Cistanche: producción de óxido nítrico inducida por echinacósido en células endoteliales: funciones del receptor de andrógenos y la vía PI3K‑Akt

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU y XIN LIU

Introducción

CistancheHoffmg. Et Link es una hierba parásita perenne de un género de la familia Orobanchaceae. HerbaCistanche, el tallo deCistanche deserticolaY.c. MA yCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight, se han utilizado como agente tónico para tratar la deficiencia renal, la impotencia, la leucorrea mórbida y el estreñimiento senil (1), lo que puede deberse a su efecto regulador similar a los andrógenos o las hormonas sexuales (2).echinacósido(EcH; c35H46O20;

peso molecular, 786,73; Fig. 1), es uno de los glucósidos feniletanoides (PhG) aislado de los tallos de HerbaCistanche, y exhibe múltiples propiedades biológicas, incluyendo efectos antioxidantes, antienvejecimiento, antiinflamatorios, hepatoprotectores y neuroprotectores (3). Las investigaciones farmacológicas modernas han demostrado que varios constituyentes de HerbaCistanche, incluidos EcH, acteoside, kankanose, kankanoside F y cistanoside F, exhiben actividad vasorrelajante (4).

El endotelio es un regulador crítico de la vasculatura y el óxido nítrico (NO) es un importante factor relajante liberado por las células endoteliales. Al difundirse en las células del músculo liso, el NO activa la guanilato ciclasa, aumenta los niveles de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) y luego activa las proteínas quinasas (PKG) dependientes de cGMP para promover la relajación del músculo liso (5). Se demostró previamente que EcH a 350-400 µM actúa directamente sobre el músculo liso vascular e inhibe la proliferación inducida por hipoxia en células de músculo liso de arteria pulmonar de rata (6), mientras que 30-300 µM EcH causó una vasorrelajación aguda en el endotelio- anillos intactos de una manera dependiente de la concentración y una mayor producción de cGMP en el músculo liso del cuerpo cavernoso de los anillos aórticos contraídos por la fenilefrina (7). Al abrir los canales de NO-cGMP-PKG-BKca en las células del músculo liso, EcH 100 o 300 µM suprimió la contracción inducida por noradrenalina en las arterias pulmonares de ratas, particularmente en los anillos denudados de endotelio (8). Las células endoteliales son reguladores clave de la función cardiovascular y, en varios casos, se ha encontrado que la relajación dependiente del endotelio se debe a una sustancia transferible, como el NO, liberada del endotelio (9). Sin embargo, el mecanismo molecular corriente arriba de la producción de NO inducida por EcH en las células endoteliales vasculares requiere más investigación.

En el endotelio vascular, la generación de NO está mediada principalmente por la NO sintasa endotelial (eNOS). Varios grupos han demostrado que la vía de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) activa la serina treonina proteína cinasa B (Akt), que provoca la fosforilación directa de eNOS en la serina 1177 (Ser1177) (10). El receptor de andrógenos (AR) es un miembro de la subfamilia de receptores nucleares s3, que modifica canónicamente la expresión génica. La localización de AR en las caveolas de la membrana celular está involucrada en

la regulación no genómica de la función de las células endoteliales o la expresión génica mediante la activación de la cascada c-Src/PI3K/Akt, que finalmente da como resultado la fosforilación de eNOS y la producción de NO (11). En las células endoteliales aórticas humanas, se ha informado que la testosterona activa la señalización de PI3K/Akt e induce rápidamente la producción de NO debido a la interacción directa de AR y la subunidad p85 de PI3K en el sistema cardiovascular (12). Se informó que EcH agrava los síntomas relacionados con la deficiencia hormonal y ejerce sus efectos similares a los andrógenos debido a la unión competitiva con el AR en lugar de la testosterona (2). Por lo tanto, el presente estudio planteó la hipótesis de que la vía PI3K/Akt puede estar involucrada en la producción de NO a través de la fosforilación de eNOS dependiente de AR inducida por EcH. El objetivo del presente estudio fue evaluar los siguientes efectos de EcH: i) Inducción de la producción de NO y fosforilación de eNOS; ii) participación de AR en la fosforilación de eNOS; y iii) la activación de la vía PI3K/Akt en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEcs), un modelo experimental muy conocido para estudiar la regulación de las funciones de las células endoteliales y la angiogénesis (13).

Materiales y métodos

quimicos y reactivosEcH (pureza, 92,5 por ciento) se obtuvo de los Estándares Nacionales de Referencia de Medicamentos en el Instituto Nacional para el Control de Alimentos y Medicamentos. Los anticuerpos contra p-Akt (Ser473; n.° de cat. ab8805), Akt (n.° de cat. ab81283), p-eNOS (Ser1177; n.° de cat. ab184154) y eNOS (n.° de cat. ab76198) se adquirieron de Abcam. Los inhibidores de nilutamida e IcI 182780 se obtuvieron de Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME se adquirió de Adamas-Beta, Ltd., y wortmannin se adquirió de Pribolab.

Célula cultura anddrug tratamiento.Las HUVEc se obtuvieron de Sciencell Research Laboratories Inc. y se cultivaron en medio de células endoteliales (EcM; Sciencell Research Laboratories) con 5 por ciento (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) y 1 por ciento de células endoteliales. suplemento de crecimiento (ECGS) a 37˚C (5 por ciento de CO2 y 95 por ciento de humedad) (14). Al llegar a la confluencia, las células se digirieron con tripsina y se sembraron en EcM con FBS al 1 por ciento y EcGS al 1 por ciento. Para todos los experimentos, se sembraron HUVEcs a una concentración de 1x104/ml y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia. Antes del tratamiento con EcH u otros estimuladores, las células se incubaron en EcM libre de rojo fenol sin FBS y EcGS durante 6 h para inducir

detención del crecimiento. En los experimentos inhibidores, las HUVEc se preincubaron con varios antagonistas o inhibidores, incluidos 10 µM de nilutamida, 10 µM de IcI 182780, 0,5 mM de L-NAME o 5 µM de wortmanina, durante 30 min. con o sin ECH, a 37˚C. En todos los grupos, incluido el control, se usó dMSO como solvente en concentraciones iguales de 0.001 por ciento.

Medida de intracelular Sin producción.

Los cambios relativos en la concentración de NO citosólico en HUVEcs se monitorearon utilizando la sonda de NO fluorescente DAF-FM (Cayman Chemical Company), como se informó anteriormente (12). Brevemente, las células se cargaron con diacetato de DAF‑FM 5 µM durante 20 min a 37 °C en una placa de microtitulación negra y se enjuagaron varias veces con PBS (pH 7,4). La fluorescencia se determinó a longitudes de onda de excitación y emisión de 495 y 515 nm, respectivamente, utilizando un lector de microplacas fluorescentes (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) y un microscopio invertido compacto (Nikon eclipse Ts2R; Nikon corporation).

occidental mancha análisis.Como se informó anteriormente (15), las monocapas confluentes de células se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo y se lisaron con tampón RIPA (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). La concentración de proteína en el sobrenadante se midió utilizando el método de ensayo del ácido bicinconínico (16). Posteriormente, se cargaron 30 µg de proteína por carril, se separaron utilizando geles de poliacrilamida al 10 por ciento y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % durante 1 hora a 25 ºC. Después de la incubación con anticuerpos monoclonales contra Akt (dilución 1:1, 000), p-Akt (dilución 1:500), eNOS (dilución 1:2, 000) o p-eNOS (dilución 1 :1,000 dilución) a 4˚C durante la noche, las membranas se lavaron con TBST (que contenía 0,1 por ciento de Tween-20) 4 veces durante ~15 min por lavado a 25˚C. Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:5, 000; anticuerpo anti-ratón, n.º de cat. A0216, o anticuerpo anti-conejo, n.º de cat. A0208, Beyotime Institute de biotecnología) durante 1 h a 25 ˚C y se detectó con un kit de quimioluminiscencia mejorado (n.º de cat. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software de análisis de gel Image J, versión 1.8.0_112 (Institutos Nacionales de Salud).

Pequeña entrometido (si) ARN preparación y transfección.Los ARN de doble cadena largos fueron sintetizados por el ARNm diana del AR y el receptor de estrógeno (ER) con las secuencias que se muestran en la Tabla I. Las condiciones para la eliminación de siRNA involucraron la transfección de HUVEC al 70 por ciento de confluencia mantenida en un ambiente no antimicrobiano. medio de cultivo en placas de cultivo recubiertas de colágeno de 60 mm. La transfección de 5 nM AR-siRNA o 10 nM ER-siRNA con reactivo Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) se realizó por separado, de acuerdo con los protocolos del fabricante. La eficacia de la transfección se evaluó mediante análisis de PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPcR), como se informó anteriormente (17). Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: 10 min a 95˚C; 40 ciclos de 95˚C por 5 seg y 60˚C por 1 min, y una curva de fusión a 95˚C por 15 seg, 60˚C por 1 min y 95˚C por 15 seg; Se realizaron tres réplicas biológicas independientes para cada muestra. Los experimentos posteriores se realizaron 48 h después de la transfección. Los pares de cebadores se diseñaron utilizando el software Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) con las siguientes secuencias: AR hacia delante, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' y hacia atrás, 5'-GAcTTGTTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER adelante, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' y atrás, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; y GAPdH adelante, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' y atrás, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Estadístico análisis.Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron utilizando la prueba de Kruskal-Wallis o ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultados

ECH induce NO producción y fosforilación de eNOS.Como se muestra en la Fig. 2A y B, ECH 1 µM aumentó significativamente la producción de NO intracelular en HUVEcs en comparación con las células de control negativo, mientras que el efecto estimulador de EcH se atenuó al nivel de control mediante el pretratamiento con L-NAME. Para obtener la concentración óptima, se probó la fosforilación de eNOS a los 60 min después del tratamiento con EcH a concentraciones

de {{0}}, 0.01, 0.1, 1 y 10 µM. Los resultados revelaron que EcH en concentraciones de 0.01-10 µM puede inducir significativamente la fosforilación de eNOS en Ser 1177 de una manera dependiente de la concentración, con la fosforilación máxima de eNOS observada en la inducción de EcH 10 µM (Fig. 2c y d). Además, la fosforilación de eNOS en Ser1177 se examinó mediante análisis de transferencia Western a los 0, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la incubación con EcH 1 µM. Se observó que la fosforilación de eNOS se desencadenó rápidamente por EcH a los 5 min y continuó aumentando hasta los 30 min de incubación (Fig. 2E y F). Posteriormente, a pesar del tratamiento con EcH, la magnitud relativa de la fosforilación de eNOS se mantuvo estable a partir de los 30 min; por lo tanto, EcH no afectó la expresión total de eNOS (Fig. 2c y E).

Arkansas media inducida por ECH NO producción y eNOSLos efectos de interferencia de AR-siRNA-1 y ER-siRNA-2 fueron los más exitosos en la inhibición de la expresión de AR y ER en HUVEcs en el presente estudio (Fig. 3). Posteriormente, se aplicaron un antagonista para el análisis de inhibición de la función de AR y siRNA para el análisis de pérdida de función de AR para evaluar la participación de AR en la activación de eNOS inducida por EcH y la producción de NO. Como se muestra en la Fig. 4A, ECH 1 µM aumentó significativamente la producción de NO en HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH activa la PI3K/Act ruta.En el presente estudio, la fosforilación de Akt en Ser473 se probó 60 min después de la incubación con EcH a concentraciones de 0, 0.01, 0.1 , 1 y 10 µM. Los resultados indicaron que EcH (0.01-10 µM) puede inducir significativamente la fosforilación de Akt. Los niveles de expresión relativos de p-Akt alcanzaron su punto máximo a 1 y 10 µM de tratamiento con EcH (Fig. 5A y B). Además, la fosforilación de Akt se examinó mediante análisis de transferencia Western a los 0, 5, 15, 30, 60 y 120 min después de la adición de EcH 1 µM a cultivos HUVEc. Como se muestra en las Fig. 5c y d, EcH aumentó rápidamente la fosforilación de Akt después de 5 min de incubación, y el nivel máximo de proteína de p-Akt se observó a los 60 min. Por el contrario, EcH no afectó la expresión total de Akt (Fig. 5A y c). Además, para investigar el efecto potencial de la vía PI3K en la fosforilación de eNOS, las HUVEc se trataron previamente con el inhibidor de PI3K wortmannin antes de la aplicación de EcH. Se descubrió que la wortmanina reduce la producción de NO inducida por EcH a los niveles de referencia (Fig. 5E). Se observó un fenómeno similar usando microscopía de fluorescencia al examinar la fluorescencia DAF-FM inducida por EcH (Fig. 5F). Además, la wortmanina puede tener la capacidad de suprimir la fosforilación rápida de eNOS en HUVEcs (Fig. 5G y H). Los resultados antes mencionados sugieren que EcH puede activar la fosforilación de eNOS y la producción de NO a través de la vía PI3K/Akt.

Discusión

EcH es un compuesto natural aislado de HerbaCistanche, con diversas propiedades farmacológicas. Anteriormente se demostró que EcH ejercía un efecto de relajación vascular dependiente del endotelio al abrir los canales de NO-cGMP-PKG-BKca en las células del músculo liso de los vasos sanguíneos (7,8). Los hallazgos actuales proporcionan evidencia de que ECH ejerció la activación de eNOS dependiente de AR para inducir la producción de NO con la participación de la vía de señalización PI3K/Akt en las células endoteliales vasculares.

Como la capa más interna de la pared del vaso, el endotelio puede detectar y responder rápidamente a los cambios en el flujo sanguíneo, lo que a su vez da como resultado la transmisión de señales a las células musculares lisas subyacentes para regular el tono vascular (18). Se ha informado ampliamente que existen múltiples compuestos vasodilatadores derivados del endotelio, con la sustancia más prototípicasiendo NO, formado a partir de la isoforma endotelial de eNOS, lo que da como resultado la fosforilación (19). En condiciones normales, la eNOS permanece inactiva cuando se une a la caveolina y se activa con la siguiente sucesión de eventos en el endotelio.células: i) eNOS se disocia de la caveolina-1 y se asocia con ca2 plus /caM; ii) la proteína de choque térmico (HSP)90 promueve eNOSdimerización y favorece una formación estérica para reclutar Akt; y iii) la calcineurina desfosforila Thr495 para reforzar el estado de activación (20). En el presente estudio, la producción de NO aumentó significativamente en las HUVEC tratadas con ECH 1 µM. Este fenómeno fue similar a resultados previos, donde EcH aumentó la liberación de NO y estimuló la síntesis de cGMP en anillos aórticos torácicos de rata (7). Además, dos sitios de fosforilación, Ser1177 y Thr495, parecen ser particularmente importantes para regular la actividad de eNOS (20), y el presente estudio reveló que EcH indujo la fosforilación aguda de eNOS en Ser1177 de una manera dependiente de la concentración. Además, los estímulos asociados con los efectos sobre los niveles de proteína de eNOS determinan principalmente la estabilidad del ARNm de eNOS, y si el estímulo se mantiene durante un período de tiempo más prolongado, la transcripción del ARNm de eNOS se produce a través de la proteína quinasa activada por mitógeno y el factor nuclear κB (20). En conjunto, estas observaciones indican que la activación de eNOS en Ser1177 es responsable de la síntesis de NO inducida por EcH.

Además, un número creciente de estudios ha demostrado que AR se expresa en células endoteliales en varios tejidos humanos, lo que sugiere un papel potencial para los andrógenos y sus análogos, que actúan a través de procesos mediados por AR, en la modulación del endotelio humano. homeostasis celular (21). En la vía no clásica PI3K/Akt, AR puede activar PI3K al interactuar directamente con la subunidad reguladora p85 de PI3K (22). El presente estudio demostró que un antagonista de AR o AR siRNA disminuyó la producción de NO y la fosforilación de eNOS inducida por EcH en HUVEcs. Se ha informado previamente que los estrógenos inducen la fosforilación de eNOS y estimulan la producción de NO a través de la activación clásica de ER en las células endoteliales (23), y la administración de ECH aumenta significativamente la expresión de ER en el útero (24). Sin embargo, en el presente estudio, el efecto de AR fue más prominente en comparación con el de ER en la activación de eNOS inducida por EcH y la producción de NO. Además, se observó que EcH provocó la producción aguda de NO en minutos a través de la activación de eNOS involucrada en AR en HUVEcs, lo que es consistente con la naturaleza no genómica de la respuesta en las células endoteliales. El AR está asociado con proteínas de andamiaje, incluidas HSP90, HSP70 y quinasa Src, en el citoplasma, y ​​puede transportarse a la membrana desde el complejo AR dentro de los 5 minutos posteriores al tratamiento con testosterona (23). Con base en la estrategia de "pesca de objetivos", se identificó HSP90 como el objetivo acoplado a PhG, lo que indicó que EcH puede facilitar la disociación de AR de las proteínas de andamiaje (25). Otro estudio sugirió que, en el hipotálamo, EcH puede combinarse con el bolsillo AR en los aminoácidos Met-894 y Val-713 e inhibir el transporte de AR citoplasmático al núcleo (26). Sin embargo, el mecanismo subyacente a través del cual EcH media la translocación del AR citoplásmico a la membrana requiere más investigación. Por lo tanto, se requiere más investigación para dilucidar el mecanismo a través del cual EcH logra la activación de eNOS dependiente de AR y cómo puede estar asociado con la unión a HSP90 en las células endoteliales vasculares.

La vía PI3K/Akt es una de las cascadas de señalización más importantes, cuya activación se induce mediante la producción de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato para unirse al dominio de homología pleckstrina N-terminal de la Ser/ Thr quinasa Akt. Esto facilita el reclutamiento de Akt a la membrana plasmática (27). La vía PI3K/Akt puede desempeñar un papel importante en el control de la relajación dependiente de NO inducida por EcH.

El presente estudio reveló que la producción de NO inducida por EcH se redujo significativamente cuando las células se incubaron con el inhibidor de PI3K wortmannin. Un informe anterior demostró que 15 mg/kg de EcH activaron la vía de señalización de PI3K/Akt en células de la médula ósea suprimidas con 5‑fluorouracilo (28). En el presente estudio, los inhibidores de PI3K redujeron significativamente la fosforilación de eNOS inducida por EcH en Ser1177. Además, la actividad de Akt estaba predominantemente regulada por vías reguladoras aguas arriba, particularmente la fosforilación dependiente de PI3K en Ser473 (20). En el presente estudio, EcH indujo la fosforilación de Akt en Ser473 de manera dependiente de la dosis; De manera similar, un estudio previo demostró que EcH 5, 10 o 20 µM ejercía un efecto cardioprotector frente al tratamiento de anoxia/reperfusión de manera dependiente de la dosis al aumentar potencialmente p-Akt y SLc8A3 (29). La regulación transcripcional del gen Akt sigue siendo en gran parte desconocida (30); por lo tanto, el presente estudio se centró en los efectos reguladores postranscripcionales de EcH en Akt. Teniendo en cuenta los hallazgos antes mencionados, se infirió que la aplicación de EcH a HUVEcs puede conducir a la activación de la vía PI3K/Akt, que fosforila eNOS y, posteriormente, aumenta la producción de NO.

En conclusión, EcH es un producto natural aislado principalmente de HerbaCistanche.El mecanismo potencial subyacente a la producción de NO inducida por EcH en células endoteliales puede incluir lo siguiente (Fig. 6): i) EcH actúa como un ligando funcional de AR que se localiza en las caveolas de la membrana celular; ii) PI3K se une al dominio hidrófobo de Akt en Ser473 y facilita el reclutamiento de Akt en la membrana celular; iii) el reclutamiento de las cascadas PI3K/Akt desencadena la fosforilación de eNOS dependiente de AR; y iv) la generación de NO está mediada por eNOS en células endoteliales. La observación de que EcH induce la producción de NO a través de la fosforilación de eNOS dependiente de AR con la participación de la vía PI3K/Akt puede contribuir a una mayor comprensión de los efectos vasorrelajantes de EcH. Además, la EcH dirigida a las vías del NO derivadas del endotelio puede deberse a efectos no genómicos. Por lo tanto, el presente estudio puede ayudar a dilucidar los mecanismos a través de los cuales EcH ejerce sus efectos farmacológicos para prevenir enfermedades cardiovasculares.

Agradecimientos

No aplica.

Fondos

El presente estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención no. 81503333).

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Autores contribuciones

LG y XL concibieron y diseñaron los experimentos. dL y YZ realizaron los experimentos. WZ y JG analizaron los datos. LG redactó el manuscrito. XL revisó y editó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

1202 GUet Alabama: EL EQUINACÓSIDO INDUCE LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO MEDIANTE LA VÍA PI3K/AKT DEPENDIENTE DE AR

Ética aprobación y consentir a participar

No aplica.

Paciente consentir por publicación

No aplica.

compitiendo intereses

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

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