Los polisacáridos de Cistanche inhiben la proliferación de células de cáncer de próstata e inducen la apoptosis mediante la generación de ROS y la supresión de genes antioxidantes

 

Abstracto:
Objetivo:Investigar los efectos y mecanismos subyacentes dePolisacáridos de cistanchesobre la proliferación y apoptosis decélulas cancerosas de próstata.

Métodos:
Se trataron células DU145 de cáncer de próstata humano con concentraciones bajas, medias y altas dePolisacáridos de cistanche(20, 40 y 80 mg/mL, respectivamente). La proliferación celular se evaluó utilizando elensayo MTT, y la apoptosis se evaluó mediantecitometría de flujo. intracelularespecies reactivas de oxígeno (ROS)Los niveles se midieron mediante citometría de flujo, mientras queglutatión (GSH)Los niveles se determinaron usandoELISA. Los niveles de expresión de ARNm y proteínas desubunidad catalítica de glutamato-cisteína ligasa (GCLC), subunidad modificadora de glutamato-cisteína ligasa (GCLM), ytiorredoxina reductasa 1 (TXNRD1)fueron analizados porRT-PCRymancha occidental, respectivamente.

Resultados:
La concentración inhibidora media máxima (IC₅₀) dePolisacáridos de cistancheen células DU145 fue de 40,35 mg/ml, por lo que se seleccionó 40 mg/ml como dosis media para experimentos posteriores. Las dosis baja, media y alta se definieron como 50 %, 100 % y 200 % de la IC₅₀, respectivamente.

Todos los grupos de tratamiento demostraron tasas de apoptosis significativamente mayores en comparación con el grupo de control. Elgrupo Cistanche en dosis altasexhibieron la mayor inhibición de la proliferación celular y la mayor tasa de apoptosis, seguidos por los grupos de dosis media y baja (P< 0,01). Los niveles de ROS se elevaron significativamente y los niveles de GSH se redujeron significativamente en todosGrupos tratados con Cistancheversus control. Notablemente, elgrupo de dosis altatenían ROS notablemente más altos y niveles de GSH más bajos que los grupos de dosis media y baja (P< 0,05); el grupo de dosis media mostró diferencias similares en comparación con el grupo de dosis baja (P< 0,05).

niveles de expresión deGCLC, GCLM, yTXNRD1(tanto ARNm como proteína) se redujeron significativamente en todos los grupos tratados con Cistanche en comparación con el control (P< 0,05). Elgrupo de dosis altamostró la supresión más significativa de estos genes y proteínas relacionados con los antioxidantes, seguidos por los grupos de dosis media y baja (P< 0,05).

 

Conclusión:
Polisacáridos de cistancheinhibir la expresión de factores antioxidantesGCLC, GCLM, yTXNRD1, reduciendo asíSíntesis de GSH, promoviendoacumulación de ROSy, en última instancia, inducirapoptosis en células de cáncer de próstata. Estos hallazgos sugieren quecistanchepuede servir como unagente terapéutico naturalpara el cáncer de próstata a través deMecanismos mediados por el estrés oxidativo..

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Antecedentes y métodos

cáncer de próstatarepresenta aproximadamente7,1% de todas las neoplasias malignas masculinas, con una incidencia máxima después de los 60 años. A medida que la población de China continúa envejeciendo, se espera que la incidencia de esta enfermedad aumente aún más [1]. Los estudios sugieren que la alta prevalencia del cáncer de próstata en hombres mayores puede estar relacionada concambios degenerativos en la próstata, predisposición genética, hábitos dietéticos, yfactores de estilo de vida [2].

resección quirúrgicasigue siendo un pilar en el tratamiento del cáncer de próstata, cuyo objetivo es extirpar la mayor parte de la masa tumoral. Sin embargo, se asocia con complicaciones importantes, comoincontinencia urinaria, disfunción sexual, y lo más crítico,recurrencia del tumor y metástasis, que son causas importantes de mal pronóstico [3].

En los últimos años,Medicina Tradicional China (MTC)ha ganado cada vez más atención por su papel en la terapia del cáncer. La medicina tradicional china puede ayudaraumentar la inmunidad, contrarrestar los efectos secundarios de la quimioterapia/radioterapia, ymejorar la desintoxicación. Algunas hierbas medicinales también presentanpropiedades antitumorales directas, incluida la inhibición del crecimiento tumoral yinducción de apoptosis en células cancerosas [4].

Entre estos,Cistanche (Cistanche deserticola)Es una hierba tónica tradicional conocida por suinmunomodulador, antioxidante, yefectos antitumorales. Sus principales componentes bioactivos sonpolisacáridosyglucósidos feniletanoides. Este estudio investiga los efectos y el mecanismo subyacente dePolisacáridos de cistancheenproliferación y apoptosis de células DU145 de cáncer de próstata.

 

1. Materiales y Métodos

1.1 Materiales y reactivos principales

Células de cáncer de próstata humano DU145se obtuvieron de Tongpai Biotech (Shanghai, China).

Polisacáridos de cistanche(Nº de lote: 0287181) se adquirieron en Weikeqi Bio Co., Ltd. (Sichuan, China).

Suero bovino fetal, penicilina/estreptomicina, yDMEMfueron proporcionados por Zeta Life (EE.UU.).

ensayo MTT, Kits de apoptosis de anexina V/PI, tampón de lisis RIPA, Kits de cuantificación de proteínas BCAse obtuvieron de Elabscience (Shanghai, China).

Kit de detección de especies reactivas de oxígeno (ROS)yKits ELISA para GSHse compraron en BioLab (Shanghai, China).

reactivo trizol, kits de transcripción inversa, ykits de PCRprocedieron de NeuroSym (Hangzhou, China).

Anticuerpos contraGCLC, GCLM, TXNRD1, -actina, y los anticuerpos secundarios correspondientes se adquirieron en UnivBio (Shanghai, China).

1.2 Ensayo de proliferación y cultivo celular

Las células DU145 se cultivaron enDMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicinaen una incubadora de CO₂. Para elensayo MTT, se sembraron células DU145 en fase logarítmica en placas de 96 pocillos y se trataron conSoluciones de polisacáridos de Cistanche.en concentraciones de10, 20, 40 y 80 mg/ml. El grupo de control recibió sólo medio DMEM.

Después de 24 horas de tratamiento,20 µL de MTT de 5 mg/mlSe añadió a cada pocillo y se incubó durante 4 horas. Se eliminó el sobrenadante y150 µL de DMSOfue añadido. Después de agitar durante 10 minutos, se midió la absorbancia a490 nmutilizando un lector de microplacas. ElIC₅₀fue calculado, y20, 40 y 80 mg/mlfueron seleccionados comodosis bajas, medias y altaspara experimentos posteriores. Eltasa de inhibición de la proliferación celularse calculó como:
Tasa de inhibición (%)=(OD_control - OD_tratado) / OD_control × 100

1.3 Ensayo de apoptosis

Las células DU145 en fase logarítmica se trataron con diferentes concentraciones dePolisacáridos de cistanchesegún agrupaciones. Después de la fijación y la tinción,Anexina V-FITCyPISe utilizaron para marcar células apoptóticas.Citometría de flujoSe realizó un análisis para detectar señales de fluorescencia y se registró el porcentaje de células apoptóticas.

 

1.4 Detección de niveles intracelulares de ROS y GSH

Los niveles de ROS se midieron utilizando uny citometría de flujo. Los niveles de GSH se cuantificaron utilizandoELISA. Se preparó una curva estándar utilizando concentraciones conocidas de estándares de GSH y se midió la absorbancia para calcular las concentraciones de GSH en las muestras.

 

1.5 RT-PCR para expresión de ARNm de GCLC, GCLM, TXNRD1

El ARN total se extrajo usandoTrizoly se sintetizó ADNc. La PCR se realizó utilizando cebadores específicos:

GCLC:

Delantero: 5'-GTCGGTGTCAAAATACGGAGTTCCA-3'

Reverso: 5'-CGTGACGAGGACTGCGTGCATGGAT-3'

GCLM:

Delantero: 5'-CCGATGACCGCCATAAACGTCCGTAGC-3'

Reverso: 5'-GGCTAAGCGTACGTAGTACGCAACGTA-3'

TXNRD1:

Delantero: 5'-TGACAGTCCTACCGTACGTAGAATGCC-3'

Reverso: 5'-ATAATGCCGTAGGGATGCGCTAGCAATGG-3'

-actina (control interno):

Delantero: 5'-TTAGGCGCGATGCAGTCAGATAAGC-3'

Reverso: 5'-ATGCAGTACGTACGGACGCGATAG-3'

Condiciones de amplificación: 95 grados durante 60 s, seguidos de 30 ciclos de 95 grados durante 30 s, 60 grados durante 30 s y 72 grados durante 60 s. Los productos de PCR fueron analizados porelectroforesis en gel, y la expresión genética relativa se normalizó a-actina.

 

1.6 Western Blot para la expresión de proteínas

La proteína total se extrajo usandobúfer RIPA, y la concentración de proteínas se determinó medianteensayo BCA. Las proteínas fueron separadas porPÁGINA SDS, transferido aMembranas de PVDF, bloqueado e incubado durante la noche a 4 grados con anticuerpos primarios contraGCLC, GCLM, TXNRD1, y-actina. Después de la incubación conAnticuerpos secundarios conjugados con HRP, las bandas se visualizaron usandoquimioluminiscenciay cuantificado porsoftware de imagen j.

 

1.7 Análisis estadístico

Todos los datos fueron analizados utilizandoSPSS 25.0. ANOVA unidireccional yPruebas de LSD-tse utilizaron para determinar la significación estadística.