Identificación de especies y análisis de la composición química de plantas silvestres de Cistanche de Kenia

Abstracto:Este estudio empleó técnicas de morfología, histología y códigos de barras de ADN de plantas para identificar las especies silvestres de Cistanche en Kenia. El contenido de los principales componentes activos, incluidos glucósidos feniletanoides, alcoholes de azúcar y betaína, en el Cistanche silvestre de Kenia se determinó mediante el método HPLC. En tanto, se realizó el análisis dactiloscópico. Los resultados mostraron que la planta silvestre de Cistanche recolectada en Kenia fue identificada como Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. El contenido de ingredientes activos comoechinacósido,cistanósido A, acteosido, isoactósidoy 2′-acetilactéósido en C. senegalensis de Kenia fueron más bajos que los de la C. tubulosa doméstica, pero más altos que los de la C. deserticola doméstica. El contenido de betaína era similar al de la C. deserticola doméstica, pero no contiene glucosa. Las características de la huella dactilar son más parecidas a las de la C. tubulosa doméstica. Este estudio proporciona una base para la protección de los recursos, la investigación en profundidad y el desarrollo del recurso Cistanche en Kenia.

Palabras clave: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenia; identificación de especies; códigos de barras de ADN; determinación de contenido

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

cistanche, una hierba preciada en la medicina tradicional china, se refiere a los tallos secos, escamosos y suculentos de plantas del desierto comoCistanche deserticolaYC Maycistanche tubulosa(Schenk) Wight, ambos miembros de la familia Orobanchaceae. Reconocido por su capacidad para tonificar el yang del riñón, nutrir la esencia y la sangre y humedecer los intestinos para aliviar el estreñimiento, Cistanche ha sido celebrado en los textos herbales chinos durante siglos. Su registro medicinal más antiguo aparece en el clásico antiguo.El clásico de Materia Médica de Shennong, donde Cistanche se clasifica como una hierba de "grado superior". A lo largo de la historia, numerosos textos médicos tradicionales han documentado los poderosos beneficios del Cistanche, lo que le valió el estimado apodo de "Ginseng del desierto".

Los diversos efectos farmacológicos de Cistanche se atribuyen a su variedad de compuestos bioactivos. Entre ellos, los glucósidos feniletanoides son los principales ingredientes activos responsables de los efectos tonificantes de los riñones y nutritivos de la médula de Cistanche. Estos compuestos, como el equinacósido y el acteósido, exhiben actividades neuroprotectoras, antidemencia, antienvejecimiento y hepatoprotectoras. En particular, el equinacósido y el acteósido son los dos compuestos de referencia utilizados para el control de calidad de Cistanche, como se especifica en la edición de 2020 de la Farmacopea China. Además, el efecto laxante de Cistanche se debe principalmente a sus componentes alcohólicos oligosacáridos, que incluyen betaína, manitol, fructosa, glucosa y sacarosa. Estos cinco componentes son ampliamente reconocidos como indicadores de la capacidad de Cistanche para humedecer los intestinos y promover la evacuación intestinal.

cistanche tubulosa(Schenk) Wight

En China, las principales especies de Cistanche incluyenCistanche deserticolaYC mamá,cistanche tubulosa(Schenk) R.Wight,salsa cistanche(CA Mey.) G., yCistanche sinensisG. Beck. Estas especies son nativas de regiones como Mongolia Interior, Ningxia, Gansu y Xinjiang. Más allá del noroeste de China, las especies de Cistanche también se distribuyen en regiones áridas y desérticas de Eurasia y el norte y este de África, incluidos países como Irán, Afganistán, Kenia, Pakistán y Mongolia.

Kenia, situada en el este de África y a caballo entre el ecuador, está compuesta principalmente por tierras altas con una altitud media de 1.500 metros, pero sus zonas septentrionales son desérticas o semidesérticas. Los pueblos indígenas de Kenia tienen una larga historia de uso de plantas medicinales con fines curativos. La región cuenta con una gran riqueza de flora medicinal, por ejemplo, extractos de la corteza y las raíces del árbol del cepillo de dientes (salvadora persicaL.) son conocidos por sus propiedades antiinflamatorias y antibacterianas y, a menudo, se utilizan para tratar dolores de muelas e infecciones. La corteza del árbol de sándalo (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) se utiliza para tratar la diarrea, mientras que las decocciones de ortiga masai (Urtica masaicaLas hojas de Mildbr.) se utilizan para el dolor de estómago. Esta rica tradición ha fomentado una vibrante cultura de plantas medicinales; sin embargo, debido a los desafíos del desarrollo económico, el uso de estas plantas medicinales no ha sido completamente documentado ni estudiado sistemáticamente.

Curiosamente, las especies de Cistanche a menudo se consideran malezas en África y no han recibido mucha atención ni investigación. De hecho, casi no hay estudios publicados sobre el Cistanche africano. En respuesta a una invitación del Departamento de Desarrollo Regional para Tierras Áridas y Semiáridas de la Comunidad de África Oriental, nuestro equipo de investigación realizó un estudio de campo en Kenia para investigar los recursos locales de Cistanche. Recolectamos especímenes silvestres de Cistanche, realizamos identificación botánica y analizamos sus compuestos bioactivos primarios. El objetivo era comprender la diversidad de especies y el potencial de desarrollo de Cistanche en Kenia, y proporcionar una base científica para futuras investigaciones y utilización de estas valiosas plantas del desierto.

Cistanche tubulosa raíz entera seca Venta en China

Envíanos un Whatsapp para más detalles

 

 

Materiales y métodos

Materiales vegetales

Los profesores Pengfei Tu y Yong Jiang de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Pekín, en Kajiado, Kenia (01 grados 50'01"S; 36 grados 47'00"E), recolectaron especímenes silvestres de Cistanche de Kenia en agosto de 2023. Se recolectaron dos plantas silvestres de Cistanche y se etiquetaron como K1 y K2, junto con las raíces de su planta huésped (ver Figura 1). La planta huésped fue identificada por Kennedy Matheka, asistente de investigación en el Herbario de África Oriental, Museos Nacionales de Kenia, comoSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, perteneciente a la familia Amaranthaceae. muestras deCistanche deserticolaycistanche tubulosafueron recolectados en la ciudad de Turpan y el condado de Yutian en la Región Autónoma Uygur de Xinjiang, respectivamente, y fueron autenticados por el profesor Pengfei Tu como tallos frescos y suculentos deCistanche deserticolaYC Ma ycistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Todas las muestras de vales se conservan en nuestro laboratorio.

Instrumentos

Sistema HPLC Waters Arc

Balanza electrónica Quintix125D-1CN (Sartorius, Beijing)

Microscopio óptico Olympus BX-50 (Olympus, Japón)

Escáner de diapositivas panorámico NanoZoomer-SQ (Hamamatsu Photonics, Japón)

Limpiador ultrasónico digital KQ500DE (Kunshan Sonic Instruments, China)

Molinillo de extracción de ADN MM400 (Retsch, Alemania)

Termociclador PCR (Analytik Jena, Alemania)

DYY-8C aparato y tanque de electroforesis (Fábrica de instrumentos Liuyi, Beijing)

Sistema de imágenes en gel MINI Space 1000 (Tanon, Shanghai)

Incubadora de temperatura constante (Yiheng, Shanghai)

reactivos

El echinacósido (lote: DST191008-038), el acteósido (DSTDL006101), el isoacteósido (DST210601-060) y el D-manitol (DSTDG006201) se adquirieron de Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulosido A (MUST-15040115), 2'-acetilacteosido (MUST-15071504), betaína (MUST-23082505), D-glucosa anhidra (MUST-23030214), fructosa (MUST-23031403) y sacarosa (MUST-23082505) se obtuvieron de Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. Metanol (grado HPLC, Thermo Fisher), acetonitrilo (grado HPLC, OCEANPAK), ácido fórmico (HPLC grado, reactivos VOKA) eran todos de pureza cromatográfica. Para el análisis molecular se utilizó un kit de extracción de ADN genómico de plantas (DP305, Tiangen Biotech, China) y agua ultrapura.

Preparación, tinción y observación de secciones de tallos suculentos.

Siguiendo el método mencionado en la referencia [10], se cortaron tallos suculentos frescos de Cistanche en tamaños adecuados y se conservaron en fijador FAA (70 % de etanol: ácido acético glacial: formaldehído=90:5:5). Después de lavar con agua corriente para eliminar el fijador residual, los tejidos se suavizaron con ácido fluorhídrico, se tiñeron con safranina, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se seccionaron. Después del montaje, los portaobjetos se hornearon, se fundió parafina y las secciones se tiñeron con una solución Fast Green de etanol al 95% y luego se sellaron con resina neutra. La morfología del tejido se observó bajo un microscopio y las secciones bien formadas se escanearon utilizando un escáner panorámico para obtener imágenes de alta resolución.

Extracción de ADN, amplificación por PCR y secuenciación

El ADN total de las muestras de Cistanche y las raíces de la planta huésped se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN genómico de plantas (Tiangen), siguiendo el protocolo del fabricante. Las concentraciones de ADN y las relaciones OD260/OD280 se midieron con un espectrofotómetro UV de microvolumen para evaluar la calidad antes de continuar.

La amplificación por PCR se dirigió a la región del espaciador 2 transcrito interno (ITS2) del ADN ribosomal y al gen psbA-trnH del cloroplasto para la identificación molecular [11]. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:

ITS2 adelante: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 reverso: 5'-GACGCTTCCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH adelante: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH reverso: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

Las reacciones de PCR (25 µL) incluyeron 12,5 µL de 2× Taq Master Mix, 1 µL de cada uno de cebadores directos e inversos (2,5 µmol·L⁻¹), 2 µL de plantilla de ADN y 8,5 µL de ddH₂O. Amplificación ITS2: 94 grados 5 min; luego 35 a 40 ciclos de 94 grados 30 s, 56 grados 30 s, 72 grados 45 s; extensión final a 72 grados 10 min. amplificación de psbA-trnH: 95 grados 4 min; 35 ciclos de 94 grados 30 s, 55 grados 1 min, 72 grados 1 min; extensión final a 72 grados 10 min. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel y las bandas diana se sometieron a secuenciación bidireccional de Sanger. Los cromatogramas de secuencia se analizaron utilizando CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., EE. UU.) para obtener secuencias de ADN objetivo, que se identificaron utilizando el sistema de código de barras de ADN de Materia Medica chino y el análisis BLAST en la base de datos GenBank. Los árboles filogenéticos se construyeron con el software MEGA X para la identificación de especies.

Determinación cuantitativa de cinco glucósidos feniletanoides

El contenido de cinco glucósidos feniletanoides se determinó siguiendo métodos previamente establecidos [13]. Preparación de soluciones de referencia: pesar con precisión echinacósido, tubulosido A, acteoside, isoacteoside y 2'-acetilacteoside, y disolverlos en metanol al 50% para preparar una solución estándar mixta de concentración predeterminada. Condiciones cromatográficas: columna Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm); fase móvil A: acetonitrilo-metanol (6:1, v:v); fase móvil B: tampón de ácido fórmico al 0,1%; elución en gradiente: 0–5 min, 10%–18% A; 5 a 15 min, 18 % a 24 % A; 15 a 20 min, 24 % a 26 % A; 20–28 min, 26%–30% A; 28–35 min, 30%–35% A. Caudal: 1,0 ml·min⁻¹; temperatura de la columna: 30 grados; Longitud de onda de detección: 330 nm. Método: inyecte 10 μL de cada solución estándar y de muestra en el HPLC para su análisis.

Determinación cuantitativa de betaína, manitol, fructosa, glucosa y sacarosa

Estos componentes se cuantificaron según métodos anteriores [14]. Soluciones de referencia: pesar con precisión betaína, manitol, fructosa, glucosa y sacarosa, disolverlos en agua para preparar una solución estándar mixta. Soluciones de muestra: diluir la solución de muestra de Cistanche (preparada como anteriormente) con metanol al 50 % hasta 1/5 de la concentración original, mezclar bien y filtrar a través de una membrana microporosa de 0,22 μm. Condiciones cromatográficas: columna Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); fase móvil: acetonitrilo-agua (77:23); caudal: 0,7 ml·min⁻¹; temperatura de la columna: 25 grados; Detección con detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD): temperatura del tubo de deriva 100 grados, flujo de gas portador 3 L·min⁻¹. La cuantificación se realizó inyectando 5 μL y 10 μL de soluciones estándar y 5 μL de solución de muestra, y calculando el contenido utilizando la ecuación logarítmica de dos puntos estándar externa.

Evaluación de similitud de huellas dactilares

Las soluciones de muestra se prepararon como se describe anteriormente, y las condiciones y métodos de HPLC fueron los mismos que para la cuantificación de glucósidos de feniletanoides. Los datos cromatográficos se importaron al "Sistema de evaluación de similitud de huellas dactilares cromatográficas de la medicina tradicional china (edición de 2012)". El cromatograma de la muestra K1 se utilizó como referencia, con cinco picos de glucósidos de feniletanoides marcados para corrección multipunto, generando cromatogramas de superposición y referencia, y calculando la similitud de huellas dactilares.

 

 

Resultados y análisis

1. Identificación morfológica de Cistanche

Los especímenes silvestres de Cistanche recolectados en Kenia exhiben características morfológicas distintivas. La inflorescencia es una espiga, con una bráctea de forma larga ovado-lanceolada y dos pequeñas bractéolas, ambas caras glabras. El cáliz es tubular, con cinco lóbulos romos en el ápice. La corola es tubular-campanulada, mide de 3 a 4 cm de largo, aproximadamente 2,5 veces la longitud del cáliz, con cinco lóbulos en el ápice y márgenes recurvados. La corola es de color amarillo (Figura 1A, B), tornándose marrón cuando se seca. Los filamentos miden aproximadamente 3 cm de largo, con algunos pelos finos en la base. El estilo es ligeramente más largo que los estambres y el estigma es casi esférico, liso y glabro. Hay cuatro estambres, con anteras ovadas y densamente cubiertas de largos pelos lanudos; la base de la antera es abruptamente puntiaguda. Esta característica es consistente con las descripciones deCistanche deserticolaysalsa cistancheen la "Flora de China"; por el contrario, la base de la antera decistanche tubulosaes romo y redondeado, lo que lo diferencia claramente de otras especies del mismo género [7].

Además, la planta huésped,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, es un arbusto muy ramificado. Sus ramas jóvenes están densamente cubiertas de pelos lanudos de color amarillo pálido o blanco. Las hojas son ampliamente espatuladas-obovadas con una base estrecha (Figura 1D, E). Las inflorescencias están densamente agrupadas a lo largo del pedúnculo, que, junto con el eje de la inflorescencia, está cubierto de pelos lanudos de color blanco grisáceo, gris pálido o blanco.

El tallo suculento del Cistanche silvestre es cilíndrico aplanado, con una superficie de color amarillo pálido o marrón densamente cubierta de escamas carnosas en forma de agujas dispuestas en filas. La textura es firme, pero ligeramente flexible (Figura 2A). La sección transversal del tallo suculento es de color amarillo pálido o marrón, con haces vasculares dispersos de color marrón pálido visibles a simple vista (Figura 2B). Bajo el microscopio, los haces vasculares aparecen ovoides o fusiformes, compuestos de xilema y floema, a menudo presentes como haces solitarios dispersos o agrupados en pares o tríos, con el floema orientado en varias direcciones (Figura 2C, D). Según la edición de 2025 de la Farmacopea China, la sección transversal deCistanche deserticolaes de color marrón, presenta haces vasculares en forma de puntos de color marrón pálido dispuestos en un anillo ondulado, a menudo formando un haz anular plegado hacia adentro; en contraste,cistanche tubulosamuestra haces vasculares dispersos en forma de puntos, una característica distintiva clave para identificar estos dos tipos de cortes de Cistanche [1]. El Cistanche silvestre de Kenia también muestra haces vasculares dispersos en forma de puntos en la sección transversal, lo que coincide con las características decistanche tubulosa.

 

 

Figura 2 Aspecto y características de la sección transversal de la planta silvestre Cistanche (K2) en Kenia. R: La apariencia del tallo; B: La sección transversal del tallo carnoso; C: Corte en parafina del tallo carnoso (tinción verde resistente a safranina); D: Vista ampliada del haz vascular en la sección de parafina.