoquinas se midieron por citómetro de flujo. Los niveles de CD40, CD80 CD86 y MHC-II inducidos por AECCD disminuyeron significativamente en comparación con el control no tratado al bloquear las vías de NF-κB con los inhibidores correspondientes (P < 0,001,="" fig.="" 10a–d).="" simultáneamente,="" la="" expresión="" de="" ifn-,="" tnf-="" e="" il-6="" también="" fue="" significativamente="" inhibida="" por="" pdtc="" (p="">< 0.05,="" fig.="">

Figura 10. Implicación de NF-κB en la activación de DC inducida por AECCD. Las CD se trataron con AECCD en ausencia o presencia de PDTC durante 24 h. (A–D) Los porcentajes de CD40, CD80, CD86 y MHCII en CD11c más DC se determinaron mediante citometría de flujo. (E–G) Los niveles de IFN-, TNF- e IL-6 en el sobrenadante se determinaron mediante el método CBA. Los datos se presentan como medias ± DE (n=3).*P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" y="" ***p="">< 0,001="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" con="">

4. Discusión

Actualmente, se investigan varios polisacáridos de la MTC como adyuvantes para vacunas humanas y animales (Sun et al., 2018; Rey-Ladino et al., 2011). En este estudio, los efectos inmunomoduladores de AECCD y el mecanismo de activación principal de las DC se investigaron in vivo e in vitro mediante una serie de experimentos para evaluar la capacidad adaptativainmunerespuestacontra OVA y el estado de activación de DCS. Los experimentos in vivo indicaron que AECCD promovió notablemente la producción de isotipos IgG e IgG específicos de OVA, mejoró la proliferación de esplenocitos e indujo la activación de células T y citoquinas (IL-4/IFN-). Además, AECCD mejoró la maduración de DC y exhibió disminución de Tregs. Estos hallazgos sugirieron que la función de AECCD como un adyuvante eficiente se realizó promoviendo la maduración de DC e inhibiendo Tregs. Los experimentos in vitro indicaron que AECCD promovió la maduración fenotípica de las CD, la sección de citoquinas y la actividad aloestimuladora a través de la vía NF-κB relacionada con TLR4-. Estos resultados experimentales indicaron que AECCD tenía un potencial significativo como estimulador de la mejora inmunológica.

Cada adyuvante tiene características inmunes únicas contra diferentes antígenos, lo que indica que los adyuvantes tienen potencial de aplicación en diferentes enfermedades. En primer lugar, se probaron las propiedades adyuvantes de la coadministración de AECCD con OVA determinando sus efectos sobre la adaptacióninmunerespuestaen ratones. Muchos estudios demostraron que las actividades inmunoestimuladoras eran directamente proporcionales a la dosis dentro de un cierto rango (Li et al., 2020; Reed et al., 2020; Zhang et al., 2017). De manera similar, en el estudio, el análisis de anticuerpos e isotipos reveló que AECCD en un cierto rango de dosis mejoraba las respuestas de IgG, IgG1 e IgG2a específicas de OVA y que la dosis media de AECCD era la dosis óptima. En experimentos posteriores, investigamos principalmente el efecto estimulante de AECCD en una dosis media óptima. La dosis media de AECCD aumentó significativamente la respuesta de proliferación de esplenocitos en ratones inmunizados, lo que indica que AECCD promovió la proliferación celular.inmunerespuestascontra OVA. Estos resultados sugirieron que AECCD mejoró tanto humoral como celularinmunerespuestas, que se asociaron con potencial adyuvante.
La actividad sustancial de células T provocada puede conducir a la erradicación de la enfermedad. durante uninmunerespuesta, las células T activadas pueden llegar a los tejidos linfoides secundarios, incluidos el bazo y los ganglios linfáticos (Steinman, 2012). La dosis media de AECCD mejoró efectivamente la eficacia de la vacuna, ya que podría mejorar significativamente las respuestas de las células T CD4, CD8, CD44 y CD62L en el drenaje de los ganglios linfáticos y el bazo. Las células T CD8 activadas mediaron la erradicación de patógenos mediante la secreción de IFN-. Las células T CD4 proliferadas se diferenciaron en células Th1 y células Th1. Las células Th1 secretaron citoquinas Th1 para estimular la proliferación de linfocitos y las células Th2 secretaron citoquinas Th2 para mejorar la producción de anticuerpos (Seder et al., 2008). En el estudio, los niveles de CD4 más IL-4, CD4 más IFN- y CD8 más IFN- aumentaron con AECCD en una dosis media. AECCD indujo una respuesta equilibrada Th1/Th2 y dirigió lainmunerespuestaalterando la red de citoquinas.

Un adyuvante debe inducir inmunidad específica y controlar el resultado deinmunerespuestaregulando el estado de los CD en numerosos puntos (Carrera Silva et al., 2013). La expresión de moléculas de superficie en las CD es un indicador crucial para evaluar la maduración de las CD y generalmente se correlaciona con la diferenciación de los linfocitos T (Steinman, 2012). En este estudio, AECCD mejoró la expresión de moléculas coestimuladoras y facilitó la maduración de DC cuando se usó como adyuvante contra OVA. Esta puede ser una de las formas en que la AECCD promovió la comunicación humoral y celular.inmunerespuestas. Mientras tanto, AECCD también disminuyó la frecuencia de CD4 más CD25 más Foxp3 más Tregs, lo que proporcionó una inmunidad equilibrada después de la vacunación. Nuestros resultados respaldaron hallazgos recientes de que varios polisacáridos de la medicina tradicional china eran el regulador de la maduración de DC (Bo et al., 2019; Li et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Activación de adaptativoinmunerespuestaspor adyuvantes de polisacáridos está mediada principalmente a través de su reconocimiento por receptores específicos de DC (Akira, 2004). Las CD activadas a través de vías relacionadas con TLR4-pueden secretar varios inmunomoduladores como mediadores críticos contra las infecciones (Akira, 2007). Por lo tanto, en experimentos posteriores, exploramos preliminarmente el mecanismo molecular del efecto estimulador de AECCD en DC in vitro. Para observar la citotoxicidad de AECCD, primero se determinó la viabilidad celular de DC y esplenocitos de ratones. AECCD a 10–1600 ug/mL no mostró citotoxicidad para las CD y los esplenocitos. Para descartar la contaminación por LPS, pretratamos AECCD con PMB. Los niveles de expresión de CD40, CD80, CD86 y MHC-II en las DC tratadas con AECCD no disminuyeron, pero el PMB inhibió eficazmente la expresión de moléculas coestimuladoras en las DC tratadas con LPS. Esto demostró que AECCD estaba libre de contaminación por endotoxinas. A continuación, se exploró más a fondo el estado de activación de los DC. De forma similar a las DC tratadas con LPS, las DC tratadas con AECCD aumentaron los niveles de CD40, CD80 CD86 y MHC II, así como la producción de la citoquina proinflamatoria, que era un parámetro de maduración funcional de las CD. En una MLR, se evaluó la capacidad de proliferación de las células T alogénicas en DC tratadas con AECCD. AECCD podría cebar y activar las células T alogénicas. En primer lugar, las CD se pretrataron con mitomicina C y luego se lavaron a fondo para eliminar este reactivo, por lo que no era probable que los efectos de AECCD en las CD se atribuyeran a la actividad mitogénica. Los datos experimentales revelaron que la maduración fenotípica y la activación funcional de las DC podrían atribuirse a la estimulación de AECCD.

Varios polisacáridos de la medicina tradicional china podrían estimular la maduración de las CD a través de TLR4. NF-κB como miembro de la vía descendente relacionada con TLR4-desempeña un papel importante en la regulación de la maduración fenotípica y funcional de las DC e induciendo la expresión de varios genes implicados eninmunerespuestas(Qi et al., 2016; Re y Strominger, 2001; Wei et al., 2016; Zhu et al., 2013). A través de experimentos in vitro, encontramos que AECCD promovió la maduración de DC y que TAK-242 (inhibidor de TLR4) y PDTC (inhibidor de NF-κB) disminuyeron los niveles de expresión de CD40, CD80, CD86 y MHC -II y los niveles de secreción de IFN-, TNF- e IL-6 en DC tratadas con AECCD. Estos hallazgos indicaron que TLR4 y NF-κB estaban involucrados en la activación de DC inducida por AECCD y la secreción de citoquinas. Estos resultados fueron consistentes con los estudios informados anteriormente porque AECCD como adyuvante mejoró la orientación del antígeno en las DC.

En resumen, nuestros resultados mostraron que AECCD indujo respuestas duraderas y Th1/Th2, especialmente mediadas por células T.inmunerespuestacontra OVA. AECCD activó las DC a través de la vía NF-κB mediada por TLR4-, mejorando así la producción de inmunomoduladores y la proliferación de células T alogénicas. AECCD se puede utilizar como adyuvante eficaz en el desarrollo de vacunas. Sin embargo, se realizará un análisis de componentes preciso para determinar qué componente de los DC activados por AECCD. Con un enfoque en los mecanismos relacionados con cómo AECCD aumenta la inmunogenicidad, incluida la optimización de las formulaciones adyuvantes y la vía de administración de la vacuna, exploraremos más a fondo los componentes inmunomoduladores y las propiedades adyuvantes específicas de AECCD con el fin de diseñar vacunas adyuvantes eficaces contra enfermedades infecciosas.

Cistanche beneficios de la deserticapromover uninmunerespuesta

Contribuciones de autor

Adquisición, análisis e interpretación de Datos: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. Redacción del borrador original: Shuangshuang Feng, Xiang Weng.

Adquisición de fondos:Ailian Zhang.

Investigación:Ailian Zhang.

Metodología:Ailian Zhang, Bin Wang.

Supervisión:Ailian Zhang.

Declaración de competencia de intereses

Los autores no tienen ningún conflicto de interés relacionado con este estudio.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [números de concesión 31960164 y 31660259]. Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar, la preparación o el manuscrito.

Los autores agradecen al Prof. Xingguo Zheng y Jiang He (Urumqi, China) por proporcionar amablemente materiales e identificación.

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