Cistanche funciones para el riñón y la diabetes
Mar 11, 2022
La disfunción del reloj circadiano en el túbulo renal conduce a una mayor gluconeogénesis renal y a una hiperglucemia exacerbada en la diabetes
para más información:ali.ma@wecistanche.com
Camille Ansermet1,6, Gabriel Centeno1,6, Yohan Bignon1,6, Daniel Ortiz2,6, Sylvain Pradervand3,Andy Garcia1, Laure Menin2, Fre´de´ric Gachon1,4, Hikari AI. Yoshihara5 y Dmitri Firsov1
1Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Lausana, Lausana, Suiza;2Servicio de Espectrometría de Masas, Instituto de Ciencias Químicas e Ingeniería, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Suiza;3Centro de Tecnologías Genómicas, Universidad de Lausana, Lausana, Suiza;4Instituto de Biociencia Molecular, Universidad de Queensland, Queensland, Australia; y 5Instituto de Física, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Suiza
losreloj circadianoes un mecanismo de cronometraje molecular ubicuo que sincroniza funciones biológicas celulares, tisulares y sistémicas con ciclos ambientales de 24-horas. Los relojes circadianos locales impulsan ritmos específicos de tipo de célula y tejido y su desregulación se ha implicado en la patogénesis y/o progresión de un amplio espectro de enfermedades. Sin embargo, el papel fisiopatológico de la intrínsecarelojes circadianosen el riñón de diabéticos sigue siendo desconocido. Para abordar esta pregunta, indujimos el tipo Idiabetescon estreptozotocina en ratones desprovistos del regulador transcripcional circadiano BMAL1 en podocitos (ratones cKOp) o en elriñóntúbulo (ratones cKOt). No hubo asociación entre la disfunción del reloj circadiano y el desarrollo de nefropatía diabética en ratones cKOp y cKOt con diabetes. Sin embargo, los ratones cKOt condiabetesexhibieron hiperglucemia exacerbada, aumento de la excreción fraccionada de glucosa en la orina, poliuria aumentada e hipertrofia renal más pronunciada en comparación con los ratones de control tratados con estreptozotocina. Los análisis de expresión de ARNm y proteínas revelaron una mejora sustancial de la vía gluconeogénica enriñonesde ratones cKOt con diabetes en comparación con ratones de control diabéticos. Análisis transcriptómico junto con análisis funcional de ratones cKot condiabetescambios identificados en múltiples mecanismos que afectan directa o indirectamente la vía gluconeogénica. Así, demostramos que la disfunción de la intrínsecariñóntubitoreloj circadianoagrava la hiperglucemia diabética a través de la mejora de la gluconeogénesis en elriñóntúbulo proximal y además resaltar la importancia del comportamiento circadiano en pacientes condiabetes.
PALABRAS CLAVE: elreloj circadiano; diabetes; gluconeogénesis; túbulo proximal
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Declaración de Transición
Endiabetes, lariñónContribuye al desarrollo de la hiperglucemia diabética al aumentar la reabsorción de glucosa de la orina primaria y al aumentar la gluconeogénesis en el túbulo proximal. Sin embargo, estos2 procesos también están controlados por elreloj circadiano, un mecanismo que sincroniza una variedad de funciones renales específicas con los ciclos diarios de luz y oscuridad. En este documento, demostramos que la disfunción del reloj circadiano intrínseco en el túbulo renal puede agravar la hiperglucemia diabética a través de la mejora de la gluconeogénesis renal. Estos resultados resaltan la importancia de los efectos circadianos en pacientes diabéticos, con implicaciones potenciales para el control de la glucosa.
Diabeteses una enfermedad sistémica en la que el riñón juega un papel particular. En la diabetes, elriñóncontribuye al desarrollo de la hiperglucemia diabética al aumentar la reabsorción de glucosa de la orina primaria1 y al aumentar la producción de glucosa a través de la gluconeogénesis.2,3 Sin embargo, la elevación a largo plazo de los niveles de glucosa en sangre puede, a su vez, causar nefropatía diabética (ND), una de las complicaciones más graves de la diabetes, caracterizada por daño glomerular, tubular y vascular en el riñón. Aunque el estrés metabólico es el principal factor involucrado en la patogenia y la progresión de la ND, la hiperglucemia por sí sola no provoca insuficiencia renal en la mayoría de los pacientes diabéticos. y/o progresión acelerada de ND. Investigaciones recientes han sugerido que el mecanismo del reloj circadiano se encuentra en la intersección de varios procesos (pato)fisiológicos en elriñón.5 Condicional elreloj circadianoen diferentes tipos de células renales en modelos animales da como resultado la interrupción de los ritmos circadianos, la tasa de filtración glomerular (TFG),6 la pérdida parcial del control de la presión arterial,7,8 alteraciones sustanciales en las vías metabólicas renales,9,10 y la progresión acelerada de enfermedades crónicas.enfermedad del riñon.11 En humanos, la desalineación circadiana relacionada con el trabajo por turnos entre el reloj biológico y los ritmos de alimentación y actividad se asocia con una TFG disminuida, 12 aumento de la excreción urinaria de albúmina, 13 nocturia y aumento de la producción renal de orina, 14 y mayor riesgo de enfermedad renal crónica. 15
Curiosamente, elreloj circadianoen elriñóncontrola o está interconectado con muchas vías celulares que están involucradas en la patogénesis dediabetesy/o DN. Por ejemplo, la inactivación específica del túbulo renal del activador transcripcional BMAL1 (también llamado ARNTL), un elemento central de la maquinaria del reloj circadiano, da como resultado un marcado aumento en los niveles de expresión de los ARNm que codifican proteínas involucradas en la gluconeogénesis renal de la glutamina, incluido el transportador de glutamina SNAT3 (SLC38A3), glutaminasa (GLS) y glutamato deshidrogenasa 1 (GLUD1).9 Más importante aún, estos cambios de expresión ocurren en animales normoglucémicos knockout. Slominski et al. han demostrado que la proteína del reloj circadiano PER1 está implicada en la regulación transcripcional del transportador de glucosa Sglt1 (Slc5a1) en las células del túbulo proximal16 y Ansermet et al. han demostrado que el reloj circadiano en los podocitos controla la expresión del gen Arhgap24 asociado con la predisposición a la ND tanto en la diabetes tipo 1 como en la tipo 2.6 Se ha demostrado que tanto los niveles elevados de glucosa como la deficiencia tubular de BMAL1 inducen fuertemente la expresión del inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina p21CIP1 (Cdkn1a ), un factor crítico en el desencadenamiento de la senescencia celular en el riñón diabético.9,17 La desacetilasa sirtuina 1 dependiente del dinucleótido de nicotinamidaadenina (SIRT1), uno de los reguladores clave del daño de los podocitos en la DN,18 ha sido identificada como un regulador maestro del circuito de retroalimentación energética. dentro de la red central de reloj. 19 Otro mecanismo celular que vincula DN con elreloj circadianoes el objetivo de la rapamicina en los mamíferos, una cinasa que coordina el metabolismo celular con el cronometraje circadiano.20 La alteración del objetivo de la señalización de la rapamicina en los mamíferos también se ha reconocido como un factor patogénico importante en el daño inducido por la diabetes en las células tubulares renales,21 los podocitos,22 y las células endoteliales23 y mesangiales24 glomerulares. . Colectivamente, estas observaciones sugieren que las perturbaciones del reloj circadiano en elriñónpuede influir en el desarrollo de la hiperglucemia diabética al estimular la gluconeogénesis tubular renal y/o la reabsorción de glucosa, o al actuar como un "segundo golpe" que contribuye a la patogénesis de la ND. Para abordar estas hipótesis, generamos y caracterizamos ratones con tipo I inducido por estreptozotocina (STZ).diabetesy supresión específica de lareloj circadianocoordinador Bmal1 en podocitos glomerulares o en el túbulo renal.
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MÉTODOS
Los animales se mantuvieron ad libitum con la dieta estándar de laboratorio (dieta KLIBA NAFAG 3800). Todos los experimentos se realizaron en ratones macho.
modelos de ratón
La inactivación del gen Bmal1 (Arntl) fue inducida por 2-semana de tratamiento con doxiciclina (DOX; 2 mg/ml en agua potable) de Bmal1lox/lox/Nphs2-rtTA de 8-semanas de edad /LC1 (ratones cKOp) o de ratones Bmal1lox/lox/Pax8-rtTA/LC1 de 8-semanas de edad (ratones cKOt). Sus compañeros de camada de control (ratones Bmal1lox/lox) recibieron el mismo tratamiento con DOX. Ambos modelos han sido previamente descritos y validados.6,9 Una semana después de finalizar el tratamiento con DOX, tipo Idiabetesse indujo mediante inyecciones ip de STZ (50 mg/kg de peso corporal [BW]; diariamente durante 5 días). Los ratones tratados con vehículo recibieron inyecciones de vehículo de solución salina tamponada con fosfato. Todos los experimentos se realizaron 8 semanas después de la última STZ o inyección de vehículo. En todos los experimentos, se realizó la recolección de tejido y sangre de ratones sacrificados en ZT9 (ZT indica unidades de tiempo Zeitgeber; ZT0 es el tiempo de encendido y ZT12 es el tiempo de apagado).
Jaulas metabólicas
Los ratones se alojaron en jaulas metabólicas individuales (Tecniplast). La recolección de orina se realizó durante 24 horas después de un período de adaptación de 4-días.
Química del plasma y la orina.
Las concentraciones y osmolalidad de Na+, K+, Ca2+, Mg2+, fosfato, creatinina, glucosa, urato y urea en orina y plasma fueron medidas por el Laboratoire de prestations de Chimie Clinique del Centre Hospitalier Universitaire Vaudois. El pH urinario se evaluó con un medidor de pH (Metrohm). El pH de la sangre y los gases en sangre se midieron en sangre mixta arterial-venosa utilizando un analizador de sangre epic (Siemens Healthcare). El amonio urinario se midió utilizando el método de Berthelot. El ácido titulable en orina se midió utilizando el método de Chan.25 Los niveles de aldosterona en plasma se midieron mediante radioinmunoensayo (DPC). La insulina plasmática se determinó con un kit de Mercodia
TFG
La TFG se midió en animales anestesiados con isotiocianato de insulina-fluoresceína, como se describió previamente.26
prueba de tolerancia a la glucosa ip
Después de 15 horas de ayuno, los ratones control y cKot tratados con vehículo o STZ se inyectaron ip con glucosa (1 g/kg de peso corporal). La glucemia se midió con un lector de glucemia en una gota de sangre de la cola (Contour NextOne; Bayer) antes (tiempo ¼ 0) y 15, 30, 60, 90, 120 y 180 minutos después de la inyección de glucosa.
Prueba de tolerancia a la insulina
Después de 4 horas de restricción de alimentos, los ratones de control y cKot tratados con vehículo o STZ se inyectaron ip con 0,5 U de insulina (insulina recombinante humana; Sigma) por kg de peso corporal. La glucemia se midió antes de la inyección de insulina (tiempo ¼ 0) y 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 y 180 minutos después de la inyección de insulina. Si la glucemia descendía por debajo de 2 mM, los ratones se rescataban mediante inyección ip de 30 mg de glucosa y se excluían del análisis.
secuenciación de ARN
La secuenciación del ARN se realizó como se describe en Ansermet et al.6 Se utilizó la anotación del gen Musmusculus GRCm38.92. Los recuentos de genes se escalaron utilizando la normalización TMM y se transformaron logarítmicamente en recuentos por millón (CPM) utilizando la función "CPM" del paquete limma R. STZ) y la interacción entre las 2. Para cada una de las 3 comparaciones, se seleccionaron genes con una tasa de descubrimiento falso (FDR) < 5="" por="" ciento="" para="" un="" análisis="" de="" enriquecimiento="" de="" "proceso="" biológico"="" de="" ontología="" génica="" con="" "perfil="" de="" grupo".="" un="" valor="">< 0.01="" were="" considered="" as="" significant="" and="" further="" processed="" with="" the="" function="" "simplify"="" with="" default="" parameters="" to="" remove="">
análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± SEM. Las pruebas estadísticas se describen en las leyendas de las figuras y en la Tabla complementaria S10. P < 0,05="" se="" consideró="" significativo.="" el="" análisis="" estadístico="" se="" realizó="" utilizando="" el="" software="" graphpad="" prism="" (versión="">
Western blots capilares
Las transferencias Western capilares se realizaron en el Centro de análisis de proteínas de la Universidad de Lausana (https://www.unil.ch/paf/home/menuinst/technologies/western-in-capillaries.html). Su cuantificación fue realizada de manera ciega por un técnico de esta instalación.
Cistanche puede mejorar la función renal
RESULTADOS
La inactivación de Bmal1 en podocitos no conduce a la inducción de DN en ratones tratados con STZ
La inactivación específica de podocitos de Bmal1 (Arntl) fue inducida por el tratamiento de 2-semanas con DOX (2 mg/ml en agua potable) de Bmal1lox/lox/Nphs2-rtTA/ de 8-semanas de edad. Ratones LC1 (en lo sucesivo, ratones cKOp).6 Sus compañeros de camada de control (ratones Bmal1lox/lox; en lo sucesivo, ratones de control) recibieron el mismo tratamiento con DOX. Como se muestra en la Figura 1a, el tratamiento con STZ (ver Métodos) condujo a hiperglucemia, que no fue diferente entre los ratones de control y cKOp. BW fue menor en los animales tratados con STZ, pero este efecto fue similar en los ratones de ambos genotipos (Figura 1b). La TFG, medida mediante la eliminación de isotiocianato de insulina-fluoresceína, no fue diferente entre los ratones de control tratados con STZ y los ratones cKOp (Figura 1c). Los animales diabéticos mostraron glucosuria (Figura 1d), poliuria (Figura 1e), proteinuria de bajo peso molecular (Figura 1f) y albuminuria leve (Figura 1f). Sin embargo, no hubo diferencia en estos parámetros entre el control tratado con STZ y los ratones cKOp.
Los ratones desprovistos de BMAL1 en el túbulo renal exhiben hiperglucemia exacerbada con diabetes
Como se muestra en la Figura 2a, el BW no fue diferente en los ratones de control diabéticos y los ratones sin BMAL1 en el túbulo renal (ratones Bmal1lox/lox/Pax8-rtTA/LC19 tratados con DOX; en lo sucesivo denominados ratones cKot). El análisis de plasma sanguíneo reveló que la hiperglucemia inducida por STZ se exacerba en ratones cKOt tanto en condiciones de alimentación como en ayunas (Figura 2b y c, respectivamente). Las concentraciones de urato y aldosterona fueron diferentes entre el control tratado con STZ y los ratones c Kot, excepto por el aumento de los niveles de urea en plasma en los ratones cKOt (Tabla complementaria S1). Los niveles de insulina en plasma no fueron diferentes entre el control tratado con STZ y los ratones en ayunas con cKot (Figura 2d). Las pruebas de tolerancia a la glucosa e insulina evaluadas como la pendiente de la concentración de glucosa en declive no revelaron diferencias significativas entre los ratones de cualquiera de los genotipos en ambas condiciones de tratamiento (Figura 2e yf, respectivamente).Diabetes-inducidoriñónla hipertrofia fue más pronunciada en los ratones cKOt diabéticos que en los controles diabéticos (Figura 2g). La TFG no fue diferente entre los ratones tratados con STZ de ambos genotipos (Figura 2h). El aumento inducido por STZ en la ingesta de agua y el volumen de orina fue más pronunciado en los ratones c Kot (Figura 3a yb, respectivamente), mientras que la osmolalidad de la orina no fue diferente entre los ratones diabéticos de ambos genotipos (Figura 3c). La excreción fraccional de glucosa fue mayor y la excreción fraccional de sodio fue menor en los ratones cKOt tratados con STZ en comparación con los controles tratados con STZ (Figura 3d y e, respectivamente), mientras que los valores de excreción fraccional de fosfato (Figura 3f), magnesio (Figura 3g) y calcio (Figura 3h) no fueron diferentes entre los ratones diabéticos de ambos genotipos. Tanto los ratones de control como los cKot tratados con STZ tenían una proteinuria de bajo peso molecular similar pero sin albuminuria (Figura complementaria S1). No se encontraron diferencias histológicas importantes entre los riñones del control tratado con vehículo o STZ y los ratones cKot (Figura complementaria S2).
Figura 1|Características generales de los ratones control y cKOp tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ). (a) Glucemia sin ayuno. (b) Peso corporal (BW). (c) Tasa de filtración glomerular (TFG) (aclaramiento de insulina). (d) Glucosa en orina. (e) Volumen de orina. (f) Tinción con azul de Coomassie de las proteínas de la orina. Para todos los ratones, 0.3 por ciento (vol) de orina de 24- horas se cargó en un gel de electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida. Se proporciona la media ± SEM. n=9 en cada grupo, excepto para las mediciones de GFR, donde se usaron ratones n=6 y n=9 en los grupos control y cKOp tratados con STZ, respectivamente. Todos los resultados se obtuvieron de animales de 19-semanas de edad. Se utilizó un análisis de varianza de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. *P < 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" alb,="" albúmina="" (65="" kda);="" lmwp,="" proteína="" de="" bajo="" peso="">
Figura 2|Características generales del control tratado con vehículo o estreptozotocina (STZ) y ratones c Kot. (a) Peso corporal. n=8 para ratones control y c Kot tratados con vehículo, y n=9 para ratones control y c Kot tratados con STZ. (b) Glucemia sin ayuno. n=8 y n=9 para los ratones control y c Kot tratados con vehículo y STZ, respectivamente. (c) Glucemia en ayunas (16 horas de ayuno). n=9 para el control tratado con vehículo y los ratones c Kot, y n=7 y n=6 para el control tratado con STZ y los ratones c Kot, respectivamente. ( d ) Niveles de insulina en control tratado con vehículo o STZ y ratones c Kot. n=9 yn=6 para ratones de control y c Kot tratados con vehículo, respectivamente, y n=10 y n=7 para ratones de control y c Kot inyectados con STZ, respectivamente. Los niveles de insulina en plasma se midieron en ZT18, en el medio de la fase inactiva. (e) Los niveles de glucosa en sangre se midieron durante el transcurso de la prueba de tolerancia a la glucosa en ratones control y c Kot tratados con STZ o en el vehículo. n=9 para el control tratado con vehículo y los ratones c Kot, y n=7 y n=6 para el control tratado con STZ y los ratones c Kot, respectivamente. (f) Los niveles de glucosa en sangre se midieron durante el transcurso de la prueba de tolerancia a la insulina en ratones control y c Kot tratados con STZ o en vehículos. n=5 para ratones de control tratados con vehículo o STZ, y n=6 para ratones cKO tratados con vehículo o STZ. (gramo)Diabetes-inducidoriñónhipertrofia. n{{0}} en cada grupo. La hipertrofia renal se evaluó dividiendo el peso del riñón (KW) por el peso corporal (BW). Los valores relativos KW/BW para los animales de control inyectados con STZ y c Kot se calcularon atribuyendo 1{{10}}0 por ciento a el correspondiente grupo inyectado en el vehículo. (h) Tasa de filtración glomerular (TFG) (depuración de insulina). n=5 y n=6 para el control tratado con STZ y ratones c Kot, respectivamente. Se proporciona la media ± SEM. Se utilizó un análisis de varianza de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. *P < 0,05,="" †p="">< 0,01,="" ‡p=""><>
La hiperglucemia exacerbada en ratones cKOt se correlaciona con una mayor expresión de enzimas gluconeogénicas en el riñón
Para identificar las vías moleculares asociadas con la hiperglucemia exacerbada en ratones cKOt tratados con STZ, realizamos un análisis de secuenciación de ARN deriñóntranscriptomas seguidos de análisis de enriquecimiento de la ruta del transcriptoma completo y análisis específicos de ARN que codifican proteínas involucradas en la gluconeogénesis renal y la reabsorción renal de glucosa. La comparación de transcriptomas reveló 1833 transcritos expresados diferencialmente entre los controles tratados con vehículo y STZ (Tabla complementaria S2; FDR < 5="" por="" ciento),="" 1784="" transcritos="" expresados="" diferencialmente="" entre="" ratones="" ckot="" tratados="" con="" vehículo="" y="" stz="" (tabla="" complementaria="" s3;="" fdr="">< 5="" por="" ciento),="" 3107="" transcritos="" expresados="" diferencialmente="" entre="" control="" tratado="" con="" vehículo="" y="" ratones="" c="" kot="" (tabla="" complementaria="" s4;="">< 5%),="" and="" 2667="" transcripts="" differentially="" expressed="" between="" stz-treated="" control="" and="" c="" kot="" mice="" (supplementary="" table="" s5;="" fdr="" <="" 5%).="" gene="" ontology="" analysis="" of="" differentially="" expressed="" transcripts="" revealed="" enrichment="" of="" pathways="" related="" to="" lipid,="" amino="" acid,="" and="" carboxylic="" acid="" metabolism,="" and="" organic="" anion="" transport="" between="" control="" and="" cko="" mice="" in="" both="" vehicle="" and="" stz="" treatment="" groups="" (figure="" 4a="" and="" b,="" respectively,="" and="" supplementary="" tables="" s6="" and="" s7,="" respectively).="" a="" total="" of="" 284="" transcripts="" exhibited="" genotype-by="" treatment="" interaction="" effects="" (supplementary="" table="" s8;="" fdr="" <="" 5%),="" including="" glud1="" and="" g6pc="" transcripts="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" renal="" gluconeogenesis="" (see="" below).="" gene="" ontology="" analysis="" of="" transcripts="" with="" significant="" interaction="" showed="" enrichment="" of="" only="" a="" limited="" number="" of="" pathways,="" mainly="" related="" to="" lipid="" metabolism="" and="" organic="" anion="" transport="" (figure="" 4c="" and="" supplementary="" table="" s9).="" among="" the="" genes="" encoding="" transporters="" involved="" in="" glucose="" reabsorption="" in="" the="" proximal="" tubule="" (sglt1,="" sglt2,="" glut1,="" and="" glut2),="" only="" glut1="" (slc2a1)="" displayed="" higher="" expression="" in="">riñonesde ratones cKOt diabéticos en comparación con controles diabéticos (Tabla complementaria S5).
Figura 3|Ingesta de agua y características de la orina del control tratado con vehículo o estreptozotocina (STZ) y ratones c Kot. (a) La entrada de agua de 24-horas. n=8 para ratones de control o cKOt tratados con vehículo, y n=9 para ratones de control o cKOt tratados con STZ. (b) El volumen de orina de 24-horas. n=8 para ratones de control o cKOt tratados con vehículo, y n=9 para ratones de control o cKOt tratados con STZ. (c) Osmolalidad de la orina. n=8 para ratones de control tratados con vehículo, n=7 para ratones c Kot tratados con vehículo y n=9 para ratones de control o cKOt tratados con STZ. (d) Excreción fraccional (Fe) de glucosa. n=8 para ratones de control o cKOt tratados con vehículo, y n=9 para ratones de control o cKOt tratados con STZ. (e) Fe de sodio. n=8 para ratones de control tratados con vehículo, n=7 para ratones c Kot tratados con vehículo y n=9 para ratones de control o cKOt tratados con STZ. (f) Fe de fosfato. n=8 para ratones de control tratados con vehículo, n=7 para ratones cKOt tratados con vehículo, n=8 para ratones de control tratados con STZ y n=9 para ratones tratados con STZ ratones cKOt. (g) Fe de magnesio. n=8 para ratones de control tratados con vehículo, n=7 para ratones c Kot tratados con vehículo y n=9 para ratones de control o cKOt tratados con STZ. (h) Fe de calcio. n=8 para ratones de control tratados con vehículo, n=7 para ratones c Kot tratados con vehículo y n=9 para ratones de control o cKOt tratados con STZ. Significa que se da SEM. Se utilizó un análisis de varianza de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. *P < {{50}}.05,="" †p="">< 0,01,="" ‡p="">< 0,001.="" pc,="" peso="">
Los 2 principales precursores gluconeogénicos en elriñónson lactato y glutamina.29 Como se muestra en la Figura 4d y e y en la Tabla complementaria S5, los niveles de expresión de las proteínas que codifican transcritos involucradas en la gluconeogénesis renal de glutamina (Snat3, Gls y Glud1) aumentaron en los riñones de los ratones cKOt tratados con STZ en comparación con los controles tratados con STZ Por el contrario, se redujo la expresión del ARNm que codifica la glutamato amoníaco ligasa (Gull), que invierte el paso inicial de glutaminólisis impulsado por GLS. De manera similar, los niveles de expresión de ARNm que codifican 2 enzimas en la parte común de la vía gluconeogénica (a saber, fosfoenolpiruvato carboxicinasa [Pck1] y glucosa-6-fosfatasa [G6pc]), fueron más altos en los ratones cKOt tratados con STZ. Se confirmó una mayor expresión de GLUD1 y PCK1 en riñones de ratones cKOt diabéticos a nivel de proteína mediante transferencia de Western capilar (Figura 4f y Figura complementaria S3). En el hígado de ratones diabéticos, el nivel de expresión de GLUD1 no fue diferente entre los ratones de control y c Kot, y la expresión de PCK1 fue menor en los ratones c Kot (Figura complementaria S4). Cabe destacar que los niveles de expresión de Glud1, Snat3, fructosa-1,6-bifosfato 2 (Fbp2) y Glut1 fueron más altos y los niveles de expresión de Glul, Fbp1 y Glut2 fueron más bajos enriñonesde ratones cKOt tratados con vehículo en comparación con controles tratados con vehículo.
Figura 4|Ontología génica (GO) Análisis de enriquecimiento de "procesos biológicos". ( a ) Análisis GO de transcripciones expresadas diferencialmente enriñonesde control tratado con vehículo y ratones c Kot. ( b ) Análisis GO de transcripciones expresadas diferencialmente en riñones de ratones de control yc Kot tratados con estreptozotocina (STZ). ( c ) Análisis GO de transcripciones que exhiben un efecto de interacción genotipo por tratamiento. Gráficos de puntos para los 20 términos más significativos principales (valor Q < 0.01).="" se="" filtraron="" los="" términos="" redundantes.="" la="" generación="" representa="" la="" fracción="" de="" genes="" significativos="" anotados="" con="" el="" término="" mostrado.="" el="" tamaño="" del="" punto="" representa="" el="" número="" de="" genes="" significativos="" anotados="" con="" el="" término="" mostrado.="" n="6" por="" condición.="" (="" d="" )="" gráficos="" de="" cambio="" de="" pliegue="" para="" enzimas="" codificadoras="" de="" transcritos="" y="" transcritos="" involucrados="" en="" la="" gluconeogénesis="" renal.="" los="" valores="" del="" nivel="" de="" expresión="" se="" extrajeron="" de="" las="" tablas="" complementarias="" s2,="" s3,="" s4="" y="" s5.="" *p="">< 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" (e)="" representación="" esquemática="" de="" las="" células="" del="" túbulo="" proximal="" con="" las="" principales="" proteínas/enzimas="" involucradas="" en="" el="" proceso="" de="" gluconeogénesis="" renal.="" en="" rojo:="" valores="" de="" p="" para="" la="" expresión="" diferencial="" entre="" el="" control="" tratado="" con="" stz="" y="" los="" ratones="" c="" kot.="" en="" azul:="" valores="" de="" p="" para="" la="" expresión="" diferencial="" entre="" el="" control="" tratado="" con="" vehículo="" y="" los="" ratones="" c="" kot.="" las="" flechas="" rojas="" y="" azules="" indican="" un="" aumento="" ([)="" o="" una="" disminución="" (y)="" de="" la="" expresión="" en="" ratones="" ckot.="" (="" f="" )="" análisis="" cuantitativo="" de="" transferencias="" western="" capilares="" para="" glutamato="" deshidrogenasa="" (glud1)="" y="" fosfoenolpiruvato="" carboxiquinasa="" (pck1;="" figuras="" complementarias="" s2="" y="" s3,="" respectivamente)="">riñonesde solución salina tamponada con fosfato o control tratado con STZ y ratones c Kot (n=6 condición). Se utilizó un análisis de varianza de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. *P < 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" au,="" unidad="" arbitraria;="" fbp1/2,="" fructosa-1,6-bifosfatasa="" 1/2;="" g6pc,="" glucosa-6-fosfatasa;="" gls,="" glutaminasa;="" glul,="" glutamina="" sintetasa;="" glut2,="" transportador="" de="" glucosa2;="" nhe3,="" intercambiador="" de="" sodio-hidrógeno="" 3;="" p="" ajustar,="" p="" ajustado;="" pc,="" piruvato="" carboxilasa;="" snat3,="" transportador="" de="" glutamina;="" tca,="">
Múltiples mecanismos que afectan directa o indirectamente la vía gluconeogénica se modifican en riñones de ratones diabéticos cKOt
La vía gluconeogénica en elriñónpuede ser influenciado por lareloj circadianoya sea directamente, a través del control transcripcional, traduccional o postraduccional de las proteínas involucradas en la gluconeogénesis renal, o indirectamente, al afectar otros mecanismos renales que están intrínsecamente conectados con la producción de glucosa en el túbulo proximal. Los factores transcripcionales, coactivadores y correpresores que rigen la transcripción de las enzimas gluconeogénicas se han caracterizado parcialmente en el hígado, riñón y otros tejidos. Las figuras 5a y b resumen los cambios en los niveles de expresión de transcritos que codifican reguladores transcripcionales conocidos de la gluconeogénesis enriñonesratones ofcontrol y cKOt (véanse también las tablas complementarias S4 y S5). Entre los transcritos analizados, los que codifican el receptor d activado por el proliferador de peroxisomas (PPARd) y los criptocromos 1 y 2 mostraron un aumento sustancial, mientras que el receptor nuclear NR1D1 (también conocido como REV-Erba) disminuyó sustancialmente en los riñones de ratones cKOt en ambos vehículos- y STZ- animales tratados en comparación con controles con el mismo tratamiento. La expresión del coactivador del receptor g activado por el proliferador de peroxisomas 1-a (Pgc1a, Ppargc1a) aumentó en los ratones cKOt tratados con STZ en comparación con los controles tratados con STZ, y la expresión del receptor de glucocorticoides (Gr, Nr3c1) disminuyó en los ratones cKOt tratados con vehículo. en comparación con los controles tratados con vehículo. Expresión de la proteína forkhead O box (Foxo1), factor nuclear de hepatocitos 4a (Hnf4a), proteína de unión al elemento de respuesta del monofosfato de adenosina cíclico (Creb1), Para, Sirt1, proteína de unión a CREB (Cbp, Crebbp), coactivador transcripcional 2 regulado por CREB (Crtc2), y la histona desacetilasa 3 (Hdac3) no se vio afectada por el tratamiento o el genotipo
Figura 5|( a ) Gráficos de cambio de pliegue para transcripciones que codifican factores de transcripción, coactivadores y correpresores que gobiernan la transcripción de enzimas gluconeogénicas en ratones control y cKOt tratados con vehículo y estreptozotocina (STZ). Los valores del nivel de expresión se extrajeron de las tablas complementarias S2, S3, S4 y S5. *P < 0.{{10}}5,="" †p="">< 0,01,="" ‡p="">< 0,001.="" (b)="" representación="" esquemática="" de="" los="" datos="" presentados="" en="" la="" figura="" 5a.="" en="" rojo:="" valores="" de="" p="" para="" la="" expresión="" diferencial="" entre="" el="" control="" tratado="" con="" stz="" y="" los="" ratones="" ckot.="" en="" azul:="" valores="" de="" p="" para="" la="" expresión="" diferencial="" entre="" el="" control="" tratado="" con="" vehículo="" y="" los="" ratones="" ckot.="" las="" flechas="" rojas="" y="" azules="" indican="" expresión="" aumentada="" ([)="" o="" disminuida="" (y)="" en="" ratones="" ckot.="" au,="" unidad="" arbitraria;="" cpb,="" xxx;="" creb1,="" xxx;="" crtc2,="" xxx;="" llorar1,="" xxx;="" llorar2,="" xxx;="" foxo1,="" xxx;="" g6pc,="" xxx;="" gr,="" xxx;="" hdac3,="" xxx;="" hnf4a,="" xxx;="" nrld1,="" xxx;="" pck1,="" xxx;="" ppara,="" xxx;="" parg,="" xxx;="" sir1,="">
Debido a que la acidosis es el principal estímulo indirecto para la gluconeogénesis renal, medimos el pH sanguíneo y urinario, los gases sanguíneos, la excreción urinaria de amoníaco (NH3/NH4+) y la acidez titulable. Como se muestra en la Figura 6, el pH de la sangre fue mayor en los ratones cKOt tratados con vehículo en comparación con los controles tratados con vehículo, pero no fue diferente entre los ratones diabéticos de ambos genotipos. El bicarbonato plasmático fue más bajo en los controles diabéticos en comparación con los controles tratados con vehículo; sin embargo, no se encontraron diferencias en el bicarbonato plasmático entre los ratones de control diabético y cKOt. El exceso de base plasmática y el pH de la orina no se vieron afectados por el tratamiento o el genotipo. Sin embargo, los ratones cKOt tratados con STZ excretaron mayores cantidades de amoníaco y acidez titulable en comparación con los controles tratados con STZ. El análisis de las transcripciones que codifican proteínas involucradas en el manejo de la base de ácido renal reveló una expresión disminuida del intercambiador de hidrógeno y sodio NHE3 (Slc9a3; consulte la Figura 4d y e) y del intercambiador de aniones AE1 (Slc4a1) y aumento de la expresión de anhidrasa carbónica II (Car2) y subunidad b1 de Hþ-ATPasa (Atp6v1b1). Sin embargo, no se observaron diferencias en los niveles de expresión del antiportador de cloruro-protón Clcn5, subunidad b2 de H+-ATPasa (Atp6v1b2), transportador de amoníaco Rhcg, cotransportador de bicarbonato de sodio NBCE1 (Slc4a4), intercambiador de cloruro-bicarbonato dependiente de sodio NDCBE (Slc4a8) y pendrina intercambiadora de aniones (Pds, Slc26a4) ratones cKOt indiabéticos en comparación con controles diabéticos (Tabla complementaria S5). Es de destacar que los niveles de expresión de Nhe3 fueron más bajos en los riñones de los ratones cKOt tratados con vehículo en comparación con los controles tratados con vehículo (Figura 4d y Tabla complementaria S4).
DISCUSIÓN
Está bien establecido que la disfunción delreloj circadianoEl mecanismo o una desalineación entre el reloj biológico y las señales sociales y ambientales causadas (p. ej., por el trabajo por turnos), la adicción a la computadora/internet, el desfase horario frecuente o los trastornos del sueño, son factores de riesgo importantes para la patogénesis y/o la progresión de una variedad de enfermedades crónicas. Sin embargo, la contribución de los relojes circadianos locales intrínsecos al tejido versus las señales circadianas sistémicas a procesos fisiopatológicos específicos no ha sido ampliamente investigada. Presumimos que las perturbaciones en los relojes circadianos renales intrínsecos pueden contribuir al desarrollo de ND y/o hiperglucemia diabética. Para probar estas hipótesis, utilizamos 2 modelos de ratón (es decir, ratones cKOp y cKOt) desarrollados en un fondo genético C57BL/6 conocido por ser relativamente resistente a DN. En ambos modelos, la deficiencia de BMAL1 en condiciones diabéticas no resultó en albuminuria adicional o diferencia en la TFG, 2 características principales de la enfermedad. Esto sugiere que los ratones transgénicos en un fondo C57BL/6 pueden no ser un modelo apropiado para estudiar la hipótesis del "segundo golpe" en la ND o que la patogénesis y/o la progresión de la ND se ven más afectadas por las perturbaciones circadianas sistémicas que por los relojes circadianos renales intrínsecos. Prueba de la hipótesis de una interacción entre la hiperglucemia diabética y la insuficiencia renal intrínsecarelojes circadianosreveló una vía gluconeogénica tubular renal mejorada y una hiperglucemia exacerbada en ratones cKOt diabéticos. Los análisis de expresión de ARNm y proteínas indicaron que tanto la gluconeogénesis de glutamina como la parte común de la vía gluconeogénica son ratones cKOt indiobéticos mejorados en comparación con los controles diabéticos. Esta observación sugirió que los dos principales sustratos gluconeogénicos en elriñón(es decir, glutamina y lactato) podrían contribuir al empeoramiento de la hiperglucemia en ratones cKOt.
Figura 6|pH plasmático, bicarbonato plasmático, exceso de base plasmática, pH urinario, acidez titulable (TA) de orina 24-horas y excreción de amonio en ratones control y cKOt tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ). norte ¼ 6–9. Se utilizó un análisis de varianza de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. *P < 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p=""><>
RiñónLa gluconeogénesis ha cobrado mayor interés en los últimos años debido al papel potencialmente importante de la glucosa producida en el túbulo renal tanto en el equilibrio metabólico sistémico como en la enfermedad renal (revisado previamente2,30). El riñón representa el 40 por ciento de la producción total de glucosa de novo del cuerpo en humanos en ayunas durante la noche.29 EndiabetesTanto el hígado como el riñón aumentan la síntesis de glucosa, pero el aumento relativo de la gluconeogénesis renal es mucho más fuerte que en el hígado. Los estudios en el hígado han demostrado que elreloj circadianopuede influir en la gluconeogénesis hepática a través de múltiplesreloj circadiano-Mecanismos celulares controlados. Zhang et al. han demostrado que los represores circadianos criptocromos 1 y 2 inhiben la expresión de enzimas gluconeogénicas al bloquear la activación de CREB1 dependiente del monofosfato de adenosina cíclica.31 Li et al. han demostrado que NR1D1, que forma una rama negativa crítica en el reloj circadiano central, suprime la transcripción de Pck1 y G6pc.32 Como se esperaba para los genes del reloj circadiano en ratones knockout para Bmal1,33 nuestros resultados demostraron una fuerte regulación al alza de las transcripciones de Cry1/Cry2 y una fuerte regulación a la baja de Transcripción Nr1d1 enriñonesde ratones cKOt diabéticos en comparación con controles diabéticos. Estos resultados contradictorios pueden sugerir la especificidad tisular de la regulación de la gluconeogénesis por los elementos centrales del reloj. Curiosamente,riñonesde ratones diabéticos cKOt exhibieron una fuerte inducción de Ppard, que ha demostrado estimular dramáticamente la expresión de Pck1 en el músculo. se incrementó en los riñones de ratones cKOt diabéticos. En conjunto, el análisis de los transcriptomas renales reveló que los ratones cKOt diabéticos presentan cambios sustanciales en varias vías celulares involucradas en el control de la gluconeogénesis en elriñóny/u otros tejidos.
Evaluación de los posibles mecanismos a través de los cuales lacircadianorelojpuede influir en la vía gluconeogénica en los diabéticosriñónreveló varias características del estado ácido-base de la sangre compensado, incluido el aumento de la excreción urinaria de amonio y la acidez titulable. Estas observaciones fueron paralelas a los datos transcriptómicos que demostraron una reducción en los niveles de expresión del transcrito que codifica NHE3, un transportador que juega un papel clave en el manejo ácido-base del túbulo proximal, junto con un aumento potencialmente compensatorio en la expresión del gen que codifica la subunidad Atp6v1b1 de la HþATPasa involucrada en la secreción de Hþ en la nefrona distal. Se ha demostrado el control directo de la expresión de Nhe3 por el reloj circadiano tanto a nivel transcripcional16 como de expresión de proteínas.35 Por lo tanto, la acidificación intracelular debida a una expresión reducida de NHE3 podría considerarse como una posible causa del aumento de la gluconeogénesis en las células del túbulo proximal de los ratones cKOt. Estos resultados son paralelos a los de Onishi et al.,36 quienes demostraron que la desactivación específica de túbulos de NHE3 da como resultado una mayor expresión de enzimas gluconeogénicas en el riñón. La mejora de la parte común limitante de la velocidad de la vía gluconeogénica (Pck1 y G6pc) en ratones diabéticos cKOt puede agravar aún más la acidificación intracelular a través de la mejora de la gluconeogénesis de glutamina, un proceso metabólico que genera iones de hidrógeno. Curiosamente, la expresión de Nhe3, Glul, Glud1 y Snat3, así como de varios transcritos que codifican factores de transcripción, coactivadores o correpresores que gobiernan la transcripción de enzimas gluconeogénicas (Gr, Ppard, Nr1d1, Cry1 y Cry2) se modificó de manera similar en STZ- y ratones cKOt tratados con vehículo. Esto sugiere que la gluconeogénesis renal también aumenta en los ratones cKOt tratados con vehículo.riñón.
¿Cuál es la relevancia de estos hallazgos para la patogenia dediabetes¿Inhumanos? Está bien establecido que el ritmo de la alimentación juega un papel importante en la sincronización de los relojes circadianos periféricos. , corticosteroides41) han demostrado tener un fuerte impacto en los ritmos circadianos en elriñón. Varios grupos importantes de población están periódicamente o constantemente expuestos a una ingesta de alimentos cambiada o desordenada. Por ejemplo, hasta un 20% a un 25% de los empleados de América del Norte y Europa trabajan por turnos, lo que se asocia con un patrón de alimentación alterado.42 El segundo grupo de rápido crecimiento con un comportamiento dietético afectado es el de los adictos graves a Internet, que representan, según las estimaciones actuales,6 hasta el 8 por ciento de la población general.43 También se ha demostrado que los trastornos del sueño,44 la enfermedad renal crónica,45 y algunos medicamentos (p. ej., cisplatino46) alteran significativamente los ritmos circadianos renales. Por lo tanto, uno puede especular que en una fracción sustancial de pacientes diabéticos, la hiperglucemia puede empeorar aún más debido a la desregulación de los relojes circadianos en los tejidos periféricos, incluidos los riñones intrínsecos.relojes circadianos. En este sentido, un gran número de estudios han demostrado una fuerte asociación entre el trabajo por turnos y el riesgo de desarrollar diabetes (revisado previamente47). Colectivamente, nuestros resultados proporcionan un nuevo vínculo molecular entre el sistema circadiano y la fisiopatología dediabetes.
Cistanche puede prevenir la enfermedad renal
DIVULGACIÓN
Todos los autores declararon no tener intereses en competencia.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Este trabajo fue financiado por la subvención de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza 310030-188499 (para DF)
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
HAIRY, FG y DF diseñaron el estudio; CA, GC, DO, YB y AGrealizaron experimentos; CA, GC, DO, SP, LM y HAIY analizaron los datos; CA y HAIY hicieron las figuras; DF y HAIY escribieron el manuscrito. Todos los autores aprobaron la versión final del manuscrito.
MATERIAL SUPLEMENTARIO
Archivo complementario (PDF)
Figura S1. Tinción con azul de Coomassie de proteínas urinarias de ratones control y cKOt tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ).
Figura S2. (A) Tinción tricrómica de Masson deriñónsecciones de ratones control y cKOt tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ). (B) Tinción con ácido peryódico-Schiff (PAS) de secciones de riñón de ratones control y cKOt tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ).
Figura S3. Análisis de Western blot capilar de la expresión de glutamato deshidrogenasa 1 (GLUD1; A) y fosfoenolpiruvatocarboxicinasa (PCK1; B) enriñonesde control tratado con vehículo o estreptozotocina (STZ) y ratones cKOt.
Figura S4. Análisis de Western blot capilar de la expresión de glutamato deshidrogenasa 1 (GLUD1; A) y fosfoenolpiruvatocarboxicinasa (PCK1; B) en el hígado de ratones control y cKOt tratados con vehículo o estreptozotocina (STZ).
Tabla S1. Química del plasma en control inyectado con vehículo o estreptozotocina (STZ) y ratones cKOt. Archivos complementarios (Excel)
Tabla S2. Transcriptoma: estreptozotocina de control (STZ) versus solución salina tamponada con fosfato (PBS) de control.
Tabla S3. Transcriptoma: estreptozotocina (STZ) knockout (KO) versus solución salina tamponada con fosfato (PBS) KO.
Tabla S4. Transcriptoma: solución salina tamponada con fosfato (PBS) eliminada (KO) versus PBS de control.
Tabla S5. Transcriptoma: estreptozotocina (STZ) knockout (KO) versus control STZ.
Tabla S6. Enriquecimiento de ontología génica (GO) para solución salina tamponada con fosfato (PBS) knockout (KO) frente a PBS de control.
Tabla S7. Enriquecimiento de ontología génica (GO) para estreptozotocina (STZ) eliminatoria (KO) frente a STZ de control.
Tabla S8. Transcriptoma: interacción genotipo por tratamiento.
Tabla S9. Enriquecimiento de ontología génica (GO) para la interacción.
Tabla S10. Estadísticas.
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