Los glucósidos feniletanoides de Cistanche Tubulosa inducen la apoptosis en células Eca-109 a través de la vía dependiente de las mitocondrias
Mar 06, 2022
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CHANGSHUANG FU , JINYU LI , ADILA AIPIRE , LIJIE XIA , YI YANG , QIUYAN CHEN , JIE LV , XINHUI WANG y JINYAO LI
Resumen
Cistanche tubulosatiene varias funciones biológicas. En el presente estudio, se investigó el efecto antitumoral de los glucósidos feniletanoides solubles en agua de C. tubulosa (CTPG-W) sobre el cáncer de esófago. Las células Eca-109 se trataron con CTPG-W y la viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT. La apoptosis, el ciclo celular, el potencial de membrana mitocondrial (Δψm) y las especies reactivas de oxígeno se analizaron mediante citometría de flujo. Los niveles de proteínas en las rutas apoptóticas se detectaron mediante análisis de transferencia Western. Se determinó que CTPG-W redujo significativamente la viabilidad de las células Eca-109 mediante la inducción de la apoptosis y la detención del ciclo celular. Después del tratamiento con CTPG-W, el Δψm de Eca-109 se redujo notablemente, lo que está asociado con niveles regulados al alza de X asociado al linfoma de células B-2 (Bcl-2) y niveles regulados a la baja de Bcl-2. En consecuencia, los niveles de citocromo c y c-Jun NH2-terminal quinasa aumentaron, lo que aumentó los niveles de polimerasa escindida (ADP-ribosa) y caspasa escindida-3, {{18} } y -9, pero no caspasa-8. En consecuencia, los niveles de especies reactivas de oxígeno en las células Eca-109 demostraron cambios notables. Estos resultados indicaron que CTPG-W inducía la apoptosis de las células Eca-109 a través de una vía dependiente de mitocondrias.
Introducción
El cáncer de esófago es uno de los tipos de cáncer más comunes con la undécima tasa de morbilidad más alta y la sexta tasa de mortalidad más alta a nivel mundial y causó ~439,000 muertes en 2015 (1). La incidencia del cáncer de esófago varía notablemente entre las distintas regiones, siendo el este de Asia y el este y el sur de África los que presentan las tasas más altas de incidencia y el oeste de África las tasas más bajas en 2012 (1,2). En China, los casos estimados de cáncer de esófago y la mortalidad fueron 477,000 y 375,000, respectivamente, en 2015 (3). Aunque la tasa de morbilidad del cáncer de esófago ha disminuido en los países de índice sociodemográfico medio y medio-alto entre 2005 y 2015, la tasa de mortalidad sigue siendo alta debido al mal pronóstico (1,4). La combinación de resección quirúrgica con quimioterapia o radioterapia se ha utilizado para tratar el cáncer de esófago, sin embargo, se ha informado que entre 2003 y 2014 la tasa de supervivencia de 5-años se mantuvo<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
La medicina tradicional china a base de hierbas (CHM) se ha utilizado para tratar varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas (6), el cáncer colorrectal (7) y el carcinoma hepatocelular (8). Recientemente, los ensayos clínicos informaron que la combinación de CHM con quimioterapia o radioterapia no solo demostró una serie de beneficios sobre la calidad de vida y el alivio de los efectos secundarios inducidos por la quimioterapia o la radioterapia (9,10), sino que también mejoró la tasa de supervivencia de los pacientes. con cáncer de células no pequeñas de pulmón, hígado, gástrico, colorrectal, nasofaríngeo o cervical (9). Sin embargo, existe evidencia contradictoria con respecto a la eficacia del tratamiento con CHM en el cáncer de esófago (10,11). Numerosos estudios determinaron que una serie de medicamentos o componentes a base de hierbas podrían inhibir el crecimiento de células de cáncer de esófago in vitro e in vivo, incluidos Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt y Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (un nuevo diterpenoide ent-kaurene) (19), Qigesan (20) y decocción de Tonglian (21). Cistanche es un tipo de CHM y ejerce varias funciones biológicas, incluidas la antioxidación, la antiinflamación y la neuroprotección (22,23). Nuestro estudio anterior demostró queCistanche tubulosa glucósidos feniletanoides(CTPG) podría suprimir el crecimiento de células de melanoma B16-F10 in vitro e in vivo (24). Sin embargo, la escasa solubilidad en agua del CTPG utilizado anteriormente limita el desarrollo del fármaco (24). Por lo tanto, se utilizó CTPG soluble en agua (CTPG-W) y se investigó el efecto antitumoral en las células de cáncer de esófago (Eca-109). Se determinó que CTPG-W podría inhibir de forma dependiente de la dosis la viabilidad de las células Eca-109 a través de la inducción de la apoptosis a través de una vía dependiente de la mitocondria.
Materiales y métodos Animales.
Se compraron ratones hembra C57BL/6 (6-8 semanas, ~25 g) en el Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de Beijing (Beijing, China) y se alojaron en el laboratorio con temperatura controlada (25 °C), ciclo de luz (12/ 12) Animalario de la Universidad de Xinjiang (Urumqi, China). Todos los animales recibieron agua y alimentos libres de patógenos.
Línea celular y cultivo. La línea celular de carcinoma de esófago humano (Eca-109) fue preservada por el Laboratorio Clave de Recursos Biológicos e Ingeniería Genética de Xinjiang (Facultad de Ciencias y Tecnología de la Vida, Universidad de Xinjiang, Urumqi, China) y cultivada en RPMI{{1} } medio (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1 % L -glutamina (100 mM), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37˚C en una atmósfera humidificada que contiene 5 por ciento de CO2.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). CTPG-W (n.º de cat. SGJG20170410) se adquirió de Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, China). Los principales compuestos de CTPG fueron calificados y cuantificados por HPLC de acuerdo con nuestro estudio anterior (24). Brevemente, la HPLC se llevó a cabo en una columna ZORBAX SB‑C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) a 30 ˚C y se eluyó con una solución de ácido fórmico al 0,2 % y un gradiente de metanol a partir del 23 %, ya que se añadía 1 ml cada minuto. durante 45 min hasta llegar al 31 por ciento. Se inyectó un total de 10 µl de muestra y se detectó a 330 nm. El estándar de echinacósido se adquirió de Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China), y el estándar de acteoside se adquirió de Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Los estándares se utilizaron para analizar los componentes de CTPG-W.
ensayo MTT. La proliferación celular se midió con un ensayo MTT. Se inocularon células Eca{{0}} en 96-placas de pocillos a una densidad de 5x103 células en 100 µl RPMI{{5 }} medio/pocillo y cultivado a 37 ˚C durante 24 h, luego tratado con diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600 y 800 µg/ml) de CTPG-W o sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 0,4 % durante 24, 48 y 72 h. Se usó DMSO como control de disolvente (800 µg/ml de CTPG-W que contenía 0,4 por ciento de DMSO). Se utilizó cisplatino (20 µg/ml) como control positivo. Posteriormente, se descartó el sobrenadante tras centrifugar a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente, y se añadieron a cada pocillo 100 µl de solución de MTT (0,5 mg/ml en medio RPMI-1640 sin FBS) y se incubó a 37˚C. durante 3 h. Los cristales de formazán formados se disolvieron en 200 µl de DMSO. Los valores de densidad óptica (DO) se midieron a una longitud de onda de 490 nm mediante un lector de microplacas de 96-pocillos (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.). La viabilidad celular relativa se calculó de acuerdo con la fórmula: Viabilidad celular (porcentaje)=(OD tratada/ODsin tratar) x 100 por ciento. La morfología de las células Eca-109 se observó con un microscopio de fluorescencia invertido (aumento, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokio, Japón).
Para la proliferación de esplenocitos, se sacrificaron ratones C57BL/6 mediante dislocación cervical y se aislaron los bazos. Se preparó la suspensión de una sola célula y se sembraron los esplenocitos en 96-placas de pocillos a una densidad de 1x105 células/pocillo en 100 µl de medio RPMI-1640 y luego se trataron con diferentes concentraciones. (0, 200, 400, 600 y 800 µg/ml) de CTPG-W durante 24, 48 y 72 h a 37 ˚C con un 5 % de CO2. La proliferación de esplenocitos se midió por ensayo MTT, según el protocolo mencionado anteriormente. Índice de estimulación=ODtratada/ODsin tratar.
Medida de la apoptosis y del ciclo celular. Se cultivaron células Eca{{0}} en placas de 60 mm a una densidad de 2,5x105 células/placa durante 24 h y se trataron con diferentes concentraciones ({{31} }, 200, 400, 600 y 800 µg/ml) de CTPG-W o DMSO al 0,4 % durante 24 h a 37 °C con un 5 % de CO2. Las células se recogieron y se tiñeron con un kit de detección de apoptosis de anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC)/yoduro de propidio (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghái, China), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las muestras se recolectaron por citometría de flujo (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) y se analizaron con FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EE. UU.). Para analizar el efecto de CTPG-W en el ciclo celular, se sembraron 2,5x105 células Eca-109 en placas de cultivo de 60 mm y se trataron con CTPG-W (0, 100, 200 y 400 µg/ml) o 0,4 por ciento de DMSO durante 24 h a 37˚C con 5 por ciento de CO2. Todas las células se recolectaron y lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), luego se fijaron en etanol al 70 % enfriado con hielo a 4 °C durante 30 min. Después de lavar dos veces con PBS enfriado con hielo, las células se resuspendieron en 300 µl de tampón de tinción de PI/RNasa (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La distribución del ciclo celular se analizó con el software ModFit LT 3.0 por citometría de flujo (BD FACSCalibur).
Análisis del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) y especies reactivas de oxígeno (ROS). Para analizar el Δψm, las células Eca{{0}} se trataron con CTPG-W (0, 400, 600 y 800 µg/ml) o DMSO al 0,4 por ciento durante 24 h a 37 ˚C con 5 % de CO2 y teñido con el kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghái, China), según el protocolo del fabricante, durante 20 min a 37 ˚C . Después de lavar dos veces con tampón de lavado JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), las muestras se resuspendieron con 300 µl de tampón de lavado JC‑1 y se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur). La fluorescencia del colorante JC-1 en las células Eca-109 también se observó con un microscopio de fluorescencia invertido (aumento, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Para el análisis de ROS, las células Eca-109 se trataron con CTPG-W (0, 400, 600 y 800 µg/ml) durante 2, 4, 6, 12 y 24 h, y se tiñeron con especies reactivas de oxígeno Kit de ensayo (Beyotime Institute of Biotechnology), según protocolo del fabricante, durante 20 min a 37˚C. Después de lavar tres veces con PBS enfriado con hielo, las muestras se recolectaron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur) y se analizaron con el software FlowJo 7.6.
Actividad de eliminación de radicales 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). La actividad eliminadora de radicales libres de CTPG-W se determinó con un ensayo de radicales libres de DPPH de acuerdo con el protocolo publicado con una modificación menor, ya que el metanol se sustituyó por etanol para disolver el DPPH (25, 26). Para las mediciones en estado estacionario, se mezclaron 150 µl de DPPH (100 mmol/l) en etanol con diferentes concentraciones de CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 y 600 µg/ml) en 50 µl de PBS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. La absorbancia a 517 nm se detectó en presencia y ausencia de CTPG-W. Se utilizó un total de 50 µl de vitamina C como control positivo. La actividad de eliminación de radicales DPPH se calculó mediante la fórmula: Eliminación (porcentaje)=[1-(Una muestra-Ablanco)/A0] x100, donde Ablanco es la absorbancia del control (sin DPPH), Una muestra es la absorbancia de la muestra y A0 es la absorbancia de PBS con DPPH.
Análisis de Western Blot. Las células Eca{{0}} se trataron con CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) o DMSO al 0,4 % durante 24 ha 37 °C con CO2 al 5 %. Después de lavar dos veces con PBS, las células se lisaron en tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China) durante 20 min en hielo. Después de la centrifugación a 10,000 xg durante 10 min a 4˚C, se recogieron los sobrenadantes y se detectaron las concentraciones de proteínas con un kit de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific, Inc.) según los protocolos del fabricante. El análisis de transferencia Western se realizó de acuerdo con nuestra descripción anterior (24). Los anticuerpos contra caspasa-7 (n.º de cat. D120077), caspasa-8 (n.º de cat. D155240), caspasa-9 (n.º de cat. D220078), linfoma de células B{ {24}} (Bcl-2) asociado a X (Bax) (n.º de cat. D220073) y Bcl-2 (n.º de cat. D260117) y anti-ratón IgG-peroxidasa de rábano picante (HRP ) (n.º de cat. D111050) e IgG-HRP anti-conejo (n.º de cat. D110058) se adquirieron de BBI Life Sciences (Shanghai, China). Los anticuerpos contra la caspasa-3 (n.º de cat. E-AB-10050) y la caspasa activa-3 (n.º de cat. E-AB-22115) se compraron a Elabscience ( Wuhan, China). Otros anticuerpos contra caspasa-7 (n.º de cat. 9492), poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (n.º de cat. 9542), citocromo c (n.º de cat. AC909), c-Jun NH{ La {48}}quinasa terminal (JNK) (n.º de catálogo 9252S) y la actina (n.º de catálogo 58169) se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE. UU.). Todos los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron a 1:1,000. Los anticuerpos primarios se incubaron a 4 °C durante la noche y los anticuerpos secundarios se incubaron a 37 °C durante 1 hora.
Las proteínas diana se detectaron utilizando un kit de ensayo de quimioluminiscencia mejorado (Instituto de Biotecnología Beyotime), según el protocolo del fabricante.
Análisis estadístico. La significancia estadística se calculó mediante un análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de Tukey y los resultados se analizaron con el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) entre los grupos de tratamiento y control. Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar. PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa glucósidos feniletanoides(CTPG)
Resultados
CTPG‑W suprime el crecimiento de las células Eca‑109. Los componentes de CTPG-W fueron calificados y cuantificados por HPLC (Fig. 1), los cuales fueron comparados con los estándares de equinacósido y acteósido. Según los tiempos de retención de los picos y las áreas de los picos, CTPG-W contenía 39,16 por ciento de equinacósido y 2,44 por ciento de acteósido. En primer lugar, se determinó el efecto de CTPG-W sobre la viabilidad de las células Eca-109 con un ensayo MTT. CTPG-W se disolvió en DMSO a 200 mg/ml y se diluyó con medio RPMI-1640 que contenía 10 por ciento de FBS inactivado por calor a las concentraciones indicadas. Las células Eca-109 se trataron con CTPG-W y la viabilidad celular se analizó con un ensayo MTT en los puntos de tiempo indicados. El tratamiento con CTPG‑W redujo significativamente la viabilidad de las células Eca-109 de forma dependiente de la dosis y el tiempo (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG‑W induce la apoptosis en células Eca‑109. Para investigar si CTPG-W suprimía el crecimiento de células Eca-109 mediante la inducción de apoptosis o necrosis, las células se trataron con diferentes concentraciones de CTPG-W. Después de 24 h, la apoptosis y la necrosis de las células Eca-109 se detectaron con tinción de anexina V/PI. Como se representa en la Fig. 3A, las células con anexina V-/PI plus se seleccionaron como células necróticas, y las células con anexina V plus/PI plus y las células con anexina V plus/PI- se seleccionaron como células apoptóticas. CTPG-W indujo principalmente la apoptosis de las células Eca-109 de forma dependiente de la dosis, aunque las células Eca-109 necróticas también aumentaron significativamente con el tratamiento de 600 y 800 µg/ml de CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG‑W induce la detención del ciclo celular en la fase S en células Eca‑109. La alteración del ciclo celular del cáncer suprimirá el crecimiento celular y promoverá la apoptosis (27). La distribución del ciclo celular en células Eca-109 se detectó con tinción con PI después del tratamiento con CTPG-W durante 24 h. Se observó que las células en la fase S aumentaron y las células en las fases G0/G1 indicaron una disminución general significativa después del tratamiento con CTPG‑W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG-W disminuye Δψm e induce la liberación de citocromo c. La apoptosis puede ser inducida por una vía dependiente de mitocondrias (28,29). Los miembros pro y antiapoptóticos de la familia de proteínas BCL-2 cumplen funciones importantes en la regulación de la integridad de la membrana mitocondrial (30,31). Después del tratamiento con CTPG-W durante 24 h, se evaluó el Δψm mediante tinción con JC‑1. El agregado JC-1 (fluorescencia roja detectada en FL-2) se desintegrará en monómero (fluorescencia verde detectada en FL-1) cuando Δψm se reduce (32). Como se muestra en la Fig. 5A, las frecuencias de las células FL-1 plus FL-2-/ plus aumentaron significativamente de manera dependiente de la dosis, lo que indica que el Δψm de las células Eca‑109 disminuyó. Los cambios de fluorescencia en las células Eca-109 también se observaron con un microscopio de fluorescencia invertido (Fig. 5B). Con el aumento de las concentraciones de CTPG-W, la fluorescencia roja disminuyó y la fluorescencia verde aumentó, lo que es coherente con los datos de la citometría de flujo. También se observó que el nivel de citocromo c en el citosol aumentó notablemente (Fig. 5C), lo que es resultado de una reducción de Δψm. Esto refuerza la conclusión extraída del recuento aumentado de FL-1 más FL-2-/ más células de que Δψm disminuyó como resultado del tratamiento con CTPG-W. Se ha informado que JNK puede regular la activación de la familia de proteínas BCL-2 provocando la liberación de citocromo c (33-35). También se determinó que el nivel de JNK aumentó notablemente después del tratamiento con CTPG-W (Fig. 5C). Los resultados indicaron que CTPG-W puede inducir la apoptosis de las células Eca-109 a través de una vía dependiente de mitocondrias.
El efecto de CTPG-W en la generación de ROS intracelular. ROS podría reducir Δψm para inducir la apoptosis (36). Para investigar si CTPG-W puede aumentar la producción de ROS, se trataron células Eca-109 con diferentes concentraciones de CTPG-W. Las células se recolectaron en los puntos de tiempo indicados y se tiñeron con DCFH-DA. La producción de ROS intracelular en células Eca-109 se determinó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 6A, 800 µg/ml de CTPG-W aumentaron significativamente la producción de ROS desde 2-6h y disminuyeron desde 12-24 h. Además, 400 µg/ml de CTPG‑W aumentaron significativamente la producción de ROS de 12-24 h. Además, 200 µg/ml de CTPG-W no alteró notablemente la producción de ROS. Los cambios dinámicos de la producción de ROS pueden estar asociados con la apoptosis de las células Eca-109. También se determinó que CTPG-W tenía actividad depuradora de radicales libres (Fig. 6B), que puede estar asociada con la disminución de la producción de ROS en células Eca-109 tratadas con 800 µg/ml de CTPG-W después de 12 h.
CTPG‑W regula al alza la actividad de caspasa‑3, caspasa‑7, caspasa‑9 y PARP. La liberación de citocromo c debido a la reducción de Δψm podría activar las proteasas caspasa para inducir la apoptosis (29,30,37). Después del tratamiento con CTPG-W durante 24 h, se detectó la activación de caspasa-3, 7, 8, 9 y PARP mediante análisis de transferencia Western. En comparación con el control, los niveles de caspasa escindida-9, caspasa escindida-7, caspasa escindida-3 y PARP escindida, pero no los niveles de caspasa escindida{{ 20}}, fueron regulados al alza por el tratamiento con CTPG de una manera dependiente de la dosis (Fig. 7). Estos resultados indicaron que CTPG-W redujo Δψm y promovió la liberación de citocromo c para activar caspasas que inducen la apoptosis de las células Eca-109.
Extracto de Cistanche tubulosa
Discusión
La CHM tradicional podría inducir la apoptosis de las células de cáncer de esófago a través de diferentes vías, incluido el receptor de muerte extrínseco, las vías de estrés intrínsecas mitocondriales y del retículo endoplásmico (29). Nuestro estudio anterior demostró que CTPG, como componente principal de C. tubulosa, inhibía el crecimiento de células B16-F10 de melanoma a través de la inducción de apoptosis a través de una vía dependiente de mitocondrias (24). En el presente estudio, se investigó el efecto antitumoral de CTPG-W en las células Eca-109 y se determinó que CTPG-W suprimía el crecimiento de las células Eca-109, inducía la apoptosis y detenía el ciclo celular. redujo Δψm, aumentó la liberación de citocromo c y caspasas activadas. CTPG y CTPG-W podrían inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular en las células cancerosas. Sin embargo, los mecanismos exactos son diferentes debido a los diferentes componentes de CTPG (26,64 por ciento de equinacósido, 10,19 por ciento de acteósido y 1,71 por ciento de isoactósido) y CTPG-W (39,16 por ciento de equinacósido y 2,44 por ciento de acteósido). CTPG detuvo las células B16-F10 en las fases G0/G1, pero CTPG-W detuvo las células Eca-109 en la fase S (24). La producción de ROS aumentó de forma dependiente de la dosis con CTPG, pero indicó un cambio de manera dependiente del tiempo con una dosis alta de CTPG-W, que aumentó significativamente al comienzo del tratamiento con CTPG-W (2-6 h) y disminuyó significativamente después de 12 h, en comparación con el control. Una posible razón es que el componente principal de CTPG-W es el echinacósido. Varios estudios informaron que el equinacósido podría inhibir la producción de ROS y la apoptosis inducida por ROS para ejercer sus efectos neuroprotectores y antienvejecimiento (38-40). De manera similar, la actividad de eliminación de radicales libres se observó en el presente estudio. Por lo tanto, se especuló que algunos componentes, incluidos el verbascósido, el isoverbascósido y el salidrosido en una dosis alta de CTPG-W, podrían inducir inmediatamente la generación de ROS para causar la apoptosis de las células Eca-109 (41,42), y luego ROS fue eliminado por echinacoside. Otra posible razón de las diferencias en la producción de ROS por CTPG y CTPG-W es que se utilizaron diferentes líneas celulares en este estudio y en un estudio anterior (24). Dong et al (43) informaron que el equinacósido podría inducir la apoptosis de las células de cáncer colorrectal humano SW480 a través de la generación de daños oxidativos en el ADN sin aumentar los niveles de ROS.
El tratamiento con CTPG-W redujo el Δψm y provocó la liberación de citocromo c, que promueve la escisión de la caspasa-9 (28). Consistentemente, los niveles de caspasa escindida-9 aumentaron mediante el tratamiento con CTPG-W. Posteriormente, la caspasa activa-9 puede activar la caspasa-3 para inducir la apoptosis (44). Los niveles de caspasa escindida-3 también aumentaron mediante el tratamiento con CTPG-W. Sin embargo, CTPG-W no activó la caspasa-8, lo que indica que la vía del receptor de muerte extrínseca no estuvo involucrada en la apoptosis inducida por CTPG-W. Estas observaciones indican que CTPG-W induce la apoptosis de las células Eca-109 mediante la activación de una vía dependiente de mitocondrias.
PARP cumple funciones importantes en la estabilidad genómica y puede ser escindido por las caspasas activas, particularmente caspasa-3 y -7 (45). Se determinó que el tratamiento con CTPG-W activó la caspasa-3 y -7, que pueden escindir PARP para inhibir la reparación del ADN y causar apoptosis.
CTPG-W también suprime, de forma dependiente de la dosis y el tiempo, el crecimiento de células BEL-7404 de carcinoma hepatocelular humano (datos no publicados). Aunque CTPG-W inhibe el crecimiento de las células Eca-109 y BEL-7404, promueve la proliferación de esplenocitos, lo que puede deberse al contenido de polisacáridos (~50 por ciento) en CTPG-W (46 ). De manera similar, varios estudios han informado que los polisacáridos pueden promover la proliferación de esplenocitos (46-49). En el modelo de ratón, se determinó que CTPG-W aumentó significativamente el índice del bazo, en comparación con el grupo de control, pero no afectó el peso corporal ni los índices de otros órganos, incluidos el corazón, el hígado, los riñones y los pulmones (datos no publicados). lo que indica que CTPG-W no tiene efecto citotóxico en las células normales.
En conjunto, los datos indicaron que CTPG-W inhibe el crecimiento de las células Eca-109 mediante la inducción de la apoptosis a través de una vía dependiente de la mitocondria.
beneficios de la cistanche: anti-apoptosis
Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer al Dr. Jianhua Yang (Baylor College of Medicine) por pulir el manuscrito.
Fondos
Este estudio fue apoyado por el 13.º Plan quinquenal para el proyecto de licitación de biología de disciplinas clave (subvención n.º 17SDKD0202), la Universidad Normal de Xinjiang y el Laboratorio clave de aplicación y regulación de la biodiversidad ambiental especial en Xinjiang (subvención n.º XJTSWZ-2017-04) a JL y la subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.° 31760260) a XW.
Disponibilidad de datos y materiales.
Los datos y materiales utilizados y analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.
Contribuciones de los autores
CF, AA, YY y QC realizaron los experimentos. LX, JLv y XW analizaron los datos y las cifras preparadas. JinyuL y JinyaoL diseñaron el proyecto y escribieron el manuscrito.
Aprobación ética y consentimiento para participar
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos con Animales del Laboratorio Clave de Recursos Biológicos e Ingeniería Genética de Xinjiang (aprobación, no. BRGE-AE001; Universidad de Xinjiang).
Consentimiento del paciente para la publicación
No aplica.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Referencias
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