La enfermedad renal crónica aumenta las microhemorragias cerebrales en ratones y humanos

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Wei Ling Lau1,2 & Ane CF Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H. Cribbs3 & Mark Fisher6,7

Recibido: 25 de agosto de 2018 /Revisado: 28 de enero de 2019 /Aceptado: 22 de febrero de 2019 /Publicado en línea: 4 de mayo de 2019

# El(los) Autor(es) 2019

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Resumen

Las microhemorragias cerebrales aumentan encrónicoriñónenfermedad(ERC) y su presencia aumenta el riesgo de deterioro cognitivo y accidente cerebrovascular. Examinamos la interacción entre la ERC y las microhemorragias cerebrales (el sustrato neuropatológico de las microhemorragias) en modelos de cultivo de ratones y células y estudiamos la progresión de la carga de microhemorragias en imágenes cerebrales en serie de humanos. Estudios en ratones: se investigaron dos modelos de ERC: nefritis tubulointersticial inducida por adenina y nefrectomía quirúrgica 5/6. Estudios de cultivos celulares: se cultivaron células endoteliales de cerebro de ratón bEnd.3 hasta la confluencia y se midió la integridad de la monocapa después de la exposición al 5-15 por ciento de suero urémico humano o a concentraciones crecientes de urea. Estudios en humanos: la progresión de las microhemorragias cerebrales se evaluó en MRI en serie de pacientes de control, con ERC previa a la diálisis y con diálisis. Las microhemorragias aumentaron de 2 a 2.5- veces en ratones con ERC independientemente de la presión arterial más alta en el modelo de nefrectomía 5/6. La tinción de IgG aumentó en animales con ERC, en consonancia con una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica. La incubación de células bEnd.3 con suero urémico o urea elevada produjo una caída dependiente de la dosis en la resistencia eléctrica transendotelial. Urea elevada inducida por trastornos del citoesqueleto de actina y disminución de la expresión de claudina-5. En sujetos humanos, la prevalencia de microhemorragias fue del 50 % en ambas cohortes de CKD en comparación con el 10 % en los controles de la misma edad. Más pacientes en la cohorte de diálisis habían aumentado las microhemorragias en la resonancia magnética de seguimiento después de 1,5 años. La ERC interrumpe la barrera hematoencefálica y aumenta las microhemorragias cerebrales en ratones y las microhemorragias en humanos. La urea elevada altera el citoesqueleto de actina y las proteínas de unión estrecha en células endoteliales cultivadas, lo que sugiere que este mecanismo explica (al menos en parte) las microhemorragias y las microhemorragias observadas en estudios con animales y humanos.

Palabras clave Enfermedad renal crónica. Microhemorragias. modelo de ratón. Cultivo de células endoteliales. CerebroMRI

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Introducción

Uno de los descubrimientos más significativos de la neurología del ictus en los últimos años es la aparición decrónicoriñónenfermedadtener un impacto que va mucho más allá de los factores de riesgo tradicionales como la hipertensión y la diabetes [10, 11]. Dada la alta prevalencia (alrededor del 50 por ciento) de microhemorragias cerebrales y deterioro cognitivo en pacientes con ERC avanzada [2–4, 6, 7], esta relación merece más estudio.

Las microhemorragias cerebrales son pequeños focos de hemosiderina-hierro demostrables en imágenes de resonancia magnética (IRM), que se cree que reflejan microhemorragias cerebrales subyacentes [12, 13] e indican un mayor riesgo de accidente cerebrovascular, tanto hemorrágico como isquémico [9, 14]. Secuencias de resonancia magnética específicas (eco de gradiente e imágenes ponderadas por susceptibilidad) demuestran estas áreas focales de pérdida de señal en el parénquima cerebral que miden menos o igual a 10 mm [12, 15]. Las microhemorragias cerebrales dependen de la edad, con una prevalencia cercana al 20 % a los 65 años [16]. Además de la edad, la hipertensión y la angiopatía amiloide cerebral son los factores de riesgo mejor descritos para el desarrollo de microhemorragias [13, 17]. En la etapa tardía de la ERC, las microhemorragias están presentes en hasta el 50 % de la población [2–4].

Al mismo tiempo, el deterioro cognitivo es más frecuente y más grave en los niveles más bajos deriñónfunción[18], alcanzando una prevalencia del 30-70 por ciento en pacientes en diálisis crónica [6, 7]. En un análisis transversal de 338 pacientes de hemodiálisis de 55 años o más con controles de la misma edad, el 34 % de los pacientes de diálisis tenían un deterioro cognitivo grave en comparación con el 12 % de los controles [6]. Otro 35 por ciento de la cohorte de diálisis tenía un deterioro cognitivo moderado [6].

Varios estudios en cohortes sin ERC han demostrado una fuerte asociación entre las microhemorragias cerebrales y el deterioro de la función cognitiva [19-22]. Los datos epidemiológicos respaldan la coexistencia de la carga de microhemorragias de resonancia magnética y la disfunción cognitiva en pacientes con enfermedad renal en etapa terminal (ESRD, por sus siglas en inglés) [8, 23]. Además, un informe reciente de 28 pacientes de diálisis crónica con resonancia magnética cerebral en serie mostró una asociación entre nuevas microhemorragias y una disminución en la puntuación del miniexamen del estado mental (MMSE) [4]. Además, los pacientes con ESRD tienen una tasa de incidencia 3- a 4- veces mayor de accidentes cerebrovasculares isquémicos y hemorrágicos en comparación con la población general [5]. En una cohorte de pacientes japoneses en hemodiálisis que no tenían un accidente cerebrovascular al inicio del estudio, la presencia de microhemorragias cerebrales fue un predictor independiente de hemorragia intracerebral durante un período de seguimiento de 5-años [9].

Aquí informamos los resultados de estudios en ratones y en pacientes con ERC. Encontramos un aumento de las microhemorragias cerebrales en ratones con ERC y describimos la alteración de la unión estrecha endotelial y la interrupción del citoesqueleto de actina como mecanismos potenciales para la formación de microhemorragias en el entorno de la ERC. El análisis retrospectivo de resonancias magnéticas cerebrales en serie de sujetos sin ERC, prediálisis y hemodiálisis crónica confirmó que la ESRD es un factor de riesgo significativo para la progresión de la carga de microhemorragia.

Métodos

Experimentos con ratones

Animales de Experimentación y Grupos de Tratamiento

Se investigaron dos modelos de ratón con ERC. (1) Modelo de nefritis tubulointersticial por adenina: ratones macho C57BL/6J de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) de 10 a 12 semanas de edad fueron alimentados con una dieta que contenía 0,2 por ciento de adenina durante 18 días para inducir nefropatía intersticial crónica, colocados volvió a comer comida regular durante 2 semanas y luego volvió a exponerse a la dieta de adenina durante 1 semana para mantener la ERC (Fig. 1a). Los ratones de control se mantuvieron con comida regular. (2) Modelo de nefrectomía 5/6: ratones macho C57BL/6J de 10 semanas de edad se sometieron a cirugía en dos etapas en Jackson Laboratories que implicó nefrectomía parcial izquierda seguida de nefrectomía total derecha 1 semana después. Los animales fueron entregados al laboratorio 1 semana después de la

segunda cirugía. Estos dos modelos se utilizaron para determinar el efecto de la hipertensión; la hipertensión es un sello distintivo del modelo de nefrectomía 5/6, mientras que la adenina-CKD no es hipertensiva [24].

Los animales con ERC se aleatorizaron para no recibir lipopolisacáridos (LPS) o inyecciones de LPS. (En estudios piloto, determinamos que se necesitaba una duración más prolongada de la uremia para detectar una mayor carga de microhemorragias espontáneas en animales con ERC no tratados; ratones con dieta de adenina durante solo 10 días más allá de los 18 días iniciales la exposición tuvo 3.0 ± 0.4 microhemorragias por cm2.)

Cinco semanas después de la inducción inicial de la ERC y a una edad equivalente en los controles, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (ip) de LPS (Salmonella enterica serotipo Typhimurium, L{{0}}MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) para inducir microhemorragias cerebrales. El LPS se administró en tres dosis, 1 mg/kg a las 0, 6 y 24 h [25]. Los ratones tratados con LPS recibieron hidratación con inyecciones subcutáneas de solución salina dos o tres veces al día durante 3 días después del tratamiento con LPS. La presión arterial (PA) se midió 2 días antes de las inyecciones de LPS mediante pletismografía de manguito de cola (CODA-S2 multicanal, Kent Scientific). Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Irvine de la Universidad de California.

Cosecha de tejidos y química sanguínea

Los ratones se sacrificaron 1 semana después de las inyecciones de LPS o a una edad equivalente en animales no tratados mediante exanguinación mediante punción cardíaca bajo anestesia con isoflurano inhalado. Se usó una aguja de calibre 26- como cánula y se insertó en el ventrículo izquierdo, y se aplicó una solución de PBS helada a una velocidad de flujo de 7–8 ml/min. Después

perfusión durante 5 min, el hemisferio cerebral izquierdo se congeló instantáneamente para Western blot. El hemisferio derecho del cerebro y ambos riñones se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4 por ciento y luego se almacenaron en PBS frío antes del corte. El suero se dividió en alícuotas para la química sanguínea. El nitrógeno ureico en sangre (BUN) se midió utilizando el kit colorimétrico de BioAssay Systems (Hayward, CA). La creatinina sérica se midió mediante electroforesis capilar en el O'Brien Kidney Research Core Center (UT Southwestern, Dallas, TX).

Detección de Microhemorragias

Los cerebros se montaron en agarosa al 1,5 por ciento y se seccionaron con un vibratomo para generar secciones coronales (40 μm). Cada 5 secciones se recolectó para la tinción con azul de Prusia para detectar microhemorragias [26]. La tinción con azul de Prusia se realizó usando trihidrato de hexacianoferrato de potasio al 5 por ciento recién preparado y ácido clorhídrico al 10 por ciento. Veinte minutos más tarde, las secciones se enjuagaron con agua y se contrastaron con rojo nuclear sólido, se deshidrataron y se cubrieron con cubreobjetos. Las microhemorragias se identificaron con un aumento de × 20 como depósitos de color azul púrpura contados por tres inyecciones que se administraron a las 0,6 y las 24 h. Se administró hidratación salina subcutánea durante 3 días después de las inyecciones de LPS. La presión sanguínea de la cola (PA) se midió antes de las inyecciones de LPS. Los ratones se sacrificaron 1 semana después de las inyecciones de LPS. b Secciones de riñón teñidas con H&E representativas que muestran ratones con ERC con lesión tubulointersticial inducida por adenina (panel derecho) en comparación con riñones normales de animales CTL (panel izquierdo), aumento × 20. Barra de escala=100 μm

observadores independientes y luego se calculó la media. Las imágenes de las secciones teñidas positivamente observadas se capturaron usando un fotomicroscopio (Nikon Eclipse, Japón) para tres animales por grupo para calcular el área de microhemorragia. Se escanearon imágenes de diapositivas completas y se utilizó el software gratuito ImageJ (versión 10.2) de los Institutos Nacionales de Salud (www.imagej.nih.gov/ij/) para

calcular la superficie total del cerebro. El número de microhemorragias se normalizó al área de superficie cerebral total por animal.

Transferencia occidental

Los hemisferios cerebrales para el análisis de proteínas se congelaron instantáneamente en el momento de la recolección de tejido y se homogeneizaron en reactivo de extracción de tejido I helado (Thermo Fisher Scientific) complementado con un cóctel inhibidor de proteasa (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Las concentraciones de proteínas se midieron con un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific). La electroforesis en gel SDS-PAGE se realizó con 100 ug de proteína por muestra. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y luego se bloquearon durante

1 h en leche descremada en polvo sin grasa al 5 % preparada en tampón TBS-T (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM y Tween al 0,1 %-20) ​​e incubada con anticuerpos primarios dirigidos contra la claudina -5 (diluido 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), ocludina (diluido 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) y normalizado al control interno GAPDH (diluido 1:10,000, Abcam, Cambridge, MA) en leche descremada al 5 por ciento TBS-T durante la noche a 4 grados. A continuación, las transferencias se incubaron con los respectivos anticuerpos secundarios anti-conejo o anti-ratón durante 2 ha temperatura ambiente. Después de lavar con TBS-T, las bandas se detectaron utilizando el analizador de imágenes luminiscentes LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT).

inmunohistoquímica

Para detectar la fuga de la barrera hematoencefálica (BBB), las secciones se incubaron con anticuerpo secundario IgG anti-ratón biotinilado a 1:100 durante 1 h a temperatura ambiente (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Después del lavado con PBS, las secciones se incubaron durante 30 min con complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vector Laboratories) a una dilución de 1:200. La tinción se desarrolló utilizando 3',3'-diaminobencidina (DAB, Vector Laboratories) como cromógeno. El porcentaje de área teñida con IgG se analizó utilizando el software ImageJ en cerebros CKD y CTL sin LPS. Se eligió un umbral para la tinción positiva de IgG mediante la evaluación manual de un animal de control para la tinción de IgG, y este umbral se mantuvo luego igual para todos los animales incluidos [27].

Cistanche deserticola previene la enfermedad renal

Experimentos de cultivo celular

Cultivo de células endoteliales cerebrales y tratamiento con suero

Las células bEnd.3 de ratón inmortalizadas se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). El fenotipo de las células endoteliales se confirmó mediante inmunotinción para el factor de von Willebrand.

Los cultivos celulares se incubaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo con alto contenido de glucosa (DMEM, ATCC 30-2002) que contenía glucosa 25 mM suplementado con 10 por ciento de suero fetal bovino (FBS) y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina en un incubadora humidificada a 37 grados en una atmósfera de 5 por ciento de CO2 y 95 por ciento de aire. Las células se usaron en el pase 5 para todos los experimentos. Las células se sembraron a una densidad de 5 × 106 en insertos Transwell de poliéster de 12-pocillos (poro de 0,4 μm, Costar) y se logró la confluencia a las 24–48 h. A continuación, se cambió el medio de cultivo para exponer las células a diferentes concentraciones de FBS, suero normal humano (HNS) o suero urémico (CKD) de pacientes en diálisis. Las lecturas de TEER se midieron utilizando el medidor de voltios/ohmios EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL) en tres ubicaciones por pozo para obtener un promedio. Los experimentos continuaron durante 21 días y el medio de cultivo se actualizó cada 3 o 4 días. El NHS y el suero urémico procedían de muestras almacenadas previamente obtenidas después de la aprobación del IRB y el consentimiento informado.

Experimentos de cultivo celular de urea

Para examinar los efectos de la urea (la toxina retenida más abundante en la ERC), se incubaron células bEnd.3 en DMEM con alto contenido de glucosa con FBS al 10 % solo o en medio suplementado con 42 o 72 mg/dL (70 o 120 μm) de urea ( Sigma-Aldrich). Estas concentraciones de urea se aproximan a los valores previos y posteriores a la hemodiálisis que generalmente se encuentran en pacientes con ESRD, y se consideran clínicamente relevantes [28]. Al final de un período de incubación de 24- h, se midió el TEER y las células se recolectaron y procesaron para el análisis de transferencia Western. Para la visualización del citoesqueleto de actina, se cultivaron células bEnd.3 en cubreobjetos de vidrio y se expusieron a las concentraciones de urea anteriores durante 24 h, se fijaron durante 10 min en formalina/PBS al 4 % enfriada y luego se procesaron para tinción de inmunofluorescencia usando actistain 488 fluorescente. faloidina con tinción nuclear DAPI (n.º de catálogo PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Se realizaron portaobjetos por triplicado por grupo y se tomaron imágenes de tres fotogramas por portaobjetos en el software ImageJ para calcular el área de tinción de faloidina normalizada al área DAPI.

Transferencia occidental

Las células bEnd.3 de los experimentos con urea se sedimentaron y luego se lisaron en el reactivo de extracción de tejidos I (Thermo Fisher Scientific) complementado con un cóctel inhibidor de proteasa (Roche Applied Science). Las concentraciones de proteína se midieron con un kit de ensayo de proteína BCA y se realizó transferencia Western como se describe anteriormente con claudina-5 (diluida 1:500) y ocludina (diluida 1:500) normalizadas al control interno de GAPDH (diluida 1:20). ,000). Las transferencias de Western se repitieron al menos tres veces para cada muestra.

Estudios humanos

Revisión retrospectiva de gráficos de resonancia magnética cerebral

Los registros médicos electrónicos entre el 1 de enero de 2008 y el 31 de diciembre de 2014 en el Centro Médico de la Universidad de California-Irvine se revisaron utilizando el sistema Honest Broker y UCReX (University of California Research Exchange) después de la aprobación del IRB. Se identificaron pacientes con ERC previa a la diálisis (n =8) y pacientes con hemodiálisis crónica (n =9) que tenían al menos dos resonancias magnéticas cerebrales en puntos de tiempo separados (de 10 pacientes de hemodiálisis inicialmente identificados, 1 fue eliminado de el análisis final por falta de imágenes en el sistema PACS de radiología). Los controles con función renal normal (n=10) se emparejaron manualmente con los pacientes con ERC en hemodiálisis por sexo y edad ± 5 años.

Revisión de resonancia magnética para microhemorragias cerebrales

Un neurorradiólogo asistente (DF) contó las microhemorragias y las analizó para determinar su progresión a lo largo del tiempo. Se realizaron resonancias magnéticas cerebrales con imágenes ponderadas en T2* y susceptibilidad ponderada (SWI) e imágenes FLAIR (recuperación de inversión atenuada por fluido) en escáneres de resonancia magnética de 1.5T y 3T. El grosor de la capa para las secuencias SWI se realizó a 2 mm, con un intervalo entre capas de 0. Las microhemorragias se contaron en función del SWI axial de 2- mm. FLAIR fue per-

formado para detectar lesiones de sustancia blanca a un grosor de corte de 3 mm, también con un intervalo entre capas de 0.

Análisis estadístico

No hubo datos atípicos en la selección con la prueba de Grubbs (método de desviación estudentizada extrema, http://graphpad.com/quickcalls/grubbs1/). Las diferencias entre grupos en ratones y en humanos se compararon mediante pruebas de chi-cuadrado (exacta de Fisher) para variables categóricas y pruebas t y ANOVA para variables continuas. Los datos continuos se informan como media ± SEM. Para los datos de ratones, realizamos un ANOVA no paramétrico de Kruskal-Wallis y un ANOVA unidireccional con pruebas Tukey HSD. Se utilizó ANOVA de dos vías (CKD-sí/no y LPS-sí/no) para probar la interacción de CKD. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas si P < 0.05.="" las="" figuras="" se="" generaron="" usando="" el="" software="" graphpad="" prism="" 4="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">

Resultados

Supervivencia con tratamiento LPS

Los ratones CKD tratados con LPS tuvieron una tasa de supervivencia del 80 por ciento. Sólo los ratones que sobrevivieron hasta 1 semana después del tratamiento con LPS fueron

incluidos en los análisis finales. Todos los ratones de otros grupos sobrevivieron hasta el final del experimento.

ERC Aumento significativo de microhemorragias cerebrales

Carga después del tratamiento con LPS

Los animales con nefrectomía inducida por adenina y 5/6 CKD mostraron valores significativamente elevados de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina sérica en comparación con los animales CTL (Tabla 1). Tail BP fue significativamente mayor en animales con nefrectomía-CKD en comparación con animales CTL y adenine-CKD (Tabla 1); sin embargo, los recuentos de microsangrados en los dos grupos con ERC fueron similares. La tinción con H&E confirmó la lesión tubulointersticial inducida por adenina en los riñones de ratones con ERC (Fig. 1b).

La carga media de microhemorragia cerebral fue de 2,0 ± 0,5 por cm2 en ratones CTL sin LPS y aumentó de 2 a 2,5- veces en animales con ERC sin LPS (adenina- ratones CKD 4,5 ± 0,9 por cm2;

nefrectomía-ratones CKD 4,2 ± 1,1 por cm2) (Tabla 1; Fig. 2a). Para los grupos sin LPS, un aumento de microhemorragias fue significativo para adenina-CKD en comparación con CTL pero no para nefrectomía-CKD. El tratamiento con LPS aumentó la formación de microhemorragias en el mismo grado en animales CTL y CKD por