Cistanche Glyside Rg1 mejora la fibrosis hepática inducida por el envejecimiento al inhibir el inflamasoma NOX4/NLRP3 en ratones SAMP8

Abstracto.Envejecimientosuele ir acompañado dedaño hepáticoyfibrosis, lo que eventualmente conduce a una disminución enFunción del hígado. Sin embargo, el mecanismo dedaño hepático inducido por el envejecimientoyfibrosisHasta donde sabemos, todavía no se comprende por completo, y actualmente no hay opciones de tratamiento efectivas disponibles para el envejecimiento del hígado. Se ha informado que Cistanche Glycoside Rg1 (Rg1) ejerce potentes efectos antienvejecimiento debido a su potente actividad antioxidante y antiinflamatoria. El presente estudio tuvo como objetivo investigar el efecto protector y el mecanismo de acción subyacente de Rg1 endaño hepático inducido por el envejecimientoyfibrosisensenescencia aceleradaratones propensos a ratones 8 (SAMP8) tratados durante 9 semanas.

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Los resultados histopatológicos mostraron que la disposición de los hepatocitos estaba desordenada, se produjo una degeneración tipo vacuola en la mayoría de las células, y el colágeno IV y el TGF- 1, que se detectaron mediante inmunohistoquímica, también aumentaron significativamente en el grupo SAMP8. El tratamiento Rg1 mejoró notablementelesión hepática y fibrosis inducidas por el envejecimiento, y disminuyó significativamente los niveles de expresión de colágeno IV y TGF- 1. Además, los resultados de la tinción con dihidroetileno y la transferencia Western mostraron que el tratamiento con Rg1 redujo significativamente los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) e IL-1 , y reguló a la baja los niveles de expresión de NADPH oxidasa 4 (NOX4), p47phox, p22phox, NF- fosforiladoκB, caspasa-1, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasa C-terminal y el dominio de pirina de la familia NLR que contiene 3 inflamasomas (NLRP3), que se regularon significativamente en los tejidos hepáticos de ratones SAMP8 de edad avanzada. En conclusión, los hallazgos del presente estudio sugieren que Rg1 puede atenuarlesión hepática y fibrosis inducidas por el envejecimientoal reducir el estrés oxidativo de ROS mediado por NOX4 e inhibir la activación del inflamasoma NLRP3.

Introducción

La fibrosis hepática es un proceso dinámico asociado con el depósito y la reabsorción continuos de la matriz extracelular, principalmente colágeno fibrilar (3), que a menudo es el primer paso en la distorsión arquitectónica y la disfunción que impide el funcionamiento normal del hígado (4). Si no se trata, la fibrosis hepática puede provocar cirrosis hepática avanzada y hepatoma (4). La evidencia acumulada ha sugerido que la susceptibilidad a la fibrosis hepática y la hepatitis aumenta significativamente con la edad (5). Por lo tanto, sigue siendo de gran importancia estudiar el envejecimiento del hígado y los mecanismos subyacentes asociados para proporcionar estrategias novedosas para prevenir la fibrosis hepática relacionada con el envejecimiento.7

receptor de reconocimiento de caspasa-1 y proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasa C-terminal (ASC). Según el hallazgo de estudios previos, se descubrió que el inflamasoma NLRP3, un tipo de inflamasoma que se expresa de manera ubicua en numerosos tejidos, incluido el hígado, está involucrado en la evolución de la fibrosis hepática y la progresión de la lesión hepática y la enfermedad hepática relacionada con la edad ( 20‑22). Cuando es activado por diversos irritantes, como el ATP y los cristales de colesterol, así como por patógenos bacterianos, virales y fúngicos (23,24), el inflamasoma NLRP3 responde a la inflamación promoviendo la maduración de una serie de citocinas proinflamatorias, como la IL-1 e IL‑18 (25). Además, se ha informado que la acumulación excesiva de ROS activó el inflamasoma NLRP3 en el hígado durante el proceso de envejecimiento, lo que eventualmente llevó a la enfermedad hepática asociada al envejecimiento (26).

Materiales y métodos

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98 por ciento; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) una vez al día durante 9 semanas. Los grupos SAMP8 y SAMR1 se trataron con agua destilada durante 9 semanas. Después de 9 semanas de tratamiento, se sacrificaron seis ratones de cada grupo mediante dislocación cervical. Los hígados se recolectaron y almacenaron a -80 ˚C para su uso posterior en experimentos de transferencia Western, o se colocaron

tomo (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) a -20˚C. Las secciones se lavaron con PBS y se incubaron con 5 mg/l de solución Hoechst 33258 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, las secciones se sellaron con un agente de extinción de la fluorescencia (Instituto de Biotecnología Beyotime) y se visualizaron usando un microscopio de fluorescencia (Olympus IX72; Olympus Corporation; aumento, x400). Se usó el software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) para detectar la densidad promedio de fluorescencia roja de tres campos de visión seleccionados al azar en cada sección para indicar la producción de ROS.

Examen patológico del tejido hepático.

Los cambios morfológicos en el hígado se examinaron mediante técnicas de tinción con H&E, ácido peryódico de Schiff (PAS) y tricrómico de Masson. La tinción con H&E es el método más común para observar cambios patológicos en los tejidos (38). Brevemente, las muestras de hígado se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante 24-48 h, se deshidrataron y se incluyeron en parafina, luego se cortaron en secciones de 5 µm de espesor. Las secciones de hígado (n=4) se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en series graduadas de alcohol (etanol anhidro, 85 % de etanol, 75 % de etanol), luego se tiñeron con hematoxilina durante 3 min y eosina durante 30 s. Todos estos pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Las secciones se sellaron con resina neutra y se observaron usando un microscopio óptico (Olympus IX72; Olympus Corporation; aumento, x200).

Tinción inmunohistoquímica.

Las secciones incluidas en parafina (n=4) se desparafinizaron y rehidrataron, según el método descrito para la tinción H&E. Luego, las secciones se incubaron con H2O2 al 3 por ciento durante 10 minutos a 37 °C para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena antes de sumergirlas en tampón de citrato de sodio hirviendo durante 7 minutos en un horno de microondas para la recuperación del antígeno. Posteriormente, las secciones se incubaron con suero de cabra al 10 % (n.º de cat. C0265; Instituto de Biotecnología Beyotime) a 37 °C durante 30 min para bloquear la unión no específica. A continuación, las secciones se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche: anticolágeno IV policlonal de conejo (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; n.° de cat. BS1072), anti‑NLRP3 policlonal de conejo (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; n.º de catálogo BS90949) y anti-TGF-1 policlonal de conejo (1:100; Abcam; n.º de catálogo ab92486).

Transferencia occidental.

La proteína total se extrajo de los tejidos del hígado (n{{0}}) utilizando el tampón de lisis RIPA (n.º de cat. P0013B; Instituto de Biotecnología Beyotime) y una máquina automática de molienda rápida de muestras (Jinxing Industrial Development Co.,Ltd .) a 65 Hz durante 60 segundos a 4˚C. La proteína total se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA y las proteínas (20 µg) se separaron mediante SDS/PAGE al 8-15 por ciento. Las proteínas separadas se transfirieron posteriormente a membranas de PVDF (MilliporeSigma) y se bloquearon con leche desnatada al 5 % en tampón TBS-0,05 % Tween-20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios durante la noche a 4 ˚C: anti‑NLRP3 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; n.º de cat. BS90949), anti‑ASC (1:1 ,000; BIOSS; n.º de catálogo bs‑67412‑R), anti‑caspasa‑1(1:1,000; Abcam; n.º de catálogo ab1872), anti‑IL‑1 (1:500; Abcam; n.º de cat. ab9722), anti-NOX4 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; n.º de cat. BS60435), anti-p47phox (1:1,{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; n.° de catálogo BS4852), anti‑p22phox (1:1,000;Bioworld Biotechnology, Inc.; n.° de catálogo BS60290), anti‑NF‑κB p65 (1:1,000; Wuhan Service Technology Co., Ltd.;

Después de la incubación del anticuerpo primario, las membranas se lavaron con TBST tres veces (10 min cada vez) y se incubaron con IgG de cabra anti-conejo conjugada con HRP (1:10,000; Affinity Biosciences; cat. no. S 0001) y anticuerpos secundarios IgG anti-ratón de cabra (1:10,000 Affinity Biosciences; n.º de cat. S0002) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un kit ECL (Bio‑Rad Laboratories, Inc.) y un Bioshine Chemi Imaging System (Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology). La densidad óptica de cada banda se semicuantificó utilizando el software ImageJ 1.53a (Institutos Nacionales de Salud) y se normalizó a la expresión de GAPDH.

Análisis estadístico.

Todos los datos se presentan como la media ± SD de mayor o igual a 3 experimentos independientes. Se utilizó el software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.) para realizar los análisis estadísticos. Se realizó ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparar las diferencias entre los grupos. PAG< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Resultados

explorar si Rg1 alivia la fibrosis hepática relacionada con el envejecimiento, se midió la deposición de colágeno en los tejidos del hígado mediante la tinción de Masson. Los resultados mostraron que las áreas positivas azules aumentaron significativamente en los tejidos hepáticos del grupo SAMP8 en comparación con el grupo SAMR1 (Fig. 2A y B). Sin embargo, en comparación con el grupo del modelo SAMP8, los niveles de depósito de colágeno se redujeron significativamente en los grupos de tratamiento con tempol, apocinina y Rg1 (5 y 10 mg/kg) (Fig. 2A y B). Además, los niveles de expresión de colágeno IV y TGF‑1 se midieron en tejidos hepáticos mediante tinción inmunohistoquímica.

Los resultados de las tinciones de colágeno IV revelaron que el colágeno IV se expresó en niveles bajos en los tejidos del hígado en el grupo SAMR1 (Fig. 3A y C). Sin embargo, en comparación con el grupo SAMR1,

El tratamiento con Rg1 reduce la producción de ROS y la expresión de NOX4 en el hígado de ratones SAMP8. ROS es un factor importante en el desarrollo de fifibrosis hepática (41). En el presente estudio, se utilizó una sonda de ROS, DHE, para detectar el nivel de producción de ROS en los tejidos hepáticos. Los resultados mostraron que había bajos niveles de producción de ROS en los tejidos hepáticos del grupo SAMR1. Sin embargo, en comparación con el grupo SAMR1, los niveles de producción de ROS aumentaron significativamente en el grupo SAMP8 (Fig. 4A y B), mientras que en comparación con el grupo SAMP8, el tratamiento con tempol, apocinina y Rg1 (5 y 10 mg/kg) aumentó significativamente. redujo los niveles de producción de ROS en los tejidos hepáticos (Fig. 4A y B). Para confirmar el efecto de NOX4 sobre la acumulación de ROS durante el envejecimiento, se analizaron los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con NOX4. Los resultados demostraron que, en comparación con el grupo SAMR1, los niveles de expresión de NOX4, p22phox y p47phox en los tejidos del hígado aumentaron significativamente en el grupo SAMP8 (Fig. 5A‑D).

Sin embargo, en comparación con el grupo SAMP8, el tratamiento con tempol, apocinina y Rg1 (5 y 10 mg/kg) disminuyó significativamente los niveles de expresión de NOX4, p22phox y p47phox en los tejidos hepáticos durante el envejecimiento (Fig. 5A‑D). Estos datos sugirieron que el tratamiento con Rg1 puede mejorar la lesión por estrés oxidativo inducida por ROS en los tejidos hepáticos al inhibir NOX4 durante el envejecimiento en ratones.