Los glucósidos feniletanoides de Cistanche Tubulosa inducen la apoptosis en células Eca-109 a través de la vía dependiente de mitocondrias

Introducción

El cáncer de esófago es uno de los tipos de cáncer más comunes, con la undécima tasa de morbilidad más alta y la sexta tasa de mortalidad más alta a nivel mundial, y causó ~439,{3}} muertes en 2015. La incidencia del cáncer de esófago varía notablemente entre las diferentes regiones, siendo la oriental Asia y África oriental y meridional exhibieron las tasas más altas de incidencia y África occidental exhibió las tasas más bajas en 2012. En China, los casos y mortalidades estimados por cáncer de esófago fueron 477,000 y 375,000, respectivamente. , en 2015. Aunque la tasa de morbilidad del cáncer de esófago ha disminuido en los países de índice sociodemográfico medio y medio alto entre 2005 y 2015, la tasa de mortalidad sigue siendo alta debido al mal pronóstico. La combinación de resección quirúrgica con quimioterapia o radioterapia se ha utilizado para tratar el cáncer de esófago, sin embargo, se ha reportado que entre 2003 y 2014 la tasa de supervivencia de 5-años se mantuvo<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studydemostró queGlucósidos feniletanoides de Cistanche tubulosa(CTPG) podría suprimir el crecimiento de células de melanoma B16-F10 in vitro e in vivo (24). Sin embargo, la escasa solubilidad en agua del CTPG utilizado anteriormente limita el desarrollo del fármaco. Por lo tanto, se utilizó CTPG soluble en agua (CTPG-W) y se investigó el efecto antitumoral sobre las células de cáncer de esófago (Eca-109). Se determinó que CTPG-W podría inhibir de forma dependiente de la dosis la viabilidad de las células Eca-109 mediante la inducción de apoptosis a través de una vía dependiente de mitocondrias.

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Materiales y métodos

Animales.

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 (6-8 semanas, ~25 g) del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de Beijing (Beijing, China) y se alojaron en un recipiente con temperatura controlada (25˚C) y ciclo de luz (12/ 12) Animalario de la Universidad de Xinjiang (Urumqi, China). Todos los animales recibieron agua y alimento libres de patógenos.

Línea celular y cultivo.

La línea celular de carcinoma de esófago humano (Eca-109) fue preservada por el Laboratorio Clave de Recursos Biológicos e Ingeniería Genética de Xinjiang (Facultad de Ciencias y Tecnología de la Vida, Universidad de Xinjiang, Urumqi, China) y cultivada en RPMI{{1} } medio (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1% L -glutamina (100 mM), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37˚C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

CTPG-W (n.º de catálogo SGJG20170410) se adquirió de Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, China). Los principales compuestos de CTPG se calificaron y cuantificaron mediante HPLC según nuestro estudio anterior (24). Brevemente, la HPLC se realizó en una columna ZORBAX SB‑C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) a 30 ˚C y se eluyó con una solución de ácido fórmico al 0,2 % y un gradiente de metanol comenzando en el 23 %, mientras se agregaba 1 ml cada minuto. durante 45 min hasta alcanzar el 31%. Se inyectó un total de 10 µl de muestra y se detectó a 330 nm. El estándar de equinacósido se adquirió de Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) y el estándar de acteósido se adquirió de Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Los estándares se utilizaron para analizar los componentes de CTPG-W.

Ensayo MTT.

La proliferación celular se midió con un ensayo MTT. Se inocularon células Eca{{0}} en 96-placas de pocillos a una densidad de 5x103 células en 100 µl de RPMI{{5 }} medio/pocillo y se cultivó a 37˚C durante 24 h, luego se trató con diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600 y 800 µg/ml) de CTPG-W o 0,4% de dimetilsulfóxido (DMSO) durante 24, 48 y 72h. Se usó DMSO como control de disolvente (800 µg/ml de CTPG-W que contenía DMSO al 0,4%). Se utilizó cisplatino (20 µg/ml) como control positivo. Posteriormente, el sobrenadante se descartó tras la centrifugación a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente y se añadieron a cada pocillo 100 µl de solución de MTT (0,5 mg/ml en medio RPMI-1640 sin FBS) y se incubó a 37˚C durante 3 h. Los cristales de formazán formados se disolvieron en 200 µl de DMSO. Los valores de densidad óptica (OD) se midieron a una longitud de onda de 490 nm mediante un lector de microplacas 96-pocillos (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.). La viabilidad celular relativa se calculó según la fórmula: Viabilidad celular (%)=(OD tratada/OD no tratada) x 100 %. La morfología de las células Eca-109 se observó con un microscopio de fluorescencia invertido (aumento, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokio, Japón).

Para la proliferación de esplenocitos, se sacrificaron ratones C57BL/6 mediante dislocación cervical y se aislaron los bazos. Se preparó la suspensión unicelular y se sembraron esplenocitos en placas de 96-pocillos a una densidad de 1x105 células/pocillo en 100 µl de medio RPMI-1640 y luego se trataron con diferentes concentraciones. (0, 200, 400, 600 y 800 µg/ml) de CTPG-W durante 24, 48 y 72 h a 37˚C con 5% de CO2. La proliferación de esplenocitos se midió mediante ensayo MTT, según el protocolo antes mencionado. Índice de estimulación=OD tratado/OD no tratado.

Medición de la apoptosis y del ciclo celular. Se cultivaron células Eca{{0}} en placas de 60 mm a una densidad de 2,5x105 células/placa durante 24 h y se trataron con diferentes concentraciones ({{31} }, 200, 400, 600 y 800 µg/ml) de CTPG-W o DMSO al 0,4% durante 24 h a 37˚C con 5% de CO2. Las células se recogieron y se tiñeron con un kit de detección de apoptosis de isotiocianato de fluoresceína de anexina V (FITC) / yoduro de propidio (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las muestras se recolectaron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) y se analizaron con FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EE. UU.). Para analizar el efecto de CTPG-W en el ciclo celular, se sembraron 2,5x105 células Eca-109 en placas de cultivo de 60 mm y se trataron con CTPG-W (0, 100, 200 y 400 µg/ml) o 0,4 % DMSO durante 24 h a 37˚C con 5% CO2. Todas las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS helado (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), luego se fijaron en etanol al 70% helado a 4 ° C durante 30 minutos. Después de lavar dos veces con PBS enfriado con hielo, las células se resuspendieron en 300 µl de tampón de tinción PI/RNasa (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La distribución del ciclo celular se analizó con el software ModFit LT 3.0 mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur).

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Análisis del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) y especies reactivas de oxígeno (ROS).Para analizar el Δψm, las células Eca{{0}} se trataron con CTPG-W (0, 400, 600 y 800 µg/ml) o DMSO al 0,4% para 24 h a 37˚C con 5% CO2, y teñido con el kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), según protocolo del fabricante, durante 20 min a 37˚ C. Después de lavar dos veces con tampón de lavado JC-1 (Instituto Beyotime de Biotecnología), las muestras se resuspendieron con 300 µl de tampón de lavado JC-1 y se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur). La fluorescencia del tinte JC-1 en células Eca-109 también se observó con un microscopio de fluorescencia invertido (aumento, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Para el análisis de ROS, las células Eca-109 se trataron con CTPG-W (0, 400, 600 y 800 µg/ml) durante 2, 4, 6, 12 y 24 h, y se tiñeron con el ensayo de especies reactivas de oxígeno. kit (Beyotime Institute of Biotechnology), según protocolo del fabricante, durante 20 min a 37˚C. Después de lavar tres veces con PBS helado, las muestras se recogieron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur) y se analizaron mediante el software FlowJo 7.6.

Figura 1. El control calificado de CTPG-W. Los componentes de CTPG-W se analizaron cualitativa y cuantitativamente mediante cromatografía líquida de alta resolución y se compararon con los estándares de equinacósido y acteósido. CTPG-W, glucósidos feniletanoides solubles en agua deC. Tubulosa.

Actividad eliminadora de radicales 2,2‑difenil‑1‑picrilhidrazilo (DPPH). La actividad eliminadora de radicales libres de CTPG-W se determinó con un ensayo de radicales libres DPPH de acuerdo con el protocolo publicado con una modificación menor, ya que el metanol se sustituyó por etanol para disolver el DPPH (25, 26). Para mediciones en estado estacionario, se mezclaron 150 µl de DPPH (100 mmol/l) en etanol con diferentes concentraciones de CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 y 600 µg/ml) en 50 µl de PBS, y se incubaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. La absorbancia a 517 nm se detectó en presencia y ausencia de CTPG-W. Se utilizó un total de 50 µl de vitamina C como control positivo. La actividad eliminadora de radicales DPPH se calculó utilizando la fórmula: Eliminación (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, donde Ablank es la absorbancia del control (sin DPPH), Asample es la absorbancia de la muestra y A0 es la absorbancia de PBS con DPPH.

Análisis de Western Blot. Las células Eca{{0}} se trataron con CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) o DMSO al 0,4% durante 24 h a 37˚C con 5% de CO2. El siguiente lavado dos veces con PBS, células 

Figura 2. El efecto de CTPG-W sobre el crecimiento de células Eca-109 y esplenocitos. (A) Las células Eca-109 se trataron con diferentes concentraciones de CTPG-W durante 24, 48 y 72 h, y luego se detectó la viabilidad celular con un ensayo MTT. (B) Los cambios morfológicos de las células Eca-109 tras el tratamiento con CTPG-W a las 24 h. (C) Se trataron esplenocitos de ratones C57BL/6 con diferentes concentraciones de CTPG-W durante 24, 48 y 72 h, y luego se analizó la proliferación con un ensayo MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulosa.

Se lisaron en tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China) durante 20 minutos en hielo. Después de la centrifugación a 10,000 xg durante 10 min a 4˚C, se recogieron los sobrenadantes y se detectaron las concentraciones de proteínas con un kit de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific, Inc.) según los protocolos del fabricante. El análisis de transferencia Western se realizó de acuerdo con nuestra descripción anterior (24). Los anticuerpos contra caspasa-7 (cat. no. D120077), caspasa-8 (cat. no. D155240), caspasa-9 (cat. no. D220078), linfoma de células B{ {13}} (Bcl-2) asociado a X (Bax) (n.º de cat. D220073) y Bcl-2 (n.º de cat. D260117) y peroxidasa de rábano picante anti-IgG de ratón (HRP ) (n.º de cat. D111050) y IgG-HRP anti-conejo (n.º de cat. D110058) se adquirieron de BBI Life Sciences (Shanghai, China). Los anticuerpos contra caspasa-3 (cat. no. E-AB-10050) y caspasa activa-3 (cat. no. E-AB-22115) se compraron de Elabscience ( Wuhan, China). Otros anticuerpos contra caspasa-7 (n.º de cat. 9492), poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (n.º de cat. 9542), citocromo c (n.º de cat. AC909), c-Jun NH{ {37}}quinasa terminal (JNK) (n.º de catálogo 9252S) y actina (n.º de catálogo 58169) se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE. UU.). Todos los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron a 1:1,000. Los anticuerpos primarios se incubaron a 4ºC durante la noche y los anticuerpos secundarios se incubaron a 37ºC durante 1 h.

Figura 3. La apoptosis de las células Eca-109 inducida por CTPG-W. Las células se trataron con diferentes concentraciones de CTPG-W durante 24 h. (A) Las células Eca-109 apoptóticas y necróticas se analizaron mediante citometría de flujo. El panel superior muestra los diagramas de puntos individuales y el panel inferior muestra los datos resumidos. * PAG<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulosa.

Las proteínas diana se detectaron utilizando un kit de ensayo de quimioluminiscencia mejorado (Beyotime Institute of Biotechnology), según el protocolo del fabricante.

Análisis estadístico. La significación estadística se calculó mediante un análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de Tukey y los resultados se analizaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) entre los grupos de tratamiento y control. Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar. PAG<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

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Resultados

CTPG-W suprime el crecimiento de células Eca-109.

Los componentes de CTPG-W fueron calificados y cuantificados mediante HPLC (Fig. 1), que se compararon con los estándares de equinacósido y acteósido. Según los tiempos de retención de los picos y las áreas de los picos, CTPG-W contenía un 39,16% de equinacósido y un 2,44% de acteósido. En primer lugar, se determinó el efecto de CTPG-W sobre la viabilidad de las células Eca-109 con un ensayo MTT. CTPG-W se disolvió en DMSO a 200 mg/ml y se diluyó con medio RPMI-1640 que contenía 10 % de FBS inactivado por calor hasta las concentraciones indicadas. Las células Eca-109 se trataron con CTPG-W y la viabilidad celular se analizó con un ensayo MTT en los momentos indicados. El tratamiento con CTPG-W redujo significativamente la viabilidad de las células Eca-109 de manera dependiente de la dosis y el tiempo (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Figura 4. El efecto de CTPG-W en la distribución del ciclo celular en células Eca-109. Se usaron diferentes concentraciones de CTPG-W para tratar células Eca-109 durante 24 h y la distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. * PAG<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulosa.

CTPG-W induce apoptosis en células Eca-109. Para investigar si CTPG-W suprimió el crecimiento de células Eca-109 mediante la inducción de apoptosis o necrosis, las células se trataron con diferentes concentraciones de CTPG-W. Después de 24 h, se detectó la apoptosis y necrosis de las células Eca-109 con tinción con anexina V/PI. Como se muestra en la Fig. 3A, las células de Anexina V-/PI+ se seleccionaron como células necróticas, y las células de Anexina V+/PI+ y Anexina V+/PI- se seleccionaron como células apoptóticas. CTPG-W indujo principalmente la apoptosis de las células Eca-109 de manera dosis dependiente, aunque las células necróticas Eca-109 también aumentaron significativamente bajo el tratamiento de 600 y 800 µg/ml de CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W induce la detención del ciclo celular en la fase S en células Eca-109. La alteración del ciclo celular canceroso suprimirá el crecimiento celular y promoverá la apoptosis (27). La distribución del ciclo celular en células Eca-109 se detectó con tinción con PI después del tratamiento con CTPG-W durante 24 h. Se observó que las células en la fase S aumentaron y las células en las fases G0/G1 indicaron una disminución general significativa tras el tratamiento con CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W disminuye Δψm e induce la liberación de citocromo c. La apoptosis puede inducirse mediante una vía dependiente de mitocondrias (28,29). Los miembros pro y antiapoptóticos de la familia de proteínas BCL-2 cumplen funciones importantes en la regulación de la integridad de la membrana mitocondrial (30,31). Después del tratamiento con CTPG-W durante 24 h, se evaluó el Δψm mediante tinción con JC-1. El agregado JC-1 (fluorescencia roja detectada en FL-2) se desintegrará en monómero (fluorescencia verde detectada en FL-1) cuando Δψm se reduzca (32). Como se muestra en la Fig. 5A, las frecuencias de las células FL-1+ FL-2-/+ aumentaron significativamente de manera dependiente de la dosis, lo que indica que el Δψm de las células Eca-109 disminuyó. Los cambios de fluorescencia en las células Eca-109 también se observaron con un microscopio de fluorescencia invertido (Fig. 5B). Con el aumento de las concentraciones de CTPG-W, la fluorescencia roja disminuyó y la fluorescencia verde aumentó, lo que concuerda con los datos de la citometría de flujo. También se observó que el nivel de citocromo c en el citosol aumentaba notablemente (Fig. 5C), lo que es resultado de una reducción de Δψm. Esto refuerza la conclusión extraída del aumento del recuento de células FL-1+ FL-2-/+ de que Δψm disminuyó como resultado del tratamiento con CTPG-W. Se ha informado que JNK puede regular la activación de la familia de proteínas BCL-2 provocando la liberación del citocromo c (33-35). También se determinó que el nivel de JNK aumentó notablemente después del tratamiento con CTPG-W (Fig. 5C). Los resultados indicaron que CTPG-W puede inducir la apoptosis de las células Eca-109 a través de una vía dependiente de mitocondrias.

Figura 5. La reducción de Δψm y la regulación positiva del citocromo c y JNK. Las células Eca-109 se trataron con diferentes concentraciones de CTPG-W durante 24 h. (A) Δψm se detectó mediante tinción con JC-1 y las muestras se analizaron mediante citometría de flujo. Los diagramas de puntos individuales representan los cambios en la fluorescencia de JC-1. Las frecuencias de las células FL-1+ FL-2-/+ se representan en el panel inferior. ***PAG<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Figura 6. Los niveles de ROS en las células Eca-109 tras el tratamiento con CTPG-W y la actividad antioxidante de CTPG-W. (A) Las células Eca-109 se trataron con diferentes concentraciones de CTPG-W y los niveles de ROS se analizaron mediante citometría de flujo en los puntos temporales indicados. * PAG<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

El efecto de CTPG-W sobre la generación de ROS intracelular.ROS podría reducir Δψm para inducir la apoptosis (36). Para investigar si CTPG-W puede aumentar la producción de ROS, se trataron células Eca-109 con diferentes concentraciones de CTPG-W. Las células se recogieron en los momentos indicados y se tiñeron con DCFH-DA. La producción de ROS intracelular en células Eca-109 se determinó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 6A, 800 µg/ml de CTPG-W aumentaron significativamente la producción de ROS desde las 2-6 h, y disminuyeron desde las 12-24 h. Además, 400 µg/ml de CTPG-W aumentaron significativamente la producción de ROS desde las 12-24 h. Además, 200 µg/ml de CTPG-W no alteraron notablemente la producción de ROS. Los cambios dinámicos en la producción de ROS pueden estar asociados con la apoptosis de las células Eca-109. También se determinó que CTPG-W tenía actividad eliminadora de radicales libres (Fig. 6B), lo que puede estar asociado con la disminución de la producción de ROS en células Eca-109 tratadas con 800 µg/ml de CTPG-W después de 12 h.

Figura 7. Los niveles de caspasas escindidas y PARP escindidas después del tratamiento con CTPG-W. Se aislaron proteínas de células Eca-109 tratadas con CTPG-W durante 24 h y los niveles de caspasas escindidas y PARP escindidas se detectaron mediante análisis de transferencia Western. DMSO, dimetilsulfóxido; CTPG-W, glucósidos feniletanoides solubles en agua deC. Tubulosa; PARP, poli (ADP-ribosa) polimerasa.

CTPG-W regula positivamente la actividad de caspasa-3, caspasa-7, caspasa-9 y PARP. La liberación de citocromo c debido a la reducción de Δψm podría activar las proteasas caspasas para inducir la apoptosis (29,30,37). Después del tratamiento con CTPG-W durante 24 h, se detectó mediante análisis de transferencia Western la activación de caspasa-3, 7, 8, 9 y PARP. En comparación con el control, los niveles de caspasa escindida-9, caspasa escindida-7, caspasa escindida-3 y PARP escindida, pero no los niveles de caspasa escindida{{20 }}, fueron regulados positivamente por el tratamiento con CTPG de manera dependiente de la dosis (Fig. 7). Estos resultados indicaron que CTPG-W redujo Δψm y promovió la liberación de citocromo c para activar las caspasas que inducen la apoptosis de las células Eca-109.

Discusión

Las CHM tradicionales podrían inducir la apoptosis de células cancerosas de esófago a través de diferentes vías, incluido el receptor de muerte extrínseco y las vías de estrés intrínsecas del retículo endoplásmico y mitocondrial (29). Nuestro estudio anterior demostró que CTPG, como componente principal de C. tubulosa, inhibía el crecimiento de células de melanoma B16-F10 mediante la inducción de apoptosis a través de una vía dependiente de mitocondrias (24). En el presente estudio, se investigó el efecto antitumoral de CTPG-W en las células Eca-109 y se determinó que CTPG-W suprimió el crecimiento de las células Eca-109, indujo la apoptosis y detuvo el ciclo celular. redujo Δψm, aumentó la liberación de citocromo c y activó caspasas. CTPG y CTPG-W podrían inducir apoptosis y detención del ciclo celular en células cancerosas. Sin embargo, los mecanismos precisos son diferentes debido a los diferentes componentes de CTPG (26,64% de echinacósido, 10,19% de acteósido y 1,71% de isoacteósido) y CTPG-W (39,16% de equinacósido y 2,44% de acteósido). CTPG detuvo las células B16-F10 en las fases G0/G1, pero CTPG-W detuvo las células Eca-109 en la fase S (24). La producción de ROS aumentó de manera dependiente de la dosis con CTPG, pero indicó un cambio de manera dependiente del tiempo con una dosis alta de CTPG-W, que aumentó significativamente al comienzo del tratamiento con CTPG-W (2-6 h) y disminuyó significativamente después de 12 h, en comparación con el control. Una posible razón es que el componente principal de CTPG-W es el equinacósido. Varios estudios informaron que el equinacósido podría inhibir la producción de ROS y la apoptosis inducida por ROS para ejercer sus efectos neuroprotectores y antienvejecimiento (38-40). De manera similar, en el presente estudio se observó la actividad eliminadora de radicales libres. Por lo tanto, se especuló que algunos componentes, incluidos el verbascósido, el isoverbascósido y el salidrosido en una dosis alta de CTPG-W podrían inducir inmediatamente la generación de ROS para causar la apoptosis de las células Eca-109 (41,42), y luego ROS fue eliminado por echinacósido. Otra posible razón de las diferencias en la producción de ROS por CTPG y CTPG-W es que se utilizaron líneas celulares diferentes en este estudio y en el estudio anterior (24). Dong et al (43) informaron que el equinacósido podría inducir la apoptosis de células de cáncer colorrectal humano SW480 mediante la generación de daño oxidativo en el ADN sin aumentar los niveles de ROS.

El tratamiento con CTPG-W redujo Δψm y provocó la liberación de citocromo c, que promueve la escisión de caspasa-9 (28). Consistentemente, los niveles de caspasa escindida-9 aumentaron con el tratamiento con CTPG-W. Posteriormente, la caspasa activa-9 puede activar la caspasa-3 para inducir la apoptosis (44). Los niveles de caspasa escindida-3 también aumentaron con el tratamiento con CTPG-W. Sin embargo, la caspasa -8 no fue activada por CTPG-W, lo que indica que la vía del receptor de muerte extrínseca no estuvo involucrada en la apoptosis inducida por CTPG-W. Estas observaciones indican que CTPG-W induce la apoptosis de las células Eca-109 mediante la activación de una vía dependiente de mitocondrias.

PARP desempeña funciones importantes en la estabilidad genómica y puede ser escindida por las caspasas activas, en particular las caspasas-3 y -7 (45). Se determinó que el tratamiento con CTPG-W activaba las caspasas-3 y -7, que pueden escindir PARP para inhibir la reparación del ADN y causar apoptosis.

CTPG-W también suprime, de forma dependiente de la dosis y el tiempo, el crecimiento de células BEL-7404 del carcinoma hepatocelular humano (datos no publicados). Aunque CTPG-W inhibe el crecimiento de las células Eca-109 y BEL-7404, promueve la proliferación de esplenocitos, lo que puede deberse al contenido de polisacáridos (~50%) en CTPG-W (46 ). De manera similar, varios estudios han informado que los polisacáridos pueden promover la proliferación de esplenocitos (46-49). En el modelo de ratón, se determinó que CTPG-W aumentó significativamente el índice del bazo, en comparación con el grupo de control, pero no afectó el peso corporal ni los índices de otros órganos, incluidos el corazón, el hígado, los riñones y los pulmones (datos no publicados). lo que indica que CTPG-W no tiene ningún efecto citotóxico sobre las células normales.

En conjunto, los datos indicaron que CTPG-W inhibe el crecimiento de células Eca-109 mediante la inducción de apoptosis a través de una vía dependiente de mitocondrias.

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