Los mitogenomas de las especies de Cistanche sugieren diversidad y complejidad en los mitogenomas del orden Lamiales

2.4. Análisis de repeticiones y duplicación de segmentos

Los tipos y números de repeticiones variaron entre los tres mitogenomas. Los SSR son secuencias compuestas de repeticiones con motivos de 1 a 6 pb de longitud. Entre los mitogenomas de Cistanche, el número de SSR varió de 37 a 133 en el siguiente orden:C. tubulosa (133),C. deserticola(44) yC salsa(37). Los tipos de repetición de poliadenina o politimina fueron los SSR de mononucleótidos más prevalentes (Figura 2A y Tabla S10). Este resultado estuvo de acuerdo con el hecho de que el contenido de AT (55.41–55.43 por ciento) fue mayor que el contenido de GC (44.57–44.59 por ciento) en los mitogenomas de Cistanche (Tabla 1).

Figura 2. Repeticiones de secuencia simple (SSR), repeticiones intercaladas y repeticiones en tándem en mitogenomas de 3 especies de Cistanche. (A) Comparación de SSR entre los tres mitogenomas. Cada columna de color representa un tipo de repetición de SSR diferente. (B) Comparación de repeticiones en tándem entre los tres mitogenomas. (C) Comparación de repeticiones intercaladas en los tres mitogenomas. Cada columna de color representa un tipo diferente de repetición intercalada. El número de repeticiones en cada categoría se muestra en la parte superior de las columnas correspondientes.

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A continuación, detectamos las repeticiones intercaladas por REPuter. Las repeticiones intercaladas se dividieron en cuatro tipos: repeticiones directas, palíndromo, inversas y del complemento. En elMitogenomas de Cistanche, las repeticiones directas y palindrómicas fueron los principales tipos de repeticiones intercaladas (Figura 2B y Tablas S11–S13). Solo se detectaron 353 repeticiones intercaladas en el mitogenoma de C. salsa (Tabla S12) y más de 1300 en C. tubulosa (Tabla S13).

In addition to the SSRs and interspersed repeats, we also detected tandem repeats >30 bp in length and similarities of >90 por ciento . El número de repeticiones intercaladas osciló entre 4 y 26 en los mitogenomas de Cistanche (Figura 2C). El número de unidades repetidas osciló entre 1,8 y 2,5 copias por repetición en tándem, y los tamaños de repetición oscilaron entre 21 y 127 pb (Tablas S14–S16).

Los resultados de identificación de duplicación de segmentos mostraron que las secuencias de segmentos tenían una longitud de 199 584 pb a 2 142 551 pb (Tabla 1), lo que representa el 24,9 %, el 11,7 % y el 53,9 % de las longitudes de C. deserticola, C. salsa y C. mitogenomas de .tubulosa, respectivamente (Figura 3). En el mitogenoma de C. deserticola, se identificaron 39 alineaciones. Las longitudes de las alineaciones oscilaron entre 5078 pb y 38 025 pb (Tabla S17). Por el contrario, solo se identificaron 14 alineaciones en el mitogenoma de C. salsa. Las longitudes de las alineaciones oscilaron entre 5385 pb y 23,085 pb (Tabla S18). Vale la pena señalar que se encontraron 168 alineaciones en el mitogenoma de C. tubulosa. Las longitudes de las alineaciones variaron de 5169 pb a 64,106 pb (Tabla S19). Estas duplicaciones repetidas de segmentos de arena podrían haber promovido la reorganización del genoma y contribuido a las variaciones en el tamaño del genoma.

Figura 3. Las distribuciones de duplicación de segmentos mitogenómicos del3 especies de Cistanche. (A) Cistanche tubulosa. (B) Cistanche desertica. (C) Salsa Cistanche. El círculo más externo marca la posición del mitogenoma. Los arcos amarillos brillantes indican duplicación de segmentos.

2.5. Análisis filogenético por secuencias de mitogenomas

La filogenia se reconstruyó utilizando PCG mitocondriales compartidos de 11 mitogenomas de Lamiales utilizando el método de máxima verosimilitud (ML). El género hermano deCistanchefue Castilleja, con un bootstrap score (BS) de 100 (Figura 4). Estos dos géneros pertenecen a lafamilia orobanchaceae. Las especies de Cistanche se distribuyeron en dos clados principales. El primer clado (BS: 100) estaba formado porC. deserticolayC salsa, con el mismo tamaño de mitogenoma. El segundo clado contenía C. tubulosa con un BS de 100. Estos dos clados se agruparon posteriormente (BS: 100) (Figura 4). Los puntajes de bootstrap fueron altos para todas las ramas, lo que indica el alto grado de confiabilidad del árbol filogenético. Además, la relación filogenética de losespecies de cistancheconstruido utilizando los mitogenomas era congruente con el del genoma plástido, como se muestra en nuestros estudios anteriores.

Figura 4. Relaciones filogenéticas de especies de Cistanche con otras 8 especies de Lamiales. El árbol se construyó en base a las secuencias de aminoácidos de 49 genes codificadores de proteínas mitocondriales, incluidos atp1, atp4, atp6, atp8, atp9, atpB, atpE, ccmB, ccmC, ccmFc, ccmFn, cob, cox1, cox2, cox3, cytB, ItrA, matR, mttB, nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, nad6, nad7, nad9, petG, petL, rbcL, rpl2, rpl5, rpl10, rpl16, rpl23, rpl36, rps1, rps3, rps4, rps7, rps10, rps11, rps12, rps13, rps14, rps19, sdh3 y sdh4. Las especies en el cuadro rojo eran tresespecies de cistanche.

2.6. La tasa de sustitución de PCG mitocondriales

Los PCG mitocondriales compartidos se utilizaron para estimar la tasa de sustitución de nucleótidos de los PCG mitocondriales en Lamiales. Para cada uno de los 28 PCG, se calcularon las relaciones Ka/Ks por pares. Encontramos que las proporciones Ka/Ks de los cuatro PCG estaban por encima de 1.0 en la mayoría de las especies (Figura 5 y Tabla S20). Estos cuatro PCG fueron atp4, ccmB, ccmFc y matR, lo que sugiere una posible selección positiva. Sin embargo, la mayoría de los PCG mitocondriales mostraron relaciones Ka/Ks bajas, lo que indica una posible selección purificadora. En particular, la relación Ka/Ks de atp9, cox1, cox3 y nad4L mostró un valor relativamente bajo (Figuras S8–S31).

Figura 5. Diagramas de caja de valores Ka/Ks por pares entre cada gen codificante de proteína mitocondrial retenido dentro de las 11 especies de Lamiales.

3. Discusión

3.1. Expansión del genoma en C. tubulosa

Una parte sustancial de los mitogenomas de las plantas puede estar formada por pequeñas secuencias repetitivas [26]. Por ejemplo, el ADN repetitivo de baja complejidad constituía del 5 al 10 por ciento de las secuencias en los mitogenomas de Citrullus y Cucurbita [27]. Además, se observaron proporciones similares de secuencias de ADN repetitivas de baja complejidad en otras plantas [9,28]. En nuestro estudio, C. tubulosa, C. salsa y C. deserticola tenían secuencias repetidas de 174 618 pb, 32 375 pb y 149 945 pb de longitud, lo que representa el 4,4 %, el 1,89 % y el 8,06 % del tamaño del mitogenoma, respectivamente. Estos resultados fueron consistentes con los resultados de estudios previos, que mostraron que las secuencias repetidas pueden causar cambios en el tamaño del mitogenoma [9,26,27,28].

C. deserticolaposeía la mayor proporción de secuencias repetidas entre los tres mitogenomas de Cistanche en nuestro estudio. sin embargo, elel tamaño del mitogenoma de C. derserticola fue similar al de C. salsa, lo que significa que otros factores también pueden desempeñar funciones importantes en el tamaño del mitogenoma además de la pequeña secuencia repetitiva. La duplicación de segmentos y los genes que codifican proteínas de múltiples copias fueron otros dos factores que causaron la expansión del mitogenoma.

En el mitogenoma de C. tubulosa, las secuencias de los segmentos duplicados tenían una longitud de 2 142 511 pb, lo que representa el 53,9 por ciento del tamaño total del mitogenoma. De manera similar, Sloan informó que se identificaron repeticiones de 4.6-megabytes en el mitogenoma de Silene conica, lo que representa el 40,8 por ciento de todo el mitogenoma [13]. Además, los genes que codifican proteínas de múltiples copias podrían dar como resultado la expansión del mitogenoma. En el mitogenoma de C. tubulosa, las proporciones de genes centrales duplicados y genes variables fueron 58 por ciento y 35 por ciento, respectivamente. Para mitogenomas grandes típicos (especies de Cucumis), algunos genes codificadores de proteínas (rps19) también se presentan dos veces tanto en Citrullus como en Cucurbita [14]. En C. tubulosa, complejo Ⅰ (nad4, nad4L, nad6 y nad7), complejo Ⅳ (cox1 y cox2), complejo Ⅴ (atp4, atp8 y atp9), biogénesis citocromática (ccmFc y ccmFn), subunidad pequeña de proteína ribosómica (rps3, rps4 y rps14), el intrón maturasa (matR) y el gen que codifica la proteína de transporte independiente SecY (mttB) tenían múltiples copias. Especulamos que esto estaba relacionado con el hecho de que las plantas holoparásitas no realizan la fotosíntesis. Además, el estrés ambiental podría regular al alza la expresión de algunos genes relacionados. Estudios previos sugirieron que la cadena de transporte de electrones mitocondrial de la planta podría mejorar el rendimiento de la planta en condiciones ambientales estresantes [29].A diferencia de C. deserticola y C. salsa, C. tubulosa experimenta estrés por sal y estrés por frío en lugar de estrés por sequía[30,31,32]. Esto podría conducir a la duplicación de genes en C. tubulosa. En resumen, las repeticiones pequeñas, la duplicación de segmentos y los genes multicopia fueron las principales causas de la expansión del mitogenoma.

3.2. La presencia de los MTPT

En las plantas de angiospermas, los MTPT casi siempre están presentes [33]. En nuestro estudio encontramos secuencias MTPT de 158 C. deserticola, 128 C. salsa y 139 C. tubulosa. Tenían 35.165 pb, 28.963 pb y 26.911 pb de longitud, lo que representa el 1,89 por ciento, el 1,64 por ciento y el 0,68 por ciento delC. deserticola, C salsayC. tubulosamitogenomas, respectivamente. Chen et al. sugirió que se encontraron fragmentos de MTPT de 26.87-kilobytes en Suaeda glauca, lo que representa el 5,18 por ciento del mitogenoma [34]. Además, los MTPT descubiertos en Salix suchowensis representan el 11,3 por ciento (17,5 kb) del plastoma y el 2,8 por ciento (18,1 kb) del mitogenoma [35]. Curiosamente, la proporción de MTPT en los mitogenomas de Cistanche fue relativamente baja. Además, nuestros resultados mostraron que, en las secuencias de MTPT, los PCG de plástidos y el ARN de ribosomas eran secuencias parciales. Por el contrario, los genes de ARNt de plástidos tenían secuencias completas en los fragmentos de MTPT. La pérdida parcial de PCG de plástidos y ARN ribosomal sugiere que es posible que ya no funcionen en las secuencias de MTPT. Esto apoya la teoría de que los fragmentos de ADN de los plastomas suelen convertirse en pseudogenes no funcionales, mientras que algunos genes de ARNt aún realizan funciones normales [36].

4. Materiales y Métodos

4.1. Muestreo, extracción de ADN y secuenciación del genoma

Se recolectaron muestras frescas de C. deserticola, C. salsa y C. tubulosa de la Liga Alxa (Región Autónoma de Mongolia Interior), Ciudad de Tacheng (Región Autónoma de Xinjiang Uygur), Prefectura de Hotan (Región Autónoma de Xinjiang Uygur), China (Tabla S1) . Las muestras fueron identificadas por el profesor Yulin Lin y almacenadas en el Herbario de la Academia China de Ciencias Médicas y la Facultad de Medicina de la Unión de Pekín (con los números de registro de muestras CMPB13484, CMPB13485 y CMPB13487). La extracción de ADN total se llevó a cabo utilizando un kit de extracción de ADN genómico de plantas (Tiangen Biotech, Beijing, China). Utilizando el kit de creación de bibliotecas NEBNext® [37], se construyó una biblioteca de ADN con un tamaño de inserción de 400 pb. Posteriormente, se utilizó la plataforma de secuenciación Illumina HiSeq4000 para la secuenciación. La secuenciación produjo 5,44, 5,16 y 4,34 G de datos sin procesar, respectivamente (Tabla S1). Trimmomatic se utilizó para filtrar los datos sin procesar para obtener datos limpios [38]. En total, se obtuvieron datos limpios de 4,88 G, 4,62 G y 3,92 G, respectivamente. Las muestras de plantas también se usaron para la secuenciación Oxford Nanopore. La construcción de bibliotecas, la detección de calidad y la secuenciación se realizaron siguiendo el protocolo estándar del fabricante. En consecuencia, se obtuvieron 78,96 G, 39,19 G y 59,52 G de datos sin procesar, y después del filtrado y la calificación quedaron 48 G, 31,96 G y 54,56 G (Tabla S1).

4.2. Ensamblaje y anotación de mitogenomas

Se descargaron ocho mitogenomas de Lamiales como referencias del NCBI (Tabla S2). Inicialmente, enriquecimos las lecturas limpias relacionadas con el mitogenoma de los datos de Oxford Nanopore utilizando USEARCH [39]. Las lecturas filtradas de Nanopore se ensamblaron en contigs utilizando Nextdenovo v2.4.0 (disponible en línea: https://github.com/Nextomics/NextDenovo (20 de diciembre de 2020)) con los parámetros predeterminados. Los contigs obtenidos luego se usaron como referencias, denominados Cistanche Structure Contigs. Las lecturas de extremos emparejados de Illumina se mapearon de nuevo a Cistanche Structure Contigs usando Minimap2 [40] y SAMtools [41]. Extrajimos las lecturas de extremos emparejados filtradas de Illumina y las ensamblamos en contigs usando SPAdes v. 3.10.1 [42]. Al comparar el ensamblaje de lecturas cortas y largas usando Minimap2 [40], determinamos preliminarmente qué contig era la supuesta molécula mitocondrial. Los contigs de ensamblaje obtenidos anteriormente se corrigieron con las lecturas de extremo emparejado de Illumina utilizando NextPolish1.3.1 [43]. Los borradores de contigs mitocondriales se procesaron más siguiendo los pasos a continuación. En primer lugar, comparamos las secuencias con las del GenBank usando el programa BLASTn para determinar si eran lecturas mitocondriales [44]. En segundo lugar, anotamos los mitogenomas usando MITOFY para determinar si las secuencias contenían genes mitocondriales [14].

4.3. Identificación de ADN plástido mitocondrial (MTPT)

Cistanche mitogenomes se compararon con C. deserticola (MN614127), C. slsa (MN614128) y C. tubulosa (MN614129) plastomas para identificar MTPT utilizando BLASTn [44]. Los parámetros BLASTn se seleccionaron en base a los informados anteriormente [45]. Además, se utilizó TBtools para visualizar los resultados de BLASTn [46]. Con la ayuda de Cistanche plastomas como referencia, los segmentos de ADN transferidos identificados se anotaron utilizando BLASTn [44].

4.4. Análisis de repeticiones de secuencia simple (SSR), repeticiones en tándem, repeticiones intercaladas y duplicación de segmentos

Se utilizó el sitio web en línea MISA (disponible en línea: http://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/ (15 de enero de 2021)) para identificar los SSR en el genoma mitocondrial. Estos SSR incluían mono-, di-, tri-, tetra-, penta- y hexanucleótidos con números mínimos de 10, 6, 5, 5, 5 y 5, respectivamente. Con los parámetros predeterminados, Tandem Repeat Finder [47] se usó para identificar las repeticiones en tándem. Además, se utilizó REPuter para identificar secuencias repetidas directas, inversas, palindrómicas y complementarias [48]. El tamaño mínimo de repetición se estableció en 30 pb y la identidad de las unidades repetidas fue mayor o igual al 90 por ciento. Las duplicaciones de segmentos se identificaron comparando el genoma mitocondrial consigo mismo utilizando BLASTN con el valor e de configuración de parámetros=1 × 10−5. Todas las alineaciones con una longitud > 5000 pb y una puntuación > 90 % se consideraron duplicación de segmento para los cálculos del número de duplicación de segmento. Se utilizó TBtools para visualizar los resultados de BLASTn [46].

4.5. Análisis filogenéticos y estimación de tasas de sustitución de nucleótidos

Para los análisis filogenéticos, se utilizaron en la construcción las secuencias de ADN de los PCG del genoma mitocondrial compartido de 11 especies de Lamiales, incluida la especie Cistanche en este trabajo (Tabla S2). Los mitogenomas de otras 8 especies de Lamiales se descargaron de la base de datos GenBank Organelle Genome Resource. PhyloSuite (v1.2.1) se utilizó para extraer PCG mitocondriales compartidos de especies de Lamiales [49]. Se utilizó MAFFT (v7.450) para alinear las secuencias de aminoácidos correspondientes [50]. Las secuencias de aminoácidos alineadas se concatenaron y se usaron para construir los árboles filogenéticos mediante el método de máxima verosimilitud (ML), utilizando Solanum lycopersicum (MF03

5. Conclusiones

En conclusión, este estudio proporciona una primera visión de la diversidad estructural y la complejidad deMitogenomas de Cistanche. Nuestros resultados respondieron las tres preguntas científicas que se plantearon en la introducción. En primer lugar, los mitogenomas completos deC. deserticola, C salsayC. tubulosase ensamblaron con éxito, lo que fue un logro significativo en el estudio de los mitogenomas de Cistanche. En segundo lugar, elC. tubulosatenía un tamaño cercano a los 4 Mb, lo que indica una expansión significativa. Además, elC. tubulosalos mitogenomas diferían significativamente de los de losC. deserticolay C. salsa en términos de número de PCG duplicados y duplicación de segmentos. Tres especies de Cistanche se formaron en un clado, cercano a las especies de Orobanchaceae. Además, la topología de Lamiales en el presente estudio fue muy similar a la del sistema APG IV. En tercer lugar, se identificaron secuencias de MTPT en mitogenomas de tres especies de Cistanche, con PCG parciales y fragmentos de ARN de ribosomas, y ARNt completo de los plastomas. Por lo tanto, los resultados de este estudio revelaron muchos aspectos fascinantes de la diversidad y complejidad del mitogenoma.