Caracterización del potencial de inhibición de la enzima CYP3A4 de flavonoides seleccionados, parte 2

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Como en los experimentos anteriores, la mayor reducción de la actividad enzimática se observó cuando se utilizó crisina como inhibidor. La actividad residual de la enzima después de la incubación y diálisis con crisina fue de 0,57 por ciento, y después de la incubación y diálisis con tratamiento previo con hexacianoferrato de potasio, fue de 1,31 por ciento (Figura 4).

En el caso de inhibición directa (reversible), este tipo de experimento mostraría una recuperación de la actividad enzimática después de la diálisis. En el caso de una inhibición pseudoirreversible, la actividad enzimática se recuperaría tras el tratamiento con un oxidante y diálisis. Como no fue el caso de ninguno de los analizadosflavonoides, se puede concluir que todos los flavonoides muestran una inhibición irreversible del citocromo P450 3A4.

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3. Discusión

Se ha demostrado que algunos flavonoides pueden inhibir la actividad de las enzimas del citocromo P450. Saric-Mustapic et al. [28] y Kondza et al. [29] demostraron que la acacetina, la apigenina, la crisina y la pinocembrina inhiben la enzima CYP3A4 en el ensayo con testosterona como sustrato marcador. Dado que la enzima CYP3A4 posee un gran sitio activo que puede acomodar sustratos de manera diferente, se recomienda realizar ensayos de actividad con otro sustrato marcador, como nifedipina y midazolam [30]. En consecuencia, utilizamos la oxidación de nifedipina como reacción marcadora de la actividad de CYP3A4 y determinamos los parámetros cinéticos de inactivación. Los valores de eficacia de inhibición obtenidos usando nifedipino como sustrato marcador son del mismo orden de magnitud cuando se comparan con el ensayo de testosterona para apigenina, acacetina y pinocembrina. Solo la crisina mostró un valor cuatro veces mayor en testosterona 【29】 en comparación con el ensayo de nifedipina, es decir, 0,108 min-1 μM-1 frente a 0,029 min-1uM-1. Las similitudes observadas en la cinética de inactivación están de acuerdo con los datos de la literatura que confirman que nifedipina ytestosteronatienen diferentes sitios de unión que se superponen [31]. El citocromo P450 3A4 tiene uno de los sitios activos más grandes y puede acomodar el sustrato y el inhibidor al mismo tiempo, uno de los cuales influye en la unión del otro, lo que podría explicar las diferencias observadas entre los ensayos de nifedipina y testosterona.

Las implicaciones clínicas de los inhibidores reversibles (es decir, las interacciones entre alimentos y medicamentos) se pueden evitar si se interrumpe el tratamiento con el inhibidor. Las interacciones más importantes son aquellas que son irreversibles, mientras que la simple interrupción del uso del inhibidor no resolverá los problemas de interacción. En este estudio, la crisina mostró el potencial de inhibición más alto, con la IC5n y K más bajas; valores. El estudio de acoplamiento molecular de los flavonoides que se unen al citocromo P4503A4 ha demostrado una mayor afinidad de unión de la crisina al exponer el anillo B al hierro en el centro activo de la enzima [28]. El estudio de la relación estructura-inhibición ha demostrado que los grupos hidroxilo en el anillo A contribuyen al efecto inhibidor probablemente debido a las interacciones ion-ion, mientras que el anillo B puede no estar sustituido (pinocembrina, crisina) o monosustituido (acacetina, apigenina) para el efecto inhibitorio que se observará (Figura 1) [28]. Los flavonoides no sustituidos (pinocembrina, crisina) son más susceptibles a la epoxidación y generación de intermediarios reactivos que inactivan CYP3A4. El efecto inhibidor más fuerte observado con la crisina probablemente se deba a la rigidez de la estructura y la presencia del doble enlace C2=C3 en comparación con la pinocembrina.

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La importancia de esta cinética enzimática descrita se puede observar en el contexto de las interacciones entre alimentos y medicamentos, donde la administración de crisina (20-100 uM) aumentó significativamente el AUC y la concentración sérica máxima (Cmax) de nitrofurantoína en ratas [32] . Por ejemplo, el inhibidor basado en un mecanismo relativamente débil de la enzima CYP3A4/5,eritromicina[33], se ha informado que causa una interacción moderada con cerivastatina en voluntarios sanos (21 por ciento de aumento en el AUC de cerivastatina) [34]. Chrysin también tiene un potencial de inhibición mayor que el mibefradil, un fármaco antihipertensivo que se retiró debido a interacciones significativas con otros medicamentos. Los resultados de este estudio sugieren que la crisina puede ser un potente inhibidor y posiblemente interactuar con otros medicamentos usados, cambiando el AUC y la Cmax de estos medicamentos. La crisina es abundante en el propóleo (28 g/L), y es el tercer flavonoide principal en la miel 5,3 mg/kg [35]; por lo tanto, una dieta rica en estos alimentos tiene el potencial de interactuar con medicamentos que son sustratos de CYP3A4.

La pinocembrina, un inhibidor irreversible comprobado de la enzima CYP3A4, mostró el valor de kinee más bajo de 0.04 ± 0.01 min-. Su eficacia de inactivación fue similar a la de la acacetina y la apigenina (0,01 min-1uM-). La pinocembrina se encuentra principalmente en alimentos como la miel y bebidas (té y vino tinto), presentando una rica fuente de este flavonoide [29]. De acuerdo con estos parámetros cinéticos, se debe tener precaución al consumir estas fuentes de pinocembrina junto con medicamentos que actúan como sustratos de CYP3A4.

La acacetina mostró un valor IC50 tres veces mayor que la crisina y una K cinco veces mayor; mientras mantiene valores de impacto similares a los de otros flavonoides, lo que indica una menor eficacia inhibitoria. La acacetina se puede encontrar principalmente en especies de plantas como Turnera diffusa, Robinia pseudoacacia y Betula pendula [36], pero ciertos alimentos también presentan una fuente de este flavonoide. Por ejemplo, el jugo de kumquat es una fuente rica en acacetina, y la acacetina se puede encontrar en concentraciones de 0,1 mg/100 g de jugo fresco [37]. El compuesto original de la acacetina, la apigenina, mostró el valor IC50 más alto y la K más alta; valor entre los cuatro flavonoides probados. El potencial inhibidor de la apigenina se confirmó in vivo cuando el tratamiento combinado de apigenina y paclitaxel condujo a un aumento de la biodisponibilidad oral de paclitaxel, que se atribuyó principalmente a una mayor absorción en el tracto gastrointestinal a través de la inhibición de la glicoproteína P y una reducción del primer paso. metabolismo de paclitaxel a través de la inhibición de la subfamilia CYP3A en el intestino delgado y/o en el hígado por la apigenina [38]. La apigenina es un flavonoide dominante en el apio, el perejil y la manzanilla. Se ha informado que el perejil seco tiene la cantidad máxima de apigenina, a 45035 ug/g. Otras fuentes de apigenina se encuentran en hierbas como la flor seca de manzanilla, que contiene de 3000 a 5000 ug/g, y las semillas de apio, que contienen 786,5 ug/g 【39】.

La inhibición reversible de los citocromos P450 3A4 está relacionada con el primer paso del ciclo catalítico del citocromo P450 (Figura 5). Muy a menudo, se observa la competencia entre el sustrato y el inhibidor en la unión al sitio activo (hierro férrico). En ese caso, es recomendable realizar experimentos vinculantes (titulaciones de enzimas) y probarlo con más de un sustrato, ya que CYP3A4 tiene un sitio activo grande que puede acomodar más de una molécula de sustrato/inhibidor [26,30]. En este estudio, hemos utilizado nifedipino como sustrato, y los resultados de la eficiencia de inhibición fueron de una magnitud comparable con los ensayos informados anteriormente realizados con testosterona como sustrato marcador (Tabla 1).

Figura 5. El ciclo catalítico del citocromo P450 consta de nueve pasos. El primer paso representa la unión del sustrato y el punto de interacción con los inhibidores reversibles. En el segundo paso, el hierro hemo se reduce a una forma ferrosa a la que se unen los inhibidores pseudoirreversibles. Si se observa una inhibición irreversible, generalmente está relacionada con la forma radical del sustrato (formado en el paso 7) y/o producto (formado en el paso 8).cistanche en tus pantalonesLas especies reactivas de oxígeno formadas en el ciclo fútil del citocromo P450 (pasos 3a y 5a) pueden causar la destrucción de la enzima, que puede prevenirse mediante la adición de SOD y CAT. Se omite la descripción de los pasos no relacionados con la inhibición. Preparado según referencia [26].

Sin embargo, como hemos demostrado previamente [28,29] y confirmado aquí en nuestros experimentos realizados, todos los flavonoides estudiados muestran una inhibición irreversible. Independientemente del tipo de inhibición irreversible (unión pseudoirreversible o covalente del intermedio al hemo o la apoproteína), la inhibición será más destacada si se lleva a cabo una preincubación antes de añadir un sustrato marcador [26]. En una preincubación, se activa un ciclo catalítico mediante la adición del sistema generador para la producción de la coenzima (NADPH), y se deja suficiente tiempo para observar la inactivación de la enzima. Así, todos los tipos irreversibles de inhibición requieren la reducción de la enzima a la forma ferrosa (Figura 5).

Como los citocromos P450 son hemoproteínas, hemos estudiado la unión de los flavonoides a la forma ferrosa del sitio activo y la unión de un posible intermedio reactivo al hemo [26]. Para evaluar la posible formación de aductos de hemo, se realizó un ensayo de hemocromopiridina. Todos los flavonoides probados redujeron significativamente la concentración de hemo en ambos ensayos, en más del 50 por ciento. Chrysin fue, nuevamente, el inhibidor más potente, igualando los valores cinéticos de inhibición observados en este estudio. La concentración de hemo con pinocembrina fue cinco veces mayor y con apigenina casi diez veces mayor que con crisina (25,3±0,4 y 45,1±1,7 por ciento, respectivamente). Esta reducción en las concentraciones de hemo indica que la inhibición irreversible de CYP3A4 por parte de los flavonoides estudiados puede atribuirse a la unión covalente de un intermedio reactivo al hemo. Cabe señalar que las especies reactivas de oxígeno pueden destruir los hemo, lo que reduce los resultados del ensayo de hemocromopiridina. Para eliminar esta posibilidad, se realizaron incubaciones en presencia de SOD y CAT(lable2), confirmando la conclusión antes mencionada.

El primer paso en el ciclo catalítico de la enzima citocromo P450 es la unión de un sustrato a un ion férrico. Si el inhibidor muestra una inhibición competitiva al sustrato, la actividad enzimática puede recuperarse mediante diálisis, ya que la eliminación del inhibidor permite la recuperación completa de la actividad enzimática [26]. Sin embargo, si el inhibidor se une al hierro ferroso, se necesita el uso de un oxidante, como PCF, antes de la diálisis para recuperar la actividad enzimática. Si se recupera la actividad enzimática, la inhibición se caracteriza como pseudoirreversible [26]. Como la actividad enzimática no se pudo recuperar después de la diálisis con o sin PCF, ninguno de los flavonoides probados (a una concentración de 25 uM) actúa como inhibidor reversible o pseudoirreversible de la enzima CYP3A4. Esto también confirma que una inhibición irreversible por unión covalente a hemo o apoproteína es la causa probable de la inactivación de la enzima.

Cabe señalar que la crisina causó una reducción casi completa del hemo en la incubación: 97,1 por ciento sin y 94,5 por ciento con SOD y CAT (Tabla 2); mientras que los resultados de la actividad enzimática residual en condiciones similares mostraron la reducción de la actividad enzimática en aproximadamente un 99 por ciento (Figura 4). El ensayo de hemocromopiridina registra hemos de todas las fuentes en la incubación, es decir, citocromo P450, así como citocromo bs. Los resultados para la crisina indican que un intermedio reactivo generado por el citocromo P450 reaccionó con el hemo del citocromo P450 así como con el citocromo b5.

Se llevó a cabo un análisis LC-MS adicional para determinar los posibles intermedios de flavonoides reactivos en forma de aducto de hemo o atrapados usando glutatión como eliminador de radicales (datos no mostrados). Sin embargo, no pudimos aislar ninguno de los aductos previstos, probablemente debido a la inestabilidad del intermedio de flavonoide reactivo y/o el aducto de hemo/glutatión. Similar comportamiento se observó con mibefradil, un antihipertensivo, retirado del mercado por interacciones fármaco/fármaco. Aunque el mibefradil provocó la reducción del hemo, no se estableció un intermedio reactivo [40].

4. Materiales y Métodos

4.1.Materiales

En este estudio se utilizaron cuatro flavonoides (acacetina, apigenina, crisina y pinocembrina) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los citocromos recombinantes P450 3A4 coexpresados ​​con nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato (NADPH) reductasa y citocromo bs en autosomas se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.).

Según el ensayo de monóxido de carbono del citocromo P450[41], se confirmó que el contenido de la enzima CYP3A4 declarado por el fabricante era 1 uM.Glucosa-6-fosfato (G6P)glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) , y -nincotinamida-dinucleótido fosfato sal disódica (NADP plus) se adquirieron de Sigma-Aldrich. El fosfato de potasio (pa) y el diclorometano (pa) se adquirieron de Kemika dd (Zagreb, Croacia), el ácido fórmico (85 por ciento, pa) de Semikem doo (Sarajevo, Bosnia y Herzegovina) y el metanol utilizado para la disolución de reactivos y la cromatografía de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). Se utilizó agua ultrapura en las mezclas de incubación y cromatografía. Se usó dihidrógeno fosfato de potasio (Kemika dd) para preparar tampón de fosfato de potasio pH 7,85; El pH se ajustó utilizando hidróxido de sodio adquirido de Semikem doo Nifedipina (Sigma-Aldrich) y nifedipina oxidada (Dirección Europea para la Calidad de los Medicamentos, Farmacopea, 10ª edición, Estrasburgo, Francia) se utilizaron en el estudio de la actividad enzimática residual, así como en cinética de inactivación. Se utilizaron testosterona (Sigma-Aldrich) e 6 -hidroxitestosterona (Caimán Europa, Tallin, Estonia) para ensayos de inhibición pseudoirreversible. La troleandomicina y el diltiazem se obtuvieron de la Agencia de Medicamentos y Dispositivos Médicos (Zagreb, Croacia). En el ensayo de hemocromopiridina se utilizaron piridina (pa)(Semikem doo), hemina bovina (Sigma-Aldrich) y dimetilsulfóxido (Semikem doo). Se utilizó hexacianoferrato de potasio (Siegfried AG, Zofingen, Suiza) en el estudio de la inhibición reversible y pseudorreversible. Se utilizaron superóxido dismutasa (SOD) (Sigma-Aldrich), catalasa (CAT) (Sigma-Aldrich) y ácido clorhídrico (36 por ciento, pa) (Semikem doo) en el ensayo de especificidad de unión. Las incubaciones de enzimas se realizaron en un baño de agua (Inkolab, Zagreb, Croacia). El ensayo de la actividad enzimática residual y la cinética de inactivación de flavonoides se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución junto con detección UV-Vis (HPLC UV-Vis, Agi-lent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los cálculos de actividad residual y los parámetros de cinética de inhibición se realizaron utilizando el programa R (The R Project for Statistical Computing, Viena, Austria) y Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE. UU.).

4.2.Métodos

4.2.1. Determinación de la cinética enzimática y la actividad residual

Las incubaciones enzimáticas se realizaron por triplicado, con agitación mecánica en un baño de agua a 37°C. Se disolvieron alícuotas de flavonoides con una concentración final de 1 μM en metanol, se transfirieron a tubos de vidrio y se evaporaron hasta sequedad, excepto en las muestras de control sin el inhibidor (flavonoide). Después de la evaporación del solvente, se preparó una mezcla de incubación a un volumen de 100 μL, que constaba de 5 pmol de enzimas CYP3A4, tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4) y agua ultrapura. Inmediatamente antes de su uso, se preparó un sistema generador de NADPH compuesto por 0,1 M G6P∶10 mg/ml de NADP más ∶1000 UI/ml de G6PDH=50∶25∶1（v/v/ø）. Este sistema generador contiene glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que regenera NADP en NADPH, manteniendo constante la concentración de la coenzima citocromo P450 (NADPH) en la incubación. La adición del sistema generador (15 por ciento del volumen en la incubación final, v/ø) inició la reacción. Se usó nifedipino para probar la actividad enzimática residual a una concentración final de 200 uM. La reacción se detuvo usando 1 ml de solución al 1 por ciento enfriada con hielo de ácido fórmico en diclorometano. Las muestras se mezclaron y luego se centrifugaron durante 10 min a 1900 g (Rotofix32, Westfalia, Alemania). Después de la centrifugación, se formaron dos capas (agua y capa orgánica). Se transfirieron 850 μL de la capa orgánica a cubetas y se evaporaron. A continuación, el analito se disolvió en 30 μL de metanol. Una columna Agilent Zorbax SBC18 (4,6 × 250 mm,3 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）para el análisis de las muestras por HPLC, la fase móvil estuvo compuesta por metanol y agua en una proporción de 64:36, el análisis fue isocrático, el flujo se fijó en 1,0 mL min-1. El volumen de inyección se fijó en 10 μL. Se utilizó nifedipino como sustrato marcador. La reacción observada fue la oxidación de nifedipino. Los cromatogramas se registraron a 254 nm. La duración del análisis se fijó en 25 min. El tiempo de retención de la nifedipina es de 7,1 min y el de la nifedipina oxidada es de 10,8 min [42].En ambos casos, la cantidad de producto obtenido se observó como la cantidad de área bajo la curva (AUC) relativa a la muestra control. todos los flavonoides, la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC5), constante de inhibición (K;), constante de velocidad de inactivación (Kinect) y eficacia de inactivación (Kinect/K;). La troleandomicina se utilizó como control positivo: el inhibidor irreversible del citocromo P450 3A4.25 μM de concentración de troleandomicina redujo la actividad enzimática al 35±5 por ciento.

4.2.2. Ensayo de hemocromopiridina

El ensayo de hemocromopiridina se utilizó para evaluar la posible destrucción del hemo por la forma intermedia reactiva en el ciclo del citocromo P450 y se realizó de acuerdo con el método descrito por Flink y Watson [43] y Paul et al. [44], con algunas modificaciones. Se estableció una curva de calibración usando hemina disuelta en dimetilsulfóxido (0.6 a 0.1 μM）. Los espectros se registraron a una longitud de onda de 500 a 600 nm. Las mezclas de incubación con Se prepararon 25 uM de inhibidores (flavonoides) hasta un volumen de 200 μL. La reacción se inició mediante la adición de un sistema generador de NADPH (para conocer la composición, consulte la Sección 4.2.1), y las incubaciones duraron 30 min. La reacción se detuvo después de media hora mediante la adición de piridina (concentración final 0,83 M) e hidróxido de sodio (concentración final 0,06 M). Las muestras se registraron en un espectrofotómetro (UV-1280, Shimadzu Corporation, Kioto, Japón) en 1 min. de la adición de una solución alcalina, debido a la inestabilidad del hemocromógeno de piridina en condiciones básicas [44]. La concentración de hemo en las muestras se calculó con base en la curva de calibración preparada. Este ensayo se realizó por triplicado. Las incubaciones se repitieron usando catalasa y superóxido dismutasa (5 UI cada uno) en t La mezcla de incubación para evitar la generación de peróxido de hidrógeno a través del inútil ciclo catalítico.

4.2.3. Ensayo de inhibición pseudo-irreversible

El objetivo de este ensayo es probar la formación de complejos covalentes con hierro ferroso (Fe2 plus), evaluando la recuperación de la actividad enzimática tras la diálisis con o sin la adición de un oxidante. Se realizaron tres tipos de experimentos para cada flavonoide: mezcla de incubación sin flavonoides (control), mezcla de incubación con flavonoide y mezcla de incubación con flavonoide a la que se le añadió oxidante después de la incubación. Cada incubación con el inhibidor se realizó durante 30 min usando los mismos ajustes experimentales que se describieron anteriormente (Sección 4.2.1). Después de la incubación, las muestras se transfirieron a cartuchos de diálisis. Oxidante aa: se añadió una solución de hexacianoferrato de potasio 20 mM a una de las incubaciones antes de la diálisis [45]. Los casetes (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) se sumergieron en una solución tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4) durante 30 min (la solución de diálisis se intercambió tres veces). Después de la diálisis, las muestras se volvieron a transferir del casete al tubo de vidrio y se evaluó la actividad enzimática residual utilizando testosterona como sustrato marcador (concentración final de 200 μM). Como el sistema generador de NADPH también se dializó, se añadió de nuevo a las incubaciones para iniciar las reacciones enzimáticas. Las muestras se incubaron durante 30 min con los mismos ajustes (descritos en la Sección 4.2.1). La reacción se terminó mediante la adición de una solución helada de ácido fórmico en diclorometano. Las muestras se analizaron por HPLC. Se utilizó diltiazem, un conocido inhibidor pseudoirreversible del citocromo P450 3A4, como control positivo para evaluar la oxidación a una forma férrica (se observó una recuperación completa de la actividad enzimática).

4.2.4.Procesamiento de resultados

Se utilizaría una prueba t unilateral para evaluar la significación estadística de las diferencias entre las muestras y los controles, en función de las mediciones de la actividad residual. Se utilizó una ecuación no lineal para calcular el valor IC50. Se usó la ecuación de Michaelis-Menten para determinar la constante de inactivación y la tasa de inactivación del inhibidor. El procesamiento estadístico y la preparación de gráficos se realizaron utilizando el Programa R (The R Project for Statistical Computing, Viena, Austria) y Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE. UU.).

5. Conclusiones

La acacetina, la apigenina, la crisina y la pinocembrina inhiben la actividad de la enzima CYP3A4 in vitro. La crisina es el inhibidor enzimático más potente, con la IC50, K más baja; Valores Kinect y máxima eficacia de inactivación. Todos los flavonoides redujeron la concentración de hemo de la enzima, lo que confirma que se trata de una inhibición irreversible por intermedio reactivo que no puede prevenirse mediante la adición de SOD y CAT. Ninguno de los flavonoides probados actúa como inhibidor reversible o pseudoirreversible de la enzima CYP3A4 a una concentración de 25 uM, ya que la actividad de la enzima no se pudo recuperar con diálisis con y sin la adición de hexacianoferrato de potasio. Como estos flavonoides se pueden encontrar abundantemente en varios alimentos como frutas, verduras, especias, tés y vino tinto, existe la posibilidad de que puedan interferir con varios xenobióticos que son sustratos de CYP3A4. Se necesitan más estudios in vivo para investigar completamente las posibilidades de tales interacciones entre alimentos y medicamentos, así como la posible contribución de otras enzimas y transportadores en las interacciones.

Este artículo está extraído de Molecules 2021, 26, 3018