El polisacárido Cistanche Deserticola atenúa la osteoclastogénesis y la reabsorción ósea mediante la inhibición de la señalización RANKL y la producción de especies reactivas de oxígeno

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song y otros

La osteoporosis es una enfermedad metabólica caracterizada por osteopenia y deterioro de la microestructura ósea. Los osteoclastos son las células efectoras primarias que degradan la matriz ósea y su función anormal conduce al desarrollo de osteoporosis. La acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el metabolismo celular promueve la proliferación y diferenciación de los osteoclastos y, por lo tanto, juega un papel importante en la osteoporosis.Cistanchedeserticolapolisacárido(CDP) posee actividad antitumoral, antiinflamatoria y antioxidante. Sin embargo, el impacto de la CDP en los osteoclastos no está claro. En este estudio, se utilizaron la tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato, la inmunofluorescencia, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa y el análisis de transferencia Western para demostrar que la CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)inhibió la osteoclastogénesis y la reabsorción de hidroxiapatita. Además, CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)también inhibió la expresión de genes marcadores de osteoclastos, incluidos Ctsk, Mmp9 y Acp5, y no tuvo ningún efecto sobre la expresión del receptor activador del factor nuclear κB (RANK). Los análisis mecanicistas revelaron que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)aumenta la expresión de enzimas antioxidantes para atenuar la producción de ROS mediada por RANKL en los osteoclastos e inhibe el factor nuclear de las células T activadas y la activación de la proteína quinasa activada por mitógeno. Estos resultados sugieren que la CDP puede representar un fármaco candidato para el tratamiento de la osteoporosis causada por una actividad excesiva de los osteoclastos.

PALABRAS CLAVEResorción ósea,Cistanchedeserticolapolisacárido, MAPK, osteoclasto, especies reactivas de oxígeno

culturismo cistanche

1|INTRODUCCIÓN

El equilibrio entre la formación ósea, mediada por los osteoblastos, y la resorción ósea, mediada por los osteoclastos, juega un papel vital en el mantenimiento de la homeostasis metabólica ósea (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Cuando la reabsorción ósea supera la formación ósea, se produce la osteoporosis, que se caracteriza por una masa ósea reducida y daño microestructural óseo (Ikeda, 2008). La osteoporosis es una enfermedad común en personas de edad avanzada y mujeres posmenopáusicas y su patogenia no ha sido del todo aclarada (Cooper & Melton, 1992). La deficiencia de estrógeno es una causa principal de osteoporosis (Manolagas, O'Brien y Almeida, 2013). Además, las especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden ser inducidas por el ligando del receptor activador del factor nuclear κB (RANKL) y están asociadas con la formación de osteoclastos (Yip et al., 2005), y por lo tanto pueden contribuir al desarrollo de osteoporosis (Manolagas, 2010). Algunos estudios han encontrado que la deficiencia del antioxidante Nrf2 aumenta los niveles de ROS y promueve la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL (Hyeon, Lee, Yang y Jeong, 2013). Por lo tanto, la reducción de la producción de ROS durante la diferenciación de osteoclastos debe evaluarse como una estrategia terapéutica para el tratamiento de la osteoporosis.

Los osteoclastos se derivan del linaje hematopoyético de monocitos o macrófagos y son las únicas células multinucleadas que realizan la reabsorción ósea (Teitelbaum, 2000). Por lo tanto, la investigación relacionada con la formación de osteoclastos es de gran importancia para desarrollar tratamientos efectivos para las enfermedades del metabolismo óseo (Lorenzo, 2017). El factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y RANKL, producidos por osteoblastos y células T activadas, son citocinas importantes que regulan la osteoclastogénesis (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induce la expresión del factor nuclear de células T activadas (NFATc1), que es un factor de transcripción crítico activo durante la formación de osteoclastos (Ishida et al., 2002). NFATc1 activado promueve la expresión de genes marcadores de osteoclastos como la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAcP) y la catepsina K (CTSK) que regulan la osteoclastogénesis y la función de los osteoclastos (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolisacárido(CDP) se aísla de los tallos carnosos deCistanchey posee regulación inmunológica, antitumoral, antienvejecimiento y otros efectos farmacológicos (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)tuvo un efecto inhibitorio sobre la producción de óxido nítrico (NO) inducida por lipopolisacáridos en células microgliales de ratón (células BV-2; Nan et al., 2013). Además, un extracto rico en feniletanoide (ECD) deCistanchemejoró la capacidad de natación de los ratones al disminuir el daño muscular, retrasar la acumulación de ácido láctico y mejorar el almacenamiento de energía (Cai et al., 2010). Sin embargo, los efectos de la CDP sobre la función y la actividad de los osteoclastos siguen sin conocerse.

En este estudio, demostramos que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)inhibe la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL y la resorción ósea. El mecanismo subyacente fue que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)mejora la expresión de enzimas antioxidantes para atenuar la producción de ROS, y luego suprime las cascadas de señalización de NFAT activado por RANKL y proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK). Estos resultados sugieren que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)podría usarse para tratar la osteoporosis causada por una reabsorción ósea osteoclástica excesiva.

Cistanche de maca ginseng

2|MATERIALES Y MÉTODOS

2.1|Materiales

CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)(pureza > 98 por ciento) se adquirió de Solarbio (Beijing, China) y se preparó a una concentración madre de 1 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los anticuerpos son específicos para c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilados (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK y ‐actin se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (San José, CA). Los anticuerpos contra la V-ATPasa d2 se produjeron como se describió anteriormente (H. Feng et al., 2009). El sistema de ensayo de 3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐il)‐5‐(3‐carboximetoxifenil)‐2‐(4‐sulfofenil)‐2H‐tetrazolio (MTS) y luciferasa se obtuvo de Promega (Sydney, Australia) . El M‐CSF recombinante se adquirió de R&D Systems (Minneapolis, MN). La proteína GST-rRANKL recombinante se expresó y purificó como se describió anteriormente (Xu et al., 2000).

2.2|Cultivo de células

Las células RAW264.7 (células de macrófagos de ratón) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en medio esencial mínimo modificado (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australia) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento, 2 mM de L‐glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina (medio completo). Se aislaron monocitos derivados de médula ósea (BMM) de ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad, que se sacrificaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Australia Occidental (RA/3/100/1244). Los huesos largos se diseccionaron sin tejidos blandos y la médula ósea se lavó del fémur y la tibia, que luego se cultivó en un medio completo en presencia de M‐CSF (50 ng/ml).

2.3|Ensayo de osteoclastogénesis

Las BMM se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 6 × 103 células por pocillo y se trataron con un medio completo que contenía M‐CSF (50 ng/ml) y GST‐rRANKL (100 ng/ml), en presencia o ausencia de concentraciones variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tres núcleos) fueron identificados como osteoclastos.

2.4|Ensayos de citotoxicidad

Las BMM se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 6 × 103 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, las células se incubaron con concentraciones variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido). Después de otras 48 h, se añadió la solución de MTS (20 µl/pocillo) y se incubó con las células durante 2 h. La absorbancia a 490 nm se determinó con un lector de microplacas (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Tinción inmunofluorescente

Las BMM se sembraron a una densidad de 6 × 103 células por pocillo en presencia de M‐CSF (50 ng/ml) durante la noche. A continuación, las células se estimularon con M‐CSF y GST‐rRANKL (100 ng/ml) hasta que se formaron osteoclastos maduros. Luego, los osteoclastos se trataron con concentraciones variables de CDP.(Cistanchedeserticolapolisacárido)durante 48 h antes de fijar con paraformaldehído al 4 %, permeabilizar con 0,1 % Triton X-100–PBS y bloquear con albúmina sérica bovina al 3 % en PBS. Las células preparadas se incubaron con faloidina conjugada con rodamina durante 45 min en la oscuridad para teñir la actina F. Luego, las células se lavaron con PBS, los núcleos se contrastaron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y se montaron con cubreobjetos para microscopía confocal.

experiencia de cistanche

2.6|Ensayo de reabsorción de hidroxiapatita

Para medir la actividad de los osteoclastos, los BMM (1 × 105 células por pocillo) cultivados en placas recubiertas de colágeno de seis pocillos (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) se estimularon con GST‐rRANKL (100 ng/ml) y M‐CSF (50 ng/ml). ml) hasta que se generaron osteoclastos maduros (Zhou et al., 2016). Luego, las células se separaron suavemente de la placa utilizando una solución de disociación celular (Sigma-Aldrich) y se sembraron cantidades iguales de osteoclastos maduros en pocillos individuales en placas de 96 pocillos recubiertas con hidroxiapatita (Corning Osteoassay, Corning, NY). Los osteoclastos maduros se incubaron en un medio que contenía GST‐rRANKL y M‐CSF con o sin CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)a las concentraciones indicadas. Después de 48 h, la mitad de los pocillos se tiñeron inmunohistoquímicamente para la actividad TRAcP, como se describe anteriormente, para evaluar el número de células multinucleadas por pocillo. Los pocillos restantes se blanquearon durante 10 min para eliminar las células y permitir la medición de las áreas reabsorbidas. Las áreas reabsorbidas se fotografiaron bajo microscopía de luz estándar y se usó el software Image J (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD) para cuantificar el área porcentual de la superficie de hidroxiapatita reabsorbida por los osteoclastos.

2.7|Ensayos de indicadores de luciferasa

Para investigar la activación transcripcional de NFATc1, las células RAW264.7 se transfectaron de manera estable con una construcción informadora de luciferasa sensible a NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Las células transfectadas se cultivaron en placas de 48 pocillos a una densidad de 1,5 × 105 células por pocillo y se pretrataron con diversas concentraciones de CDP.(Cistanchedeserticolapolisacárido)por 1 hora Después del pretratamiento, las células se estimularon con GST‐rRANKL (100 ng/ml) durante 24 horas y la actividad de la luciferasa se midió utilizando el sistema de ensayo indicador de luciferasa de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega).

2.8|Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)

El ARN total se aisló de las células utilizando el reactivo Trizol de acuerdo con el protocolo del fabricante (Thermo Fisher Scientific). El ADN complementario se sintetizó utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney con 1 ug de plantilla de ARN y cebadores oligo-dT. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de secuencias específicas se realizó utilizando el siguiente programa: 94 grados durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 grados durante 40 s, 60 grados durante 40 s y 72 grados durante 40 s, y un paso de extensión final de 5 minutos a 72 grados. La información detallada de los cebadores específicos se muestra en la Tabla 1. Los niveles relativos de ARN mensajero se calcularon mediante la normalización de la expresión del gen Hmbs.

2.9|Análisis de Western Blot

Las BMM se cultivaron en medio completo con M‐CSF en placas de seis pocillos y se estimularon con GST‐rRANKL (100 ng/ml) durante los tiempos indicados. Las células se lisaron en tampón de lisis de radioinmunoprecipitación y las proteínas se resolvieron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Las membranas se bloquearon en leche descremada al 5 por ciento durante 1 hora y luego se probaron con varios anticuerpos primarios específicos con agitación suave durante la noche a 4 grados. Las membranas se lavaron y posteriormente se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. A continuación, se detectó la reactividad de los anticuerpos con un reactivo de quimioluminiscencia mejorado (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se visualizó con un Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Detección de ROS intracelular

Los niveles intracelulares de ROS se detectaron utilizando un kit de ensayo de detección de ROS celular con diacetato de diclorofluoresceína de 2′,7′ (Abcam, Melbourne, Australia). Las BMM (5 × 103 células por pocillo) se cultivaron en placas de 96 pocillos y se trataron con RANKL (100 ng/ml), M‐CSF (50 ng/ml) y CDP durante 72 horas. Los niveles intracelulares de ROS se midieron usando diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína, que se oxida a DCF fluorescente en presencia de ROS. Las células se lavaron en tampón de Hank y se incubaron en la oscuridad durante 30 min con 10 µM de DCFH‐DA. Las imágenes se obtuvieron mediante microscopía confocal.

2.11|Análisis estadístico

Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos realizados por triplicado a menos que se indique lo contrario. Los datos se expresan como media ± SD. Se utilizó un análisis de varianza de una vía seguido de pruebas post hoc de Student-Newman-Keuls para determinar la significancia de las diferencias entre los resultados, con p < 0.05="" considerada="" como="">

3|RESULTADOS

3.1|CDP inhibe la osteoclastogénesis inducida por RANKL y la fusión de osteoclastos

Para determinar si CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)puede suprimir la formación de osteoclastos inducida por RANKL, primero realizamos un ensayo de osteoclastogénesis utilizando BMM de ratón (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). Los BMM se trataron con RANKL y M‐CSF durante 5 días con concentraciones crecientes de CDP. CDP redujo el número de células multinucleadas positivas para TRAcP cuando la concentración de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)alcanzó 5 µM o más (Figura 1a,b). Para evaluar CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)toxicidad y confirmar que estos resultados no eran un reflejo de la muerte o el número de células, realizamos un ensayo MTS. Los BMM se trataron con RANKL y M‐CSF durante 48 horas con dosis variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido). CDP no tuvo ningún efecto sobre la proliferación de BMM a una concentración de 15 µM o menos (Figura 1c).

Para probar los efectos de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)en la fusión de osteoclastos, los osteoclastos se indujeron con RANKL y tratamiento con M‐CSF, con o sin dosis variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido). Los osteoclastos se tiñeron con rodamina‐faloidina y DAPI para evaluar el número de núcleos por osteoclasto (Figura 2a). Tanto el número de osteoclastos como el número promedio de núcleos por osteoclasto disminuyeron después de la CDP.(Cistanchedeserticolapolisacárido)tratamiento (5–10 µM; Figura 2b,c). Por lo tanto, CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)tuvo efectos inhibitorios sobre la osteoclastogénesis inducida por RANKL y la fusión de osteoclastos de una manera dependiente de la dosis.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)atenúa la actividad de reabsorción de hidroxiapatita osteoclástica inducida por RANKL

Se realizó un ensayo de reabsorción de hidroxiapatita para detectar el efecto de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)sobre la función de los osteoclastos (Figura 3a). Después de una incubación de 24 horas, la cantidad de osteoclastos por pocillo no cambió, mientras que el área de reabsorción de hidroxiapatita disminuyó significativamente con el tratamiento con 5 y 10 µM de CDP en comparación con los grupos de control (Figura 3b,c). Estos resultados demuestran que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)tiene fuertes efectos inhibidores tanto en la formación de osteoclastos como en la actividad de reabsorción de osteoclastos sin efectos citotóxicos.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)inhibe la expresión del gen marcador de osteoclastos

Para investigar más a fondo los efectos inhibidores de la CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)sobre la osteoclastogénesis y la resorción ósea osteoclástica, las BMM se trataron con RANKL y M‐CSF durante 5 días con concentraciones variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido). Luego se realizó RT-PCR para detectar la expresión de genes marcadores de osteoclastos. CDP inhibió la expresión de Nfatc1, un factor de transcripción crucial durante la osteoclastogénesis.(Cistanchedeserticolapolisacárido)de manera dependiente de la dosis (Figura 4a). Además, CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)(5 y 10 µM) regularon a la baja la expresión de genes relacionados con la resorción ósea, incluidos Mmp9, Ctsk y Acp5 (Figura 4b-d).

3.4|CDP suprime la actividad de NFATc1 y la expresión de proteínas aguas abajo

Para examinar el efecto de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)sobre la actividad de NFATc1 inducida por RANKL, se realizó un ensayo de indicador de luciferasa. Tratamiento con CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido), a concentraciones de 5 µM y superiores, inhibió significativamente la actividad de NFATc1 inducida por RANKL (Figura 5a). Además, el análisis de transferencia Western mostró que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)suprimió significativamente la expresión de proteínas de NFATc1 y c‐Fos en BMM tratados con RANKL y M‐CSF durante 3 y 5 días (Figura 5b). Además, la expresión de proteínas relacionadas con la función de los osteoclastos, como V-ATPasa-d2 y CTSK, se reguló a la baja en presencia de CDP.(Cistanchedeserticolapolisacárido)en comparación con los grupos de control. Sin embargo, CDP no tuvo efecto sobre la expresión de RANK (Figura 5b).

3.5|CDP promueve la expresión de enzimas antioxidantes para eliminar la producción de ROS durante la osteoclastogénesis inducida por RANKL

Para explorar el mecanismo subyacente de la inhibición de la osteoclastogénesis dependiente de CDP, las BMM se trataron con RANKL (100 ng/ml) y M‐CSF (50 ng/ml) junto con PBS o CDP.(Cistanchedeserticolapolisacárido)durante 72 h. Examinamos el efecto de CDP en la producción de ROS intracelular estimulada por RANKL. Los niveles intracelulares de ROS aumentaron con el tratamiento con RANKL, que se atenuó con CDP (5 y 10 µM; Figura 6a). Tanto el número de células positivas para ROS como la intensidad de la tinción de ROS disminuyeron con el tratamiento con CDP de manera dependiente de la dosis (Figura 6b,c). El análisis de transferencia Western mostró que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)promovió la expresión de tiorredoxina (TRX1) y glutatión reductasa (GSR) mientras suprimía la expresión de óxido nítrico sintasa inducible (NOS2) en BMM que se trataron con RANKL y M‐CSF durante 3 días (Figura 6d).

Para explorar más a fondo si CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)suprimió la diferenciación de osteoclastos al reducir la producción de ROS, luego tratamos los BMM con peróxido (10 µM) para imitar el alto estado de ROS en las células. Los BMM fueron inducidos por RANKL y M‐CSF durante 3 días y los resultados del análisis de transferencia Western y RT‐PCR mostraron que el peróxido promovió la expresión de NFATc1 y c‐Fos en comparación con los grupos de control. De acuerdo con los resultados de la Figura 5, CDP suprimió la expresión de NFATc1 y c-Fos(Cistanchedeserticolapolisacárido)mientras que el peróxido rescató el efecto inhibidor de CDP (Figura 6e,f). Estos datos indicaron que CDP reprimió la expresión de NFATc1 y c‐Fos al eliminar la producción de ROS.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)reprime las vías MAPK durante la osteoclastogénesis inducida por RANKL

A continuación, investigamos el efecto de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)tratamiento en la expresión de TRAF6 mediada por RANKL y la activación de la vía MAPK. Después de la incubación en medio sin suero durante 2 h, las BMM se estimularon con RANKL, con o sin CDP, durante 60 min. La estimulación con CDP (10 µM) no tuvo efecto sobre la expresión de TRAF6 y atenuó la fosforilación de JNK2 y ERK1/2 a los 10 y 20 min (Figura 7). Además, la fosforilación de p38 fue significativamente inhibida por CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)tratamiento de 60 min en comparación con los grupos control (Figura 7). Estos datos revelan que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)suprime las vías de señalización de MAPK inducidas por RANKL, en consonancia con su efecto inhibitorio sobre la formación y actividad de los osteoclastos.

4|DISCUSIÓN

Cistanche, conocido como "ginseng del desierto", ha llamado mucho la atención recientemente por su capacidad para modular la inmunidad y actuar de manera protectora durante el envejecimiento y el estrés oxidativo (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Se ha demostrado que los glucósidos sustituidos con fenilpropanoide, los principales componentes activos de Cistanche, inhiben la actividad del NO en los macrófagos (Ahn, Chae, Chin y Kim, 2017). AdemásCistancheEl extracto redujo el estrés oxidativo en el miocardio reperfundido después de la isquemia y desempeñó un papel importante en la inhibición de las vías apoptóticas que conducen a la cardioprotección (Yu, Li y Cao, 2016). Como componente importante de Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)Tiene una variedad de funciones farmacológicas. Nuestro estudio actual encontró que CDP reprimió la diferenciación y activación de osteoclastos activados por RANKL al atenuar la producción de ROS, así como la activación de NFAT y MAPK.

Como fosfatasa ácida, TRAcP existe en una variedad de células y es abundante en osteoclastos y macrófagos alveolares (Snipes, Lam, Dodd, Gray y Cohen, 1986). TRAcP es una enzima característica de los osteoclastos y su expresión está estrechamente relacionada con la función de los osteoclastos, considerada como un indicador de la actividad de los osteoclastos y la resorción ósea (Minkin, 1982). En nuestro estudio, CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)inhibió el número de células positivas para TRAcP, lo que indica que la osteoclastogénesis inducida por RANKL fue bloqueada por CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido). La degradación de la matriz ósea por parte de los osteoclastos depende de la catepsina K (CTSK) y las MMP (Gruber, 2015). Aquí, CDP reguló significativamente a la baja la expresión de genes funcionales de osteoclastos como Mmp9, Ctsk y Acp5.

La diferenciación y la función de los osteoclastos están reguladas por múltiples vías de señalización (Boyle, Simonet y Lacey, 2003). Después de unirse a RANK, RANKL recluta la proteína adaptadora TRAF6 para activar la expresión de NFATc1, que es un factor de transcripción importante para la formación de osteoclastos, lo que afecta la expresión de genes específicos de osteoclastos, incluidos TRAcP y CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). En este estudio, encontramos que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)no tuvo efecto sobre la expresión de RANK y TRAF6 en los osteoclastos. Sin embargo, CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)inhibió la activación de NFATc1 inducida por RANKL durante la osteoclastogénesis de BMM. Además, se demostró que las ROS, producidas por las mitocondrias en el proceso de entrega de electrones, promueven la proliferación y diferenciación de osteoclastos y regulan la degradación de la matriz ósea (Ha et al., 2004). Un estudio reciente encontró que RANKL indujo la importación nuclear de Bach1 y atenuó la producción de enzimas antioxidantes mediada por Nrf2, aumentando así la expresión de ROS intracelular y la osteoclastogénesis en ratones (Kanzaki et al., 2017). Además, el aumento de la generación intracelular de ROS por parte de la homocisteína mejoró la formación y la actividad de los osteoclastos (Koh et al., 2006). Nuestro estudio encontró que CDP redujo la acumulación de ROS en los osteoclastos al inhibir la expresión de NOS2 y promover la expresión de enzimas antioxidantes, como TRX1 y glutatión reductasa. Cuando tratamos los BMM con peróxido para mejorar la acumulación de ROS intracelular, los resultados de que el aumento de ROS podría mejorar la expresión de NFATc1 revelaron que ROS estaba aguas arriba de NFATc1. También encontramos que el peróxido rescató el efecto inhibitorio de CDP sobre la expresión de NFATc1. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la CDP suprime la acumulación de ROS para inhibir la expresión de NFATc1 y luego reprimir la formación y función de los osteoclastos.

ERK, JNK y p38 pertenecen a la familia MAPK, que también está involucrada en la regulación de la diferenciación de osteoclastos (Seger & Krebs, 1995). RANKL activa la vía MAPK al aumentar la fosforilación de ERK, JNK y p38 (Mizukami et al., 2002). Demostramos que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)reprimió la fosforilación mediada por RANKL de proteínas clave en la vía MAPK, contribuyendo así al efecto inhibitorio de CDP sobre la expresión de genes marcadores de osteoclastos. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que muestra los efectos inhibidores de la CDP.(Cistanchedeserticolapolisacárido)en la producción de ROS, NFAT y activación de MAPK, lo que representa nuevos mecanismos de acción de CDP in vitro.

En resumen, demostramos que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)atenúa la osteoclastogénesis y la reabsorción de hidroxiapatita, y la expresión de genes marcadores de osteoclastos, incluidos Ctsk, Mmp9 y Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)fue capaz de suprimir la producción de ROS mediada por RANKL, así como la activación de NFAT y MAPK (Figura 8). Colectivamente, nuestros resultados sugieren que CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)puede representar un fármaco candidato para el tratamiento de afecciones relacionadas con osteoclastos acompañadas de sobreproducción de ROS.

FIGURA 8 Diagrama esquemático de CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)Función en la diferenciación de osteoclastos. CDP(Cistanchedeserticolapolisacárido)suprime la producción de ROS inducida por RANKL, así como la activación de NFATc1 y MAPK, por lo tanto, inhibe la osteoclastogénesis. CDP,Cistanchedeserticolapolisacárido; MAPK, proteína quinasa activada por mitógeno; NFATc1, factor nuclear de célula T activada; RANKL, ligando activador del receptor del factor nuclear κB; ROS, especies reactivas de oxígeno [La figura en color se puede ver en wileyonlinelibrary.com]

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este estudio fue apoyado por la Nature Science Foundation de China (81572164), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de Tecnología Clave de China (2017YFC1103300), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangxi (2016GXNSFAA380295) y el Proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología de la Universidad de Guangxi Provincia (KY2015YB054). También cuenta con el apoyo parcial del Proyecto del Plan de Desarrollo de Tecnología e Investigación Científica de Guangxi (GKG13349003, 1598013‐15), el Fondo de Infraestructura de Investigación Médica y de Salud de Australia Occidental, la Fundación Arthritis Australia, los Premios de Colaboración en Investigación de la Universidad de Australia Occidental (UWA) y el Consejo Australiano de Investigación Médica y de Salud (NHMRC, Nos. 1107828 y 1027932).

CONFLICTOS DE INTERÉS

Los autores declaran que no existen conflictos de interés

De: 'Cistanchedeserticolapolisacáridoatenúa la osteoclastogénesis y la resorción ósea al inhibir la señalización de RANKL y la producción de especies reactivas de oxígeno por Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684