Abstracto

La presente invención divulga unaExtracto de Cistanche para mejorar la densidad mineral ósea (DMO). En el extracto, elContenido total de equinacósido y acteósido (verbascósido).es>25% en peso. El extracto se prepara realizandoextracción con agua destiladadepolvo crudo decistanche tubulosa, seguido defiltración, centrifugacióndel filtrado,concentración, extracción líquido-líquido, concentración con eliminación de impurezas, dilución, post-tratamiento, y luegoconcentración final y secadopara obtener el extracto de Cistanche.

 

 

Proceso de extracto de cistanche

En el extracto de Cistanche para mejorar la densidad mineral ósea según la invención, elContenido total de equinacósido y acteósido.es25–30% en peso(excluyendo el 25 en peso%), y el extracto también es rico enácido shikímicoasí comocomponentes de tipo ácido fenilpropiónicoycomponentes de tipo alcaloide, permitiéndoleejercer de forma estable un efecto de mejora de la densidad ósea.

 

Reclamos

1. Método de preparación

Un método para preparar un extracto de Cistanche para mejorar la densidad mineral ósea, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

aplastantecistanche tubulosapara obtener polvo crudo decistanche tubulosa;

añadiendo agua destilada al polvo crudo decistanche tubulosapara extracción, filtración, centrifugación del filtrado y concentración para obtener una solución concentrada decistanche tubulosa;

extraer la solución concentrada decistanche tubulosa, concentrando la fase de extracción inferior para eliminar impurezas y diluyendo para obtener una solución de carga;

postratamiento de la solución de carga, seguido de concentración y secado para obtener el extracto de Cistanche.

2. Relación de material a agua

2. El método según la reivindicación 1, en el que la relación masa-volumen del polvo crudo decistanche tubulosaal agua destilada es1 : (15–25).

3. Temperatura de extracción

2. El método según la reivindicación 1, en el que la temperatura de extracción del agua destilada es60-100 grados.

4. Relación durante la extracción líquido-líquido

2. El método según la reivindicación 1, en el que durante la extracción de la solución concentrada, la relación en volumen de la solución concentrada decistanche tubulosaal disolvente de extracción es1 : (1–5).

5. Disolvente de extracción

5. El método según la reivindicación 4, en el que el disolvente de extracción comprende al menos uno deéter de petróleo, acetato de etilo, n-hexano o ciclohexano.

6. Proceso posterior al tratamiento

2. El método según la reivindicación 1, en el que el postratamiento de la solución de carga comprende: pasar la solución de carga a través de unresina macroporosa, y luego eluir secuencialmente conagua destiladay unsolución de etanol.

7. Volúmenes de elución

7. El método según la reivindicación 6, en el que la relación en volumen de agua destilada a resina macroporosa es(5–10) : 1, y la relación en volumen de la solución de etanol a la resina macroporosa es(3–9) : 1.

8. El extracto

8. Extracto de Cistanche para mejorar la densidad mineral ósea, caracterizado porque se prepara según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Contenido del marcador activo

9. El extracto de Cistanche según la reivindicación 8, en el que el contenido total de equinacósido y acteósido es25–30% en peso, excluyendo el 25% en peso.

10. Solicitud

10. Uso del extracto de Cistanche según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 en la preparación de un producto para mejorar la densidad mineral ósea, en el que la concentración del extracto de Cistanche en el producto es12,5 a 25 ug/ml.

 

Campo Técnico

La presente invención se refiere al campo deformulaciones médicas, y se refiere específicamente a unExtracto de Cistanche para mejorar la densidad mineral ósea., esmétodo de preparación, yaplicaciones.

Fondo

[0002] Cistanche se refiere al tallo carnoso seco con hojas escamosas de las plantas Orobanchaceae.Cistanche deserticola YC MaoCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche tiene múltiples actividades comoregulación inmune, antiinflamatorio, antifatiga, antioxidante, neuroprotector, yapoyo al sistema reproductivo.

Glucósidos feniletanoides (PhG) -conechinacósidoyacteosido (verbascosido)siendo los principales PhG en Cistanche, son componentes importantes.equinacósidoSe ha demostrado que tiene un efecto sobremejorar la densidad mineral ósea. Sin embargo, descubrimos que el efecto de mejora de la densidad ósea de los extractos de Cistanche esno se correlaciona únicamente con el contenido de equinacósido. Controlar simplemente el contenido de equinacósidono puedo asegurarque el extractoestablementeejercen un efecto de mejora de la densidad ósea. Por lo tanto, es crucial desarrollar un extracto de Cistanche y un método de preparación que puedaestablementeProporcionar el efecto deseado de apoyo a la densidad ósea.

[0003] Solicitud de patente de invención chinaCN102441040Adescribe un método de preparación para glucósidos de feniletanoide totales de Cistanche mediante pulverización, extracción, adsorción de resina macroporosa, elución, concentración, etc. En condiciones débilmente ácidas (pH 2-4), la estabilidad de los glucósidos de feniletanoide de Cistanche mejora significativamente y los glucósidos totales resultantes contienen echinacósido y acteósido en una proporción combinada > 90 %. Sin embargo, no verifica si el producto puedeestablementemejorar la densidad mineral ósea.

Solicitud de patente de invención chinaCN105111255Adescribe un método para la extracción y separación de equinacósido y acteósido de Cistanche, usando 75 % de etanol como disolvente de extracción, AB-8 resina macroporosa como material de relleno y 55 % de elución con etanol, produciendo un extracto de Cistanche con echinacósido > 25 %, acteósido > 10 % y PhG totales > 80 %. Sin embargo, es posible que todavía no garantice unaestableefecto de mejora de la densidad ósea.

 

Resumen de la invención

[0004] Desarrollar un extracto de Cistanche y un método de preparación que puedaestablementerespaldar una densidad mineral ósea mejorada, la invención proporciona:

Primer aspecto: método de preparación

Un método de preparación de un extracto de Cistanche para mejorar la densidad mineral ósea, que comprende:

aplastantecistanche tubulosaobtener polvo crudo;

extraer el polvo crudo con agua destilada, filtrar, centrifugar y concentrar para obtener una solución concentrada;

realizar extracción; concentrar la fase inferior para eliminar impurezas; diluir para obtener una solución de carga;

postratar la solución de carga, concentrar y secar para obtener el extracto de Cistanche.

[0005] En una realización, el polvo bruto se pasa a través de unmalla 40tamiz.

[0006] En una realización, la relación masa-volumen de polvo crudo a agua destilada es1 : (15–25).

[0007] En una realización, la relación masa-volumen es1 : 20.

[0008] En una realización, la temperatura de extracción es60-100 grados.

[0009] En una realización, la temperatura de extracción es80 grados.

[0010] En una realización, la extracción se realiza1 o 2 veces, 1 hora cada vez.

[0011] En una realización, la filtración se realiza a través de unmalla 80filtrar.

[0012] En una realización, la velocidad de centrifugación es3000-4000 rpmy el tiempo es3 a 9 minutos.

[0013] En una realización, la velocidad de centrifugación es3500 rpmy el tiempo es5 min.

[0014] En una realización, después de la centrifugación, el filtrado se concentra a70 gradosa18%–28%del volumen inicial.

[0015] En una realización, durante la extracción de la solución concentrada, la relación en volumen de la solución concentrada al disolvente de extracción es1 : (1–5).

[0016] En una realización, la relación es1 : 3.

[0017] En una realización, el disolvente de extracción comprende al menos uno deéter de petróleo, acetato de etilo, n-hexano o ciclohexano.

[0018] En una realización, la extracción se realiza secuencialmente usandoéter de petróleoseguido poracetato de etilo.

[0019] En una realización, "concentración con eliminación de impurezas" significa concentrar la fase de extracción inferior hasta obtener una pasta, disolviéndola en300 ml de etanol acuoso al 50% en pesopara eliminar impurezas y ajustar1,0–1,5 g de hierba cruda por mlcomo solución de carga.

[0020] En una realización, la concentración de la solución de carga es1,0–1,5 g de hierba cruda/ml de agua.

[0021] En una realización, el postratamiento comprende pasar la solución de carga a travésresina macroporosa, y luego eluir secuencialmente conagua destiladay unsolución de etanol.

[0022] En una realización, el caudal de carga a través de la resina macroporosa es1-5 ml/min.

[0023] En una realización, la resina esAB-8 resina macroporosacon un volumen de resina de0.93 L.

[0024] En una realización, la relación en volumen de agua destilada a resina es(5–10) : 1, y la relación en volumen de la solución de etanol a la resina es(3–9) : 1.

[0025] En una realización, la relación en volumen de agua destilada a resina es7 : 1, y la proporción de solución de etanol a resina es6 : 1.

[0026] En una realización, la solución de etanol es80% (p/p) de etanol acuoso.

Segundo aspecto: el extracto

La invención proporciona además un extracto de Cistanche preparado mediante el método anterior.

[0028] En una realización, el contenido total de equinacósido y acteósido es25–30% en peso, excluyendo el 25% en peso.

Tercer aspecto: uso

La invención proporciona además el uso del extracto de Cistanche en la preparación de productos para mejorar la densidad mineral ósea, donde la concentración del extracto en el producto es12,5 a 25 ug/ml.

 

Ventajas / Efectos Beneficiosos

[0030] En comparación con la técnica anterior, la invención tiene los siguientes efectos beneficiosos:

El extracto de Cistanche contiene25–30% en pesoechinacósido total y acteósido, y es rico enácido shikímico, componentes de tipo ácido fenilpropiónico, alcaloides, yácidos grasos, permitiéndoleestablementeApoyar la mejora de la densidad mineral ósea.

dentro del12,5 a 25 ug/mlrango de concentración, el extracto promueve la proliferación deMC3T3-E1Células con excelentes efectos proliferativos.

El extracto muestra la misma tendencia relacionada con la dosis en la promoción de la proliferación celular yActividad de ALP, y puede promover de manera estable la proliferación y diferenciación. Al promover la mineralización de los osteoblastos, muestra un mejor efecto que el control positivo.17 -estradiol.

El extracto estimula los factores de transcripción específicos de los osteoblastos.runx2yosx, mejora la diferenciación de osteoblastos y promueve la expresión de marcadores osteogénicosOPNyOCN, promoviendo así la formación de hueso. También aumentaARNm de Bmp2expresión para mejorar la diferenciación de osteoblastos y la formación de hueso nuevo activando elVía BMP/Smad; además, regulandoARNm de Lrp5, ARNm de Lrp6, yARNm de Wnt3, se activaSeñalización Wnt/-catenina, afecta la expresión del factor de transcripción en sentido descendente y promueve la diferenciación de osteoblastos y la formación de hueso.

El método de preparación produce un extracto que contiene glucósidos feniletanoides (equinacósido y acteósido), ácido shikímico y ácidos fenilpropiónicos, alcaloides y ácidos grasos. Estos componentes juntos permiten que el extracto muestre una dependencia constante de la dosis en la proliferación, diferenciación y mineralización, lo que permite efectos estables de apoyo a la densidad ósea.

 

Breve descripción de los dibujos.

[0035] Fig. 1: Efecto del extracto (Ejemplo 1) sobre la proliferación de células MC3T3-E1
Fig. 2: Efecto del extracto (Ejemplo 2) sobre la proliferación celular MC3T3-E1
Fig. 3: Efecto del extracto (Ejemplo 3) sobre la proliferación celular MC3T3-E1
Fig. 4: Efecto del extracto (Ejemplo 1) sobre la actividad ALP
Fig. 5: Efecto del extracto (Ejemplo 2) sobre la actividad ALP
Fig. 6: Efecto del extracto (Ejemplo 3) sobre la actividad ALP
Fig. 7: Fotos de la tinción con rojo de alizarina de la mineralización de osteoblastos (Ejemplo 2)
Fig. 8: Resultados cuantitativos de la mineralización de osteoblastos (Ejemplo 2)
Fig. 9–12: Efectos del ejemplo 2 en la expresión de ARNm de Runx2, Osx, Opn, Ocn
Fig. 13: Efecto del ejemplo 2 sobre la expresión del ARNm de Bmp2 (BMP/Smad)
Fig. 14–16: Efectos del ejemplo 2 sobre la expresión de ARNm de Lrp5, Wnt3 y Lrp6 (Wnt/-catenina)
Fig. 17–18: Efectos del ejemplo 2 sobre la expresión de las proteínas Osx y RUNX2

 

Descripción detallada/Realizaciones

Ejemplo 1

[0036] Un método de preparación comprende:

aplastantecistanche tubulosa, pasando por un tamiz de malla 40 para obtener200 gpolvo crudo;

extrayendo conagua destilada a 5× masa(como se describe), extrayendo en75 gradospara2 veces, 1 hora cada uno, concentrándose en70 gradosa una relación de concentración de1 : 2.2obtener una solución concentrada;

agregar etanol absoluto a la solución concentrada para la precipitación gradual de etanol con concentraciones finales en masa de etanol de20%, 40%, 60%, 80%, precipitando en5 grados durante 24 h, recogiendo el sobrenadante después80% en pesoprecipitación con etanol;

concentrar y secar a70 gradospara obtener el extracto de Cistanche, con un rendimiento de20.75%.

Ejemplo 2

[0037] Un método de preparación comprende:

aplastantecistanche tubulosaobtener240 gpolvo crudo;

extraer con agua destilada, filtrar, centrifugar y concentrar para obtener una solución concentrada;

extraer la solución concentrada; concentrar la fase inferior para eliminar impurezas; diluir para obtener una solución de carga;

postratar la solución de carga; concentrar y secar a70 gradospara obtener el extracto, con un rendimiento de19.69%.

El polvo bruto pasa a través de un tamiz de malla 40.
La relación masa-volumen de polvo crudo a agua destilada es1 : 20.
La temperatura de extracción es80 grados.
[0041] Se realiza la extracción1 o 2 veces, 1 hora cada uno.
La filtración se realiza a través de unmalla 80filtrar.
[0043] La centrifugación es3500 r/min durante 5 minutos.
[0044] Concentración después de la centrifugación: concentrar a70 gradosa20%del volumen inicial.
[0045] Durante la extracción, la relación en volumen de solución concentrada a disolvente es1 : 3.
[0046] La extracción se realiza secuencialmente conéter de petróleoyacetato de etilo.
[0047] La ​​fase inferior se concentra hasta obtener una pasta y se disuelve en300 ml de etanol acuoso al 50% en pesopara eliminar impurezas.
[0048] Concentración de la solución de carga:1,0 g de hierba cruda/ml de agua.
[0049] Postratamiento: pasar a través de resina macroporosa, eluir con agua destilada y luego solución de etanol.
[0050] Caudal a través de la resina:3 ml/min.
[0051] Resina:AB-8, volumen de resina0.93 L.
Relación en volumen de agua destilada a resina:7 : 1. Relación de solución de etanol a resina:6 : 1.
[0053] Solución de etanol:80% (w/w)etanol acuoso.

 

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Ejemplo 3

[0053] Un método de preparación comprende:

aplastantecistanche tubulosa, pasando por un tamiz de malla 40 para obtener120 gpolvo crudo;

extrayendo con12× masade50% en peso de etanol acuoso, extrayendo en70 grados, 2 veces, 1 hora cada uno, concentrándose en70 gradosa una proporción de1 : 2.5obtener una solución concentrada;

añadiendo agua para ajustar la concentración a0,2 g de hierba cruda/ml de agua, centrifugando a3500 r/min durante 5 minutos, tomando el sobrenadante como solución de carga;

pasando por resina macroporosa; eluyendo secuencialmente con agua destilada y solución de etanol; recoger la elución de etanol y concentrar/secar a70 gradospara obtener el extracto con un rendimiento de24.30%.

[0054] Resina:HPD750, volumen de resina0.93 L.
[0055] Relación agua destilada a resina:3 : 1. Relación de solución de etanol a resina:4 : 1.
[0056] Solución de etanol:30% (w/w)etanol acuoso.

 

Pruebas de rendimiento

1.1 Ensayo de proliferación celular

Los osteoblastos son las principales células funcionales responsables de la formación ósea, lo que implica la proliferación de preosteoblastos, la producción de matriz ósea y la diferenciación final. ElMC3T3-E1La línea celular se utiliza comúnmente para estudiar la actividad osteogénica. La diferenciación de osteoblastos implica proliferación, diferenciación y mineralización, que se manifiesta como un aumento del número de preosteoblastos, maduración a osteoblastos y formación de nueva matriz ósea.

Fosfatasa alcalina (ALP)es una proteína relacionada con el fenotipo de los osteoblastos detectable durante la proliferación celular y la maduración de la matriz y es un marcador temprano de diferenciación de osteoblastos comúnmente utilizado.

Por lo tanto, al evaluar la proliferación de MC3T3-E1 y la actividad de ALP, se comparó la actividad promotora de la osteogénesis de los extractos preparados en los Ejemplos 1 a 3.

Se revivieron células MC3T3-E1 y se pasaron. Después de la estabilización, las células se digirieron, centrifugaron y recogieron. La densidad celular se ajustó de modo que cada 100 μl contuviera 5 × 1035 × 10 ^ 35 × 103 células y se sembró en una placa de 96 pocillos. Después del cultivo durante la noche, el medio se reemplazó con medio completo que contenía extractos del Ejemplo 1-3 en concentraciones de6,25, 12,5, 25 y 50 ug/ml, o que contiene0,1 M estradiol(control positivo), o medio solo (control en blanco), y se cultiva para48 h. En condiciones protegidas de la luz, se añadió solución madre de MTT (10%–20% del volumen del pocillo), se incubó durante4 hen una incubadora de CO₂, se retira el medio y200 µl de DMSOañadido para disolver el formazán. Los valores de DO se midieron en490 nm.

Resultados: Fig. 1 (Ejemplo 1), Fig. 2 (Ejemplo 2), Fig. 3 (Ejemplo 3).

Tasa de proliferación celular (%)=OD(Ejemplo 1–3)−OD(En blanco)OD(En blanco)×100%\\frac{OD(\\text{Ejemplo 1–3}) - OD(\\text{En blanco})}{OD(\\text{En blanco})} \\times 100\\%OD(En blanco)OD(Ejemplo 1–3)−OD(En blanco)​×100%

[0059] Como se muestra en la Fig. 1–3, el control positivo promovió la proliferación de MC3T3-E1. El Ejemplo 1 promovió la proliferación a 6,25, 12,5 y 25 ug/ml; la tasa de proliferación a 12,5 ug/ml fue 1,4 veces mayor que la del control positivo, pero sin diferencias significativas (P > 0,05). El ejemplo 2 promovió la proliferación a 6,25, 12,5, 25 y 50 ug/ml; a 12,5, 25 y 50 ug/mL sus efectos fueron superiores al control positivo (P <0,01 o P <0,001), con tasas de proliferación de 2,55 ×, 3,46 × y 2,59 × del control positivo. El ejemplo 3 promovió la proliferación a 6,25, 12,5, 25 y 50 ug/ml; a 12,5, 25 y 50 ug/mL fue superior al control positivo (P <0,01 o P <0,001), con tasas de proliferación de 1,40×, 1,76× y 0,93× del control positivo. Esto indica que el Ejemplo 2 tuvo el mejor efecto para promover la proliferación de MC3T3-E1.

1.2 Ensayo de actividad ALP

La actividad de ALP se midió usando un kit de ensayo de ALP. La concentración madre de p-nitrofenol fue 10 mM y las concentraciones de la curva estándar fueron 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 y 0,25 mM, preparadas mediante dilución en gradiente con tampón de detección.

Para cada pocillo de muestra en una placa de 96 pocillos, se agregaron 49 μl de tampón de detección, 1 μl de proteína extraída de las células MC3T3-E1 tratadas (de la sección 1.1) y 50 μl de sustrato cromogénico (agregado al final). La reacción se desarrolló durante 30 minutos en la incubadora protegida de la luz, se terminó añadiendo 100 µL de solución de parada y se midió la absorbancia a405 nm. La actividad de ALP se calculó a partir de la curva estándar.

Resultados: Fig. 4 (Ejemplo 1), Fig. 5 (Ejemplo 2), Fig. 6 (Ejemplo 3).

Actividad ALP (U/L)=(concentración molar relativa de proteína) × 1000 × 100/30
(1000 para conversión de unidades molares; 100 para volumen total de reacción; 30 para tiempo de reacción de 30 min)

La ALP es un marcador temprano de la diferenciación de MC3T3-E1. Las figuras . 4-6 muestran que el control positivo aumentó la actividad de ALP. El ejemplo 1 no promovió la actividad de ALP. El Ejemplo 2 aumentó la actividad de ALP a 12,5, 25 y 50 ug/ml; a 25 y 50 ug/mL las diferencias versus el blanco fueron significativas (P < 0,01). El Ejemplo 3 aumentó la actividad de ALP a 12,5 y 25 ug/ml (P < 0,001), pero al aumentar la concentración, la mejora disminuyó. Esto indica que sólo los Ejemplos 2 y 3 aumentaron la actividad de ALP y apoyaron la diferenciación.

En general, sólo el Ejemplo 2 mostró una correlación dosis-positiva tanto en la proliferación de MC3T3-E1 como en la actividad de ALP a 12,5 y 25 ug/ml. El Ejemplo 3 mostró una correlación de dosis positiva para la proliferación pero una correlación de dosis negativa para la FA. Comparativamente, el Ejemplo 2 es más adecuado para mejorar la densidad mineral ósea.

1.3 Mineralización (tinción con rojo de alizarina) del ejemplo 2

[0063] Dado que el Ejemplo 2 mostró la mejor actividad y correlación de dosis en comparación con los Ejemplos 1 y 3, se realizaron experimentos de mineralización para evaluar adicionalmente su efecto.

Se trataron células MC3T3-E1 después de 72 h de cultivo con el extracto del Ejemplo 2 a12,5, 25 y 50 ug/ml, incubado a 37 grados durante14 days(basado en la formación de nódulos de calcio), con cambios de medio cada 2 días. Se realizó la tinción con rojo de alizarina: se eliminó el medio, las células se fijaron con formalina neutra al 10 % (300 μl/pocillo) durante 30 min, se enjuagaron, se tiñeron con rojo de alizarina al 0,1 % (300 μl/pocillo) durante 30 min (temperatura ambiente, protegidas de la luz) y se lavaron hasta que no quedó color rojo. Se tomaron imágenes. Luego se añadió una solución de cloruro de cetilpiridinio al 10 % (400 µl/pocillo) y se agitó durante 1 h para disolver los nódulos calcificados. La solución disuelta se transfirió a una placa de 96 pocillos (100 µl/pocillo) y se midió la DO a562 nmpara calcular la tasa de mineralización. Fotos: Fig. 7; resultados cuantitativos: Fig. 8.

Tasa de mineralización (%)=OD(Ejemplo 2)−OD(En blanco)OD(En blanco)×100%\\frac{OD(\\text{Ejemplo 2}) - OD(\\text{En blanco})}{OD(\\text{En blanco})} \\times 100\\%OD(En blanco)OD(Ejemplo 2) −OD(En blanco)​×100%

La figura . 7 muestra que el número de nódulos de calcio aumentó secuencialmente con la concentración frente al blanco. La figura . 8 indica que el Ejemplo 2 promovió la mineralización de una manera dependiente de la concentración a 12,5, 25 y 50 ug/ml, con el efecto más fuerte a 50 ug/ml, significativamente mejor que el control positivo (P <0,001). Debido a que los nódulos mineralizados representan la etapa final de la diferenciación de osteoblastos, estos resultados confirman aún más el efecto de soporte de la densidad ósea del Ejemplo 2 y demuestran su actividad estable. El ejemplo 2 fue superior al estradiol, lo que indica un valor potencial para los productos para la salud ósea.

Mecanismo de vía y expresión genética (Ejemplo 2)

Se aplicó el extracto del Ejemplo 2 (12,5, 25, 50 ug/ml) a células MC3T3-E1 durante 3 días. Se realizaron extracción de ARN, cuantificación, transcripción inversa (sistema de 20 μL; entrada de ARN de 800 ng) y qRT-PCR para cuantificar los niveles de expresión relativos deARNm de Runx2, ARNm de Osx, ARNm de Opn y ARNm de Ocn. Resultados: Figura. 9–12.

Runx2 y Osx son reguladores posteriores clave en la señalización de BMP, que inducen la diferenciación de osteoblastos. Runx2 es importante en la etapa de compromiso inicial, mientras que Osx funciona en la diferenciación de terminales. OPN y OCN son indicadores importantes de la actividad de los osteoblastos y la mineralización del tejido. Las figuras . 9-12 muestran que el Ejemplo 2 aumentó la expresión relativa de estos marcadores, lo que respalda una mayor diferenciación de osteoblastos y formación ósea.

[0069] Ejemplo 2 regulado al alzaARNm de Bmp2(Fig. 13), que indica la activación delVía BMP/Smad, que favorece la diferenciación de osteoblastos y la formación de hueso nuevo.

[0071] El ejemplo 2 aumentó la expresión relativa deARNm de Lrp5, ARNm de Lrp6 y ARNm de Wnt3(Fig. 14–16), que admite la activación deSeñalización Wnt/-catenina, que está estrechamente relacionado con la proliferación, diferenciación y formación ósea de osteoblastos.

Expresión de proteínas (Ejemplo 2)

El análisis de transferencia Western mostró que el Ejemplo 2 aumentóosxyRUNX2expresión de proteínas (Fig. 17–18), que indica regulación tanto a nivel transcripcional como traduccional para promover la diferenciación de osteoblastos.

Estas pruebas de actividad muestran que el Ejemplo 2 proporcionó el mejor efecto de promoción de la proliferación y fue el único con una correlación de dosis consistente tanto para la proliferación como para la FA. El Ejemplo 2 también fue superior al estradiol en la promoción de la proliferación y mineralización de MC3T3-E1, con efectos de diferenciación comparables, lo que sugiere un potencial óptimo de soporte de la densidad ósea.

 

Pruebas de composición química

6.1 Contenido de glucósidos feniletanoides

Con referencia al método de ensayo "Cistanche" de la Farmacopea China, se midieron los contenidos de equinacósido y acteósido en los Ejemplos 1 a 3 (los resultados se muestran en la Tabla 1). Según el equinacósido, el acteósido y los PhG totales, la tendencia fue constante: Ejemplo 3 > Ejemplo 1 > Ejemplo 2, y el acteósido en el Ejemplo 3 fue 3,85 × y 4,27 × el de los Ejemplos 1 y 2, respectivamente. La combinación de resultados de actividad y contenido indica que el equinacósido y el actósido por sí solos no determinan directamente los efectos osteogénicos.

 

Tabla 1. Contenido de equinacósido y actósido en extractos de Cistanche (%)

Muestra (Ejemplo)	Echinacósido (%)	Acteosido / Verbascosido (%)	Total (%)
Ejemplo 1	28.68	1.63	30.31
Ejemplo 2	26.27	1.47	27.74
Ejemplo 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Otros componentes (UPLC/Q-TOF/MS)

Se usó UPLC/Q-TOF/MS para comparar los componentes químicos entre los Ejemplos 1-3. Los valores de respuesta se muestran en la Tabla 2.

[0079] Además de echinacósido y acteósido, el Ejemplo 2 conteníacomponentes de tipo ácido shikímico y ácido fenilpropiónico, y tambiénalcaloides. En comparación con los Ejemplos 1 y 3, el Ejemplo 2 tenía 11 componentes relacionados con el ácido fenilpropiónico/shikímico con las respuestas más altas, que incluyen:

Tabla 2. Valores de respuesta UPLC/Q-TOF/MS de componentes clave en extractos de Cistanche (Ejemplos 1 a 3)

注:原表为"响应值(valor de respuesta)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为2组:Ácido shikímico y derivados del ácido fenilpropiónico(莽草酸及苯丙酸类)与 Alcaloides(生物碱).

A. Derivados del ácido shikímico y del ácido fenilpropiónico

Compuesto	Ejemplo 1	Ejemplo 2	Ejemplo 3
Ácido isodanfenólico B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Ácido p-hidroxifenilpropiónico (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Ácido shikímico (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
Ácido (2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-carboxi-2-(3,4-dihidroxifenil)etoxi]carbonil-2-(3,4-dihidroxifenil)-7-hidroxi-2,3-dihidrobenzofuran-4-il]prop-2-enoil]oxi-3-(3,4-dihidroxifenil)propanoico	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzolacetona (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinol 4′-O- -D-glucósido (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Glucósido de Yangmei Changshan* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionósido A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
Ácido 3,4-dimetilbenzoico (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxitetrahidropiran-2-il]oximetil]tetrahidropiran-2-il]oxicromen-2-ona	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

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B. Alcaloides

Compuesto	Ejemplo 1	Ejemplo 2	Ejemplo 3
Verticina (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihidrocoptisina (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Timina (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemina (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbina (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

ácido isodanfenólico B,

ácido p-hidroxifenilpropiónico,

ácido (2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-carboxi-2-(3,4-dihidroxifenil)etoxi]carbonil-2-(3,4-dihidroxifenil)-7-hidroxi-2,3-dihidrobenzofuran-4-il]prop-2-enoil]oxi-3-(3,4-dihidroxifenil)propanoico,

benzoilacetona,

epipinoresinol 4′-O- -D-glucósido,

glucósido relacionado con miricetina (como se indica),

jionósido A1,

ácido 3,4-dimetilbenzoico,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroxitetrahidropiran-2-il]oximetil]tetrahidropiran-2-il]oxicromen-2-ona.

También contenía 5 alcaloides, entre ellos:

verticina,

dihidrocoptisina (como se indica),

timina,

alcaloide relacionado con la gelsemina (como se indica),

yohimbina.

[0080] Basado en resultados comparativos de proliferación/actividad de ALP, ensayos de glucósidos de feniletanoide y perfiles químicos, se puede concluir que los glucósidos de feniletanoide (equinacósido y acteósido), ácidos shikímico/fenilpropiónico, alcaloides y terpenoides constituyen conjuntamente la composición específica del extracto del Ejemplo 2, produciendo una dependencia de dosis constante (12,5–25 ug/ml) a lo largo de la proliferación. diferenciación y mineralización, lo que permite efectos estables de apoyo a la densidad ósea.

Tabla 2: valores de respuesta de los componentes.
La invención, a través del proceso del Ejemplo 2, proporciona un extracto de Cistanche con equinacósido + acteósido total > 25 % y ácidos y alcaloides shikímicos/fenilpropiónicos enriquecidos, lo que permite efectos estables de apoyo a la densidad ósea. Entre 12,5 y 25 ug/mL, promueve la proliferación, diferenciación y mineralización de MC3T3-E1 de una manera que mejora la dosis con una correlación de dosis constante, lo que respalda resultados de salud ósea mejores y más estables y permite su uso en productos relacionados con la mejora de la densidad mineral ósea.