Abstracto

Objetivo:La fórmula hipoglucemiante reguladora de lípidos (HLF) a base de Cistanche ha demostrado una eficacia significativa para mejorar los trastornos del metabolismo de la glucosa y los lípidos. Sin embargo, sus mecanismos de acción específicos aún no están claros. Este estudio tuvo como objetivo explorar los posibles objetivos y mecanismos de HLF para mejorar los trastornos metabólicos de los glucolípidos a través de farmacología en red, acoplamiento molecular, simulaciones de dinámica molecular (MD) y validación experimental.

Métodos:
Los objetivos asociados con los trastornos metabólicos de los glucolípidos se recuperaron de la base de datos GeneCards. Los objetivos de acción de los principales componentes activos de HLF se obtuvieron de las bases de datos CTD y SwissTargetPrediction. Se utilizaron la base de datos STRING y el software Cytoscape para construir redes de interacción proteína-proteína (PPI). Después de identificar posibles objetivos clave, se realizaron análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a través de la base de datos Metascape, y se construyó una red de "vía de objetivo compuesto". El acoplamiento molecular se realizó utilizando AutoDock y PyMOL para verificar las interacciones entre los componentes principales y los objetivos principales. Luego se realizaron simulaciones de MD en los mejores complejos proteína-ligando identificados durante el acoplamiento. Se estableció un modelo de ratón de trastorno metabólico de glucolípidos paraen vivoValidación de los hallazgos de farmacología de la red.

Resultados:
El análisis topológico de la red PPI identificó 10 objetivos principales: TNF, CTNNB1, AKT1, NF-κB1, ESR1, FN1, TP53, IL-1, IL-6 y EGFR. El enriquecimiento con GO mostró que estos objetivos estaban involucrados principalmente en la transducción de señales y la regulación transcripcional. El análisis de la vía KEGG reveló una asociación significativa con las vías de lípidos y aterosclerosis. El acoplamiento molecular confirmó afinidades de unión favorables entre los componentes centrales de HLF (p. ej., lovastatina, coptisina, ácido salvianólico B) y objetivos como AKT1, FN1 y IL-6. Las simulaciones de MD demostraron además interacciones estables, especialmente entre AKT1 y compuestos como lovastatina, coptisina y ácido salvianólico B. Los experimentos con animales indicaron que HLF puede ejercer efectos terapéuticos al regular negativamente la expresión de AKT1, TP53, FN1 y EGFR, suprimir factores inflamatorios como IL-1 y IL-6, y regular positivamente CTNNB1 y ESR1. Estos cambios condujeron a mejoras en los niveles de lípidos y glucosa en sangre en los ratones modelo.

Conclusión:
HLF puede regular el metabolismo de la glucosa y los lípidos y mejorar las lesiones ateroscleróticas al atacar las vías relacionadas con los lípidos y la aterosclerosis. Ofrece una estrategia terapéutica integral para prevenir y tratar los trastornos metabólicos y las complicaciones relacionadas.

Palabras clave:
Fórmula a base de cistanche; Trastorno metabólico de glucolípidos; Farmacología en red; Atraque molecular; Simulación de dinámica molecular;Vía de los lípidos y la aterosclerosis.

 

 

 

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1. Introducción

Los trastornos metabólicos de los glucolípidos se han convertido en un importante problema de salud pública en todo el mundo. En 2021, la prevalencia mundial de diabetes alcanzó aproximadamente 529 millones, con proyecciones que indican más de 1,31 mil millones de casos para 2050. En China, estudios recientes muestran una prevalencia de diabetes del 12,4 % en 2018, frente al 10,9 % en 2013. La dislipidemia es frecuentemente comórbida con la diabetes, lo que aumenta significativamente los riesgos de eventos cardiovasculares y cerebrovasculares, mortalidad y discapacidad.

Las encuestas epidemiológicas de 20 hospitales terciarios de China muestran que el 67,1% de los pacientes con diabetes tipo 2 (DM2) tienen dislipidemia. El estudio CCMR-3B informó que el 72 % de los pacientes con DM2 también tenían dislipidemia y/o hipertensión, lo que duplicaba su riesgo de complicaciones macrovasculares y microvasculares en comparación con los pacientes con diabetes únicamente.

Debido a la compleja patogénesis de los trastornos metabólicos de los glucolípidos y la baja tasa de lograr un control metabólico integral, los tratamientos efectivos son limitados. La fórmula reguladora de lípidos hipoglucemiantes (HLF) a base de Cistanche, desarrollada bajo la teoría de la "turbidez de la flema", tiene como objetivo eliminar el calor, eliminar la turbidez y restablecer el equilibrio. Compuesto por ocho hierbas que incluyencistanche, Momordica charantia, Áloe vera, Scutellaria baicalensis, Schisandra chinensis, Zingiber officinale, Salvia miltiorrhiza, yAtractylodes macrocephala, HLF se dirige a los mecanismos centrales de los trastornos metabólicos.

El análisis de huellas dactilares mediante HPLC identificó compuestos clave:mangiferina, coptisina, jatrorricina, ácido salvianólico B, aloína, berberina, palmatina,ylovastatina. Estudios anteriores confirmaron la eficacia de HLF para reducir los niveles de glucosa y lípidos, reducir el riesgo cardiovascular y mejorar la resistencia a la insulina. Un ensayo clínico multicéntrico, aleatorizado y abierto en el que participaron 450 pacientes con DM2 relacionada con la obesidad y dislipidemia encontró que la HLF redujo eficazmente la glucosa en sangre, reguló los lípidos, redujo el peso corporal y mejoró la sensibilidad a la insulina.

Investigaciones adicionales sugirieron que HLF puede modular la microbiota intestinal (p. ej.,Faecalibacterium, Blautia) e influyen en vías metabólicas como la degradación de ácidos grasos y la glucólisis/gluconeogénesis. A pesar de su eficacia clínica comprobada, los mecanismos precisos aún no están claros, lo que limita una aplicación más amplia.

La farmacología en red ofrece un enfoque a nivel de sistemas para dilucidar los mecanismos de las enfermedades y las acciones de los fármacos mediante la integración de la bioinformática y la detección de alto rendimiento. Este estudio utiliza farmacología en red, acoplamiento molecular, dinámica molecular y experimentos con animales para descubrir los mecanismos de múltiples objetivos de HLF en el tratamiento de los trastornos metabólicos de los glucolípidos.

2. Materiales y métodos

2.1 Instrumentos

D3024R Centrífuga refrigerada de alta velocidad (SCILOGEX)

Aparato de electroforesis Y300C y tanque de electroforesis JY300C (Junyi Oriental, Beijing)

Sistema de imágenes ChampGel 5000 (Saizhi Innovation, Beijing)

SMA-1000 espectrofotómetro (Meilin Hengtong, Beijing)

Sistema qRT-PCR StepOne Plus (ABI)

Unidad de electroforesis universal PowerPac (Bio-Rad)

PB-10 medidor de pH (Sartorius)

Analizador de quimioluminiscencia Tanon 5200 (Tanon, Shanghai)

2.2 Medicamentos a base de hierbas

La fórmula HLF incluye:

cistanche (Cistanchés Herba)

Momordica charantia

Scutellaria baicalensis

Áloe vera

Schisandra chinensis

Zingiber officinale

Salvia miltiorrhiza

Atractylodes macrocephala
Todas las hierbas eran extractos de fórmula granulada (Tianjiang Pharmaceutical, Jiangyin).

Fármaco de control:clorhidrato de metforminacomprimidos (0,5 g por comprimido, Bristol-Myers Squibb, Shanghai).

2.3 Reactivos y Anticuerpos

Reactivo TRIzol (Invitrogen)

Kit de síntesis de ADNc HiFiScript (CW2569)

Mezcla UltraSYBR (alto ROX, CW2602)

Kit de ensayo de proteína BCA

Anticuerpos primarios dirigidos a p-AKT, p-NF-κB p65, AKT, NF-κB p65, FN1, p53, IL-1, IL-6, EGFR, TNF-, -catenina, ESR1, -actina

Anticuerpos secundarios (IgG de cabra anti-conejo/ratón conjugada con HRP)

2.4 Modelos animales

Se compraron ratones macho C57BL/6J (7 semanas de edad) y se alojaron en condiciones SPF estándar. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Guang'anmen (nº de aprobación IACUC-GAMH-2019-002).

2.5 Predicción de objetivos

Los compuestos activos de HLF se consultaron enCTDyPredicción SwissTarget(probabilidad > 0,1). Los objetivos relacionados con la enfermedad para la DM2 y la dislipidemia se recuperaron deTarjetas genéticas(puntuación de relevancia > 1). Los diagramas de Venn identificaron objetivos superpuestos para un mayor análisis del PPI.

2.6 Construcción de la red PPI

Se introdujeron objetivos superpuestos enCADENA(https://www.string-db.org), con confianza media (puntuación mayor o igual a 0,4). La red fue visualizada y analizada enCitoscapey objetivos centrales identificados por grado de centralidad.

2.7 Enriquecimiento GO y KEGG

Se presentaron objetivos clave ametapaisajepara análisis de vías GO (BP, MF, CC) y KEGG (P <0,01). La visualización se realizó mediante gráficos de burbujas.

2.8 Red de ruta objetivo compuesta

Cytoscape se utilizó para construir una red que conecta hierbas, compuestos, objetivos y vías, ilustrando interacciones de múltiples objetivos y múltiples vías.

2.9 Acoplamiento molecular

Se obtuvieron estructuras 2D de compuestos a partir dePubChem, convertido a PDB usandoBabel abierta. Las estructuras de proteínas se descargaron deRCSB AP, preparado enAutoDockHerramientasy acoplado usandoVelaViña. Se consideró significativa una afinidad de unión menor o igual a −4,25 kcal/mol. Los resultados del atraque se visualizaron conPyMOL.

2.10 Simulación de dinámica molecular

Las simulaciones MD se realizaron utilizandoAmber18para complejos superiores seleccionados. Proteína: ámbar14SB; ligando: garfio; agua: modelo OPC. RMSD y RMSF se calcularon a partir de simulaciones NPT de 20 ns.

2.11 Agrupación e intervención de animales

Los ratones fueron asignados al azar en 4 grupos: Normal (N), Modelo (M), Metformina (MET) y HLF. Excepto el grupo N, todos los ratones fueron alimentados con una dieta alta en grasas (HFD) durante 6 semanas. HLF se administró a 14 g/kg (equivalente de hierba cruda), MET a 250 mg/kg. Después de 8 semanas de intervención, se recogieron sangre y tejidos hepáticos para su análisis.

2.12 QRT-PCR

El ARN total se extrajo usando TRIzol. El ADNc se sintetizó utilizando HiFiScript. La qPCR se realizó con UltraSYBR y StepOne Plus. La expresión relativa se calculó mediante 2 ^ −ΔΔCt.

2.13 Transferencia Western

Las proteínas se extrajeron del tejido hepático, se cuantificaron, se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después del bloqueo y la incubación con anticuerpos primarios y secundarios, las señales se visualizaron mediante ECL y se cuantificaron utilizando ImageJ. -actina para la normalización.

2.14 Análisis estadístico

Los datos fueron analizados usandoSPSS 23.0yPrisma GraphPad 10.1.2. Se utilizaron ANOVA unidireccional y pruebas t, considerándose estadísticamente significativo P < 0,05.