Análisis de componentes aromáticos y metabolitos diferenciales en Cistanche Musalais basado en GC-MS y metabolómica

 

Abstracto:Este estudio preparó Cistanche Musalais utilizando técnicas tradicionales con uvas rojas Xinjiang Hetian y diversas adiciones de Cistanche. Las condiciones óptimas de procesamiento se determinaron mediante ANOVA unidireccional. Se utilizaron GC-MS y metabolómica no dirigida para analizar los componentes del aroma y los metabolitos diferenciales, y se cuantificaron los componentes activos como los flavonoides totales y los polifenoles totales. Las condiciones óptimas fueron: contenido inicial de azúcar de 32 grados Bx, temperatura de fermentación de 25 grados y adición del 7% de Cistanche deserticola. En estas condiciones, el contenido de alcohol, acidez total, flavonoides totales y polifenoles totales alcanzaron (12,6 ± 0,6)% vol, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L y (0,60 ± 0,00) g/L, respectivamente. GC-MS detectó 38 compuestos aromáticos, siendo los ésteres la clase más abundante (24 compuestos), seguidos de 6 alcoholes, 2 cetonas y 2 aldehídos. En comparación con el Musalais elaborado únicamente con jugo de uva, el Cistanche deserticola Musalais exhibió niveles significativamente más altos de ésteres clave, incluidos acetato de etilo (6,42% frente a . 2.42%) y palmitato de etilo (3,75% frente a . 1.18%), mientras que los alcoholes superiores como el isobutanol disminuyeron notablemente (2,11% frente a . 3.98%). La metabolómica identificó 230 metabolitos diferenciales (VIP mayor o igual a 1, P <0,05), enriquecidos en vías relacionadas con los transportadores ABC y la biosíntesis de aminoácidos. Componentes como la trigonelina y la crocina estaban significativamente elevados. El metabolismo de los aminoácidos contribuyó a la formación del perfil de sabor característico. Este estudio proporciona una base teórica y técnica para el desarrollo y mejora de la calidad de Cistanche Musalais. Las investigaciones futuras deberían incorporar técnicas sensoriales moleculares, como GC-O, para identificar mejor los compuestos activos clave responsables del perfil de sabor general.

Palabras clave: cistanche;Musalais; GC-EM; metabolómica

cistancheMusalais

 

 

 

Detalles del listado de Cistanche Musalais

 

 

 

Musalais (Msalais)es una bebida fermentada tradicional exclusiva de Xinjiang, producida a partir de uvas rojas Awati o uvas rojas Hetian (Hotan). Se elabora mediante exprimido, concentración y fermentación espontánea, y se caracteriza por ser primitivo, natural y verde. Como bebida alcohólica fermentada naturalmente exclusivamente china, Musalais exhibe características regionales distintas en atributos sensoriales, valor nutricional y actividades funcionales. Los alcoholes, ésteres, aldehídos, ácidos, fenólicos y terpenos generados durante la fermentación no solo confieren un sabor único sino que también se asocian con beneficios como favorecer la circulación sanguínea, disminuir los lípidos en sangre, tonificar el riñón y fortalecer el organismo, regular el colesterol y mantener la salud cardiovascular y cerebrovascular, lo que lo hace apto para consumidores de diferentes edades [1].

En los últimos años, con la creciente demanda de bebidas saludables por parte de los consumidores, el mercado de licores funcionales se ha expandido rápidamente. Partiendo de la elaboración tradicional de cerveza, los licores funcionales incorporan componentes funcionales específicos para satisfacer necesidades de bienestar, mantenimiento de la salud o regulación fisiológica específica. Su calidad está influenciada por las materias primas, los procesos, las comunidades microbianas y la estabilidad de los componentes funcionales [2]. En la práctica popular del sur de Xinjiang, a menudo se añaden complementos locales como la baya de goji, el cártamo, el cistanche y el azafrán durante la preparación del musalais para mejorar los beneficios para la salud y enriquecer la diversidad de sabores [3]. Entre estos, Cistanche, rico en polisacáridos, aminoácidos, glucósidos feniletanoides, glucósidos iridoides y alcaloides, tiene efectos tónicos sobre el yang del riñón, modula la función neuroendocrina y combate la fatiga, lo que le valió el nombre de "ginseng del desierto" [4-5].

Sin embargo, la industrialización de Cistanche Musalais enfrenta actualmente desafíos que incluyen la falta de estándares de producción, tecnología de procesamiento incompleta e investigación insuficiente sobre sustancias aromatizantes, lo que limita su promoción en el mercado y la mejora de la calidad. En este estudio, se utilizó Cistanche como complemento para optimizar el proceso de fermentación de Musalais. Se emplearon GC-MS y metabolómica no dirigida para resolver sistemáticamente los componentes del aroma y los metabolitos diferenciales, con el objetivo de proporcionar una base teórica y soporte técnico para la producción estandarizada, la modulación del sabor y la mejora funcional de Cistanche Musalais, promoviendo así la modernización y el desarrollo de valor de esta bebida tradicional.

1 Materiales y métodos

 

1.1 Materiales y reactivos

 

Cistanche tubulosa (Cistanche tubular): especímenes comerciales de primera calidad procedentes de Hetian (Hotan), Xinjiang, con una textura regordeta y libres de moho e impurezas.

Uvas rojas Hetian: fruta comercial con apariencia intacta y aroma fuerte, procedente de Hetian, Xinjiang.

Metanol y acetonitrilo: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.

Ácido fórmico: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.

L-2-clorofenilalanina: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

 

1.2 Instrumentos y equipos

 

Agitador magnético de temperatura constante 08-2T, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.

Dispositivo SPME 57330-U y fibra SPME DVB/CAR/PDMS 57348-U 50/30 μm, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Sistema GC-MS 6890N-5973, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.

Centrífuga refrigerada 5430R, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.

TL-48R trituradora de tejido de alto rendimiento, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.

Concentrador de vacío SCIENTZ-1LS, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.

Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.

SDAJ-0.5 Línea de producción de vino de estilo chino, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.

1.3 Métodos experimentales

 

1.3.1 Flujo de proceso

Cistanche se coció al vapor para su uso posterior. Las uvas tintas de Hetian fueron lavadas y seleccionadas, despalilladas y trituradas. El jugo de uva se extrajo con una prensa, luego se calentó y se concentró para ajustar los indicadores de concentración del jugo. Finalmente, el producto Cistanche cocido al vapor se mezcló con jugo de uva concentrado y se fermentó bajo parámetros controlados de temperatura y tiempo. Después de la fermentación, el producto se clarificó para obtener Cistanche Musalais.

 

1.3.2 Preparación de Cistanche

Con modificaciones menores a Gong et al. [6], se peló Cistanche seco de alta calidad y no deteriorado, se cortó en rodajas, se envolvió en una gasa y se coció al vapor durante 20 minutos para su uso posterior.

 

1.3.3 Preparación del jugo de uva

Se utilizaron uvas rojas hetianas con un contenido inicial de sólidos solubles (azúcar) de 18 grados Bx. Se retiraron las uvas podridas, deterioradas y con maduración desigual. Después del lavado y pelado, se prensaron las uvas. El jugo se hirvió (concentró) a alta temperatura y se detuvo la concentración cuando el azúcar alcanzó 26, 29 o 32 grados Bx. El jugo se enfrió a temperatura ambiente para su uso posterior.

 

1.3.4 Proceso de fermentación de Cistanche Musalais

Se añadió Cistanche cocido al vapor en proporciones definidas (3%, 5%, 7%) a 600 ml de jugo de uva concentrado en un fermentador. El azúcar residual se midió cada 24 h durante la fermentación para controlar el progreso. Cuando el azúcar residual cayó a 4 g/L, se terminó la fermentación. El sobrenadante se recogió y se pasteurizó a 85 grados durante 30 minutos para obtener Cistanche Musalais.

1.3.5 Diseño experimental unifactorial para Cistanche Musalais

Se investigaron los efectos de la adición de Cistanche (3%, 5%, 7%), el contenido inicial de azúcar (26, 29, 32 grados Bx) y la temperatura de fermentación (22, 25, 28 grados) sobre las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad.

 

1.3.6 Análisis y mediciones

 

Contenido de alcohol, sólidos solubles y acidez total: determinado según GB/T 15038-2006 "Métodos analíticos generales para vino y vino de frutas".

Flavonoides totales: determinados con referencia a Xu et al. [7]. Se preparó una curva de calibración con la concentración de rutina (X) como abscisa y la absorbancia (Y) a 510 nm como ordenada, lo que produjo Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999, lo que indica una buena linealidad.

Polifenoles totales: determinados mediante el método de Folin-Ciocalteu [8]. Se preparó una curva de calibración con el contenido de ácido gálico (X) como abscisa y la absorbancia (Y) a 760 nm como ordenada, lo que produjo Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, lo que indica una buena linealidad.

 

1.3.7 Análisis GC-MS

Las muestras de dos grupos, experimental (32 grados Bx, 25 grados, 7% Cistanche) y control sin Cistanche, se sometieron a GC-MS.

Pretratamiento de la muestra: la muestra se colocó en un vial de extracción de 20 ml; Se añadieron 100 µl de 50 µg/ml de fenilacetato de isoamilo como estándar interno. El vial se selló y se equilibró en un baño de agua a 60 grados con agitación magnética a 250 r/min durante 20 min. Luego se insertó la fibra SPME durante 30 minutos de extracción. Antes de su uso, la fibra SPME se acondicionó en la entrada del GC a 250 grados durante 20 minutos.

Condiciones de GC-MS: columna HP-INNOWax (60 m × 250 μm × 0,25 μm); entrada 250 grados; línea de transferencia de 250 grados; flujo de gas portador 1,5 ml/min; división 4:1. Programa del horno: 40 grados (5 min), rampa 5 grados/min hasta 250 grados, mantener 10 min. Fuente de iones 230 grados; cuadrupolo 150 grados; IE 70 eV; escaneo completo 35–550 Da.

 

1.3.8 Metabolómica no dirigida

 

1.3.8.1 Preparación de muestras

Se probaron dos grupos: experimental (32 grados Bx, 25 grados, 7% Cistanche) y control sin Cistanche; n=3 réplicas biológicas por grupo, total 6 muestras. Después de descongelar y agitar, se transfirieron 300 µl de cada muestra a un tubo de 1,5 ml y se centrifugaron a 12.000 r/min, 4 grados durante 15 minutos. Luego, se trasladaron 100 μl de sobrenadante a un tubo de 2 ml, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se liofilizaron. Añadir 1 ml de metanol preenfriado:acetonitrilo (1:1, v/v), agitar durante 30 s; congelar a -20 grados durante 30 min; centrifugar a 12.000 r/min, 4 grados durante 10 min; recoger 850 l de sobrenadante y secar al vacío hasta completarlo; reconstituir en 150 μl de metanol al 50 % (con 5 ppm de 2-clorofenilalanina), agitar durante 30 s; centrifugar a 12.000 r/min, 4 grados durante 10 min; filtrar a través de una membrana de 0,22 μm y transferir el filtrado a viales. Combine de 10 a 20 μL de cada muestra para crear una muestra de control de calidad para evaluar la estabilidad del instrumento y la confiabilidad de los datos; Se omite el control de calidad si se incluyen menos de 5 muestras.

 

1.3.8.2 Condiciones analíticas

Cromatografía: columna ACQUITY UPLC HSS T3 (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); flujo 0,4 ml/min; columna de 40 grados; muestreador automático de 8 grados; inyección 2 μL. Fase móvil A: agua con 0,1% (v/v) de ácido fórmico; fase móvil B: acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% (v/v).
Espectrometría de masas: voltaje de pulverización +3.5 kV/-3,0 kV; gas envolvente 40 arb; gas auxiliar 10 arb; capilar 320 grados; temperatura del gas auxiliar 300 grados; Resolución MS1 ​​60.000; rango de escaneo m/z 70–1000; Estándar de objetivo AGC; TI máx. 100 ms; MS/MS dependiente de datos sobre los 4 iones superiores con exclusión dinámica 4 s; Resolución MS2 15.000; Energía de colisión HCD 30%.

 

1.3.8.3 Identificación de metabolitos

La identificación de metabolitos se basó en PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), que comprende una biblioteca interna de estándares, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), MoNA (https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/), NIST_2020_MSMS y un Biblioteca espectral MS/MS predicha por IA.

Nota sobre las bases de datos externas utilizadas en la anotación:

HMDB: una base de datos integral de metabolomas humanos (Versión 5.0) que contiene información química, clínica y bioquímica detallada para 220,945 metabolitos, con enlaces cruzados extensos a KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt y GenBank, y admite búsquedas espectrales avanzadas de texto/secuencia/estructura y MS/NMR. También asociado con DrugBank, T3DB, SMPDB y FooDB.

LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50.000 estructuras lipídicas seleccionadas), espectros, vías, herramientas para análisis de EM, dibujo de estructuras y recursos de nomenclatura/clasificación.

mzCloud: una biblioteca de espectros de masas avanzada que admite búsquedas basadas en espectro, estructura, subestructura, árbol y m/z, con 32 330 compuestos, 51 002 árboles espectrales y 16 531 567 espectros (con adiciones sustanciales en 2024), optimizada para el acceso al escritorio de Firefox/Chrome.

 

1.3.8.4 Análisis estadístico multivariado

Se aplicaron análisis multivariados a los datos de metabolitos de las 6 muestras para realizar PCA, aclarando las diferencias metabólicas entre Cistanche Musalais y Musalais. Los metabolitos diferenciales entre los grupos se examinaron utilizando la importancia variable de OPLS-DA en la proyección (VIP), el cambio de veces y los valores de P (umbral de VIP y significado como se indicó anteriormente), seguido de una interpretación biológica que incluye el enriquecimiento de la vía KEGG [9].

 

Referencias

[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, et al. Análisis cualitativo de los principales compuestos aromáticos asociados con el procesamiento tradicional de Musalais en Xinjiang, China. Revista del Instituto de Elaboración de Cerveza. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, et al. Avances de la investigación moderna sobre licor funcional fermentado. Elaboración de licores. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Discusión sobre estrategias de desarrollo del vino de uva Xinjiang Msalais. Ciencia y tecnología de elaboración de licores. 2008(7):111–113.
[4] Canción ZH, Lei L, Tu PF. Avances en la investigación de la actividad farmacológica en plantas de Cistanche Hoffing. y enlace. Medicamentos tradicionales y herbarios chinos. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. El desarrollo de la investigación de Cistanche Hoffmg. Y enlace. Revista china de etnomedicina y etnofarmacia. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, et al. Estudio sobre la tecnología de un nuevo vino fermentado de Cistanche. Comida moderna. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, et al. Actividades antioxidantes y antibacterianas de los flavonoides totales de Nervilia fordii. Horticultura del norte. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, et al. Fermentación mixta de orujo de cáscara de cítricos con Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae y Lactobacillus casei: optimización de procesos, actividades antioxidantes y análisis de metabolómica no dirigida. Biociencia de los alimentos. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, et al. Comparación de metabolómica ampliamente dirigida y metabolómica no dirigida de Ophiocordyceps sinensis salvaje. Moléculas. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Investigación sobre la tecnología de Rosa kwangsiensis var. vino fermentado sterilis [tesis de maestría]. Chongqing: Universidad del Suroeste; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, et al. Investigación sobre desarrollo de producto y optimización de superficie de respuesta de pera Msalais. Procesamiento de productos agrícolas. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Verificación de la adaptabilidad del método de determinación del cobre en GB/T15038-2006 método de análisis general de vinos y vinos de frutas. Elaboración de licores. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z, et al. Efecto de la temperatura de fermentación maloláctica sobre la calidad del vino Cabernet Sauvignon. Ciencias Agrícolas de Zhejiang. 2025;66(7):1724–1732.