Cistanche tubulosa protege las neuronas dopaminérgicas mediante la regulación de la apoptosis y el factor neurotrófico derivado de células gliales: in vivo e in vitro
Mar 07, 2023
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa con el sello patológico de dopamina nigroestriatal reducida. En la práctica clínica de la medicina tradicional china (MTC), el nanopolvo de Cistanche tubulosa tiene efectos terapéuticos sobre la EP. Para identificar el mecanismo terapéutico, este estudio probó el efecto protector de diferentes dosis de MPP más toxicidad inducida en células MES23.5 utilizando el ensayo MTT y en el 1-metil-4-fenilo-1 Ratones PD inducidos por ,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (vehículos). Se utilizó inmunohistoquímica para evaluar la citomorfología y la expresión de tirosina hidroxilasa (TH). Se utilizaron pruebas de comportamiento en vehículos, pruebas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en dopamina, inmunohistoquímica y análisis de western blot para detectar la expresión de TH, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) y sus receptores. Nuestros resultados demostraron que el nanopolvo de cistanche tubulosa mejoró la viabilidad de las células tratadas con MPP plus, aumentó la expresión de TH y redujo el número de células apoptóticas. También aumentó la expresión de la proteína Bcl2 y suprimió la expresión de la proteína Bax en células tratadas con MPP plus de forma dependiente de la dosis.
Además,cistanchetubulosa nanopolvo mejoró los déficits de comportamiento en ratones vehículo, redujo la duración estacionaria de la natación, mejoró la capacidad de actividad espontánea y aumentó la expresión de GDNF, el receptor alfa de la familia GDNF (GFR 1) y Ret en células de la sustancia negra ( SN).
Además, la expresión proteica de GDNF, GFR 1 y Ret aumentó después del tratamiento con diferentes dosis decistanchetubulosa nanopolvo, con una diferencia significativa entre los grupos de dosis alta y vehículo. La expresión proteica de Bcl2 y Bax fue similar in vivo e in vitro, lo que sugirió quecistanchetubulosa nanopolvo tiene efectos antiapoptóticos en las neuronas.
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Introducción
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa común que ocurre en personas mayores con manifestaciones patológicas de pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra (SN) debido a la degeneración. La gravedad de la enfermedad se correlaciona con la pérdida de células neuronales de dopamina (DA) en el SN, lo que es consistente con la opinión de que el proceso neurodegenerativo progresa durante muchos años antes de que aparezcan los síntomas (Sawle y Myers, 1993). La naturaleza progresiva de la enfermedad sugiere interesantes posibilidades de intervención terapéutica mediante el bloqueo del proceso neurodegenerativo subyacente. La búsqueda de acciones potentes y específicas inducidas por la terapia de factores neurotróficos sobre la supervivencia de las neuronas DA es, por lo tanto, de considerable interés.
Los factores neurotróficos son proteínas esenciales, incluido el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y el factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), que promueven el crecimiento nervioso, el desarrollo neurológico, la guía axonal y la función neuronal. Entre todos los factores neurotróficos que protegen y promueven la reparación de las neuronas dopaminérgicas, el GDNF tiene los efectos más fuertes (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Se ha demostrado que el GDNF posee efectos neurotróficos potentes sobre las neuronas DA in vitro (Lin et al., 1993) y que ejerce efectos neuroprotectores in vivo. Se ha demostrado que el GDNF rescata las neuronas DA nigrales de la muerte celular inducida por lesiones después de una axotomía quirúrgica o inducida por toxinas en ratas (Beck et al., 1995; Kearns y Gash, 1995; Sauer et al., 1995) y parcialmente también después de administración sistémica de N-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) en ratones (Tomac et al., 1995). La mayor incidencia de apoptosis neuronal y la reducción de los efectos protectores de los factores neurotróficos, potencialmente desencadenados por varios factores patológicos, subyacen a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (Holden et al., 2006).
cistanchetubulosa es un medicamento a base de hierbas procedente de varias plantas del género Cistanche. Es una opción terapéutica importante para el síndrome de deficiencia renal que está estrechamente relacionado con las hormonas andrógenas en la medicina tradicional china (MTC). Hasta la fecha, muchas investigaciones clínicas y básicas sobrecistanchetubulosa han demostrado las actividades de las enfermedades neurodegenerativas. La identificación de prescripciones de tonificación renal de la MTC en el tratamiento de la EP puede proporcionar un tratamiento clínico alternativo para la EP. El echinacósido (ECH) es un componente bioactivo importante que se encuentra en la hierba medicinalcistanchetubulosa. Los estudios han demostrado los efectos terapéuticos de los glucósidos de Cistanche y ECH, verbascósido (VER) e icariina (ICA) en pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA), EP y otros pacientes con demencia vascular (Urano y Tohda, 2010; Wang et al., 2013). ; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) sugirió que la cistanche. extractos de tubulosa que contenían suficiente ECH y acteoside mejoraron la disfunción cognitiva causada por A -42 mediante el bloqueo de la deposición de amiloide y la reversión de la función neuronal colinérgica y dopaminérgica del hipocampo. Tao et al. (2015) encontraron que los glucósidos feniletanoides de cistanche tubulosa (Ph Gs-Ct) prevenían el edema cerebral de gran altitud al disminuir la expresión de proteína y ARNm de AQP4 en el tejido cerebral de modelos de rata.
Estudios anteriores han demostrado que los compuestos herbales chinos, incluidos los tres ingredientes decistanchetubulosa, epimedium y rizoma poligonal, aliviaron el daño a las neuronas dopaminérgicas y aumentaron los niveles de dopamina al regular la expresión de factores neurotróficos (Wu et al., 2013).
Por lo tanto, aún no se sabe si elcistancheLos efectos neuroprotectores inducidos por tubulosa son duraderos y en qué medida el rescate de las neuronas DA nigrales mediante la administración de GDNF puede permitir una preservación significativa de los comportamientos motores de relevancia para la sintomatología de los animales con EP. Este estudio usó una receta tonificante del riñón de la MTC,cistanchetubulosa nanopolvo, que ha recibido una patente nacional (número de patente: 2011103028541) en China y ha demostrado previamente un cierto efecto terapéutico en la EP. El presente estudio, por lo tanto, fue diseñado para examinar los efectos neuroprotectores y regeneradores decistanchetubulosa y para investigar la apoptosis en las células MES23.5 y ratas definitivas de comportamiento, y la regulación de GDNF, según lo medido por una batería de pruebas objetivo.
Materiales y métodos
Materiales, reactivos y equipos
cistanchetubulosa se adquirió de Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, China. ECH, VER e ICA provienen de los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos de China. La línea de células neuronales dopaminérgicas MES23.5 fue un obsequio del profesor Biao Chen, Laboratorio de Neurobiología, Universidad Médica Capital, Beijing, China. Se compraron cincuenta ratones macho C57BL/6 (con un peso de 20 a 25 g cada uno) de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (número de licencia: SCXK2012-0002), Shanghai, China.
MPP plus, MTT y glutamina se adquirieron de Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EE. UU.); El medio DMEM/F12 y el suero bovino fetal se adquirieron de Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.); y MPTP, estándar DA y estándar de ácido homovanílico (HVA) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EE. UU.). -Actina, Bax, Bcl2, GDNF, receptor alfa de la familia GDNF (GFR 1) y anticuerpos Ret se adquirieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, EE. UU.); El kit de reactivos de tinción de 3,3'-diaminobencidina (DAB) se adquirió de Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, China); y el kit de preparación de muestras de gel SDS-PAGE, el kit de detección de quimioluminiscencia mejorada ultrasensible (ECL) y el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) se compraron del Instituto de Biotecnología Beyotime (Beijing, China).
Este estudio utilizó los siguientes instrumentos: lector de microplacas ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, EE. UU.); incubadora de CO2 (Heraeus, Hanau, Alemania); Sistema de análisis de imágenes de gel Gel DOC 2000, celda de electroforesis y tanque de electroforesis (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.); analizador de proteínas DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE. UU.); centrífuga refrigerada de alta velocidad 5417R (Eppendorf, Hamburgo, Alemania); molino de bolas planetario dual SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); molino mezclador MM400 (Retsch GmbH, Haan, Alemania); cromatografía líquida de alta resolución Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.); electroforesis PowerPac Basic, sistema de transferencia transmembrana PowerPac Basic, generador de imágenes por quimioluminiscencia Universal Hood II, sistema de transcripción inversa de ARN S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad); Sistema de análisis de imágenes de células y tejidos Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).
Preparación decistanchenanopolvo tubulosa
cistanchetubulosa fue pesada, luego purificada y deshidratada. Después de la pulverización convencional,cistancheel polvo fino de tubulosa se pasó a través de un 200-tamiz de malla y se liofilizó. Se utilizó un molino de bolas de alta energía y vacío con control de temperatura para preparar elcistanchenanopolvo de tubulosa. Primero, crudocistancheEl nanopolvo de tubulosa se colocó en un tanque de molienda de bolas al vacío que se cargó con bolas de molienda de carburo. La relación entre las bolas de molienda y el nanopolvo de cistanche tubulosa osciló entre 15:1 y 5:1. Para obtener un polvo fino, la velocidad y la duración del molino de bolas de alta energía se ajustaron a 300 rpm y 20 min, respectivamente. El polvo fino se pesó para el procesamiento de materiales a nanoescala y se procesó en el molino mezclador con una frecuencia de 25/s y oscilación de los 20s por tres repeticiones. Se usó PBS para disolver y preparar una solución madre de 25 mg/mL, seguido de 30 min de ultrasonicación, esterilización en autoclave y finalmente almacenamiento a -20 grados.
Control de Calidad de los Componentes Activos decistanchetubulosa por HPLC
El ECH y el VER contenían elución en gradiente con sílice enlazada con octadecilsilano como relleno, metanol como fase móvil A y solución de ácido fórmico al 0,1 por ciento como fase móvil B. La longitud de onda de detección fue de 330 nm. El ICA contenía un gradiente de elución con sílice unida con octadecilsilano como relleno y acetonitrilo-agua (30:70) como fase móvil. La longitud de onda de detección fue de 270 nm. La muestra, el control y el control negativo se midieron como 10 μL cada uno para la prueba.
Ensayo de cultivo celular y MTT para medir la viabilidad de células tratadas con MPP plus
Se inocularon células MES23.5 con suero de ternero fetal al 5 %, glutamina al 1 %, solución de Sato 50x al 2 % y medio DMEM/F12 con penicilina/estreptomicina al 2 %. Se incubaron a 37 grados en una incubadora de CO2 al 5 por ciento con humedad saturada. Las células se aislaron y se pasaron con tripsina al 0,25 por ciento y la suspensión celular se recogió en la fase de crecimiento logarítmico. Se sembraron células aisladas con una densidad de 1 × 105 en placas de pocillos recubiertas con polilisina 96-, seguido de la adición de diferentes concentraciones finales (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 μmol/ L) de MPP más medios. Las células MES23.5 que se incubaron con medio de cultivo normal durante 24 h y 48 h se usaron como controles negativos en los experimentos in vitro. Las células de los diferentes grupos de tratamiento se incubaron con reactivo MTT durante 4 h. Posteriormente se descartó la solución de los pocillos y se añadieron 150 μL de DMSO y se osciló durante 10 min. La absorbancia de cada muestra a una longitud de onda de 570 nm se midió utilizando un lector automático de microplacas. El porcentaje de viabilidad celular (porcentaje)=absorbancia media del grupo experimental/absorbancia media del grupo de control negativo × 100 por ciento.
Se agregaron concentraciones relevantes de MPP más medio para el tratamiento de 24 h en células MES23.5 usando el mismo enfoque que para el cultivo in vitro. Después del tratamiento, se descartó la solución del pocillo. Medios que contienen diferentes concentraciones (10, 50, 100, 200, 250, 500 y 1000 ug/mL) decistanchetubulosa nanopolvo se añadió a las células MES23.5 en diferentes pocillos y se dejó incubar durante 24 h y 48 h. Las células MES23.5 que se incubaron con medio de cultivo normal durante 24 h y 48 h se usaron como controles negativos. Las células MES23.5 que se incubaron con medio MPP plus se usaron como vehículo. Las mediciones se realizaron por triplicado para cada muestra. Se midió la absorbancia de los grupos de tratamiento y control correspondientes para calcular la viabilidad celular.
Expresión de TH medida por inmunocitoquímica
Cuandocistanchetubulosa nanopolvo estaba en 100, 200 y 250 ug/ml, la tasa de supervivencia celular aumentó significativamente (Figura 2G). Por lo tanto, en experimentos posteriores, probamos las tres concentraciones: grupos de dosis baja, dosis media y dosis alta. Se probaron tres repeticiones para cada uno de loscistanchegrupos tubulosos. Se colocaron cubreobjetos esterilizados y recubiertos con polilisina en 6-placas de pocillos. A continuación, se sembraron 5 × 104 células en cada pocillo y se incubaron durante 24 h. El medio fresco convencional se reemplazó en el grupo de control normal y una concentración final de 100 μmol/L de MPP más medio se reemplazó en los grupos de tratamiento restantes para incubar durante 24 h. Luego se reemplazó el medio fresco convencional en los grupos de control y vehículo normales, y las concentraciones finales de 100, 200 y 250 ug/mLcistanchetubulosa nanopolvo se incubaron con las células durante 24 h en las dosis baja, moderada y altacistanchetubulosa grupos de tratamiento, respectivamente. Las células MES23.5 de los diferentes grupos se lavaron tres veces en PBS para eliminar el sobrenadante y luego se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 15 min. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con un bloqueador de peroxidasa a 37 grados durante 30 min y luego se lavaron nuevamente con PBS. Se usó una solución de Triton X-100 al 0,2 por ciento para la permeabilización celular durante 10 min, seguido de lavado con PBS.
Se añadió suero normal de cabra a cada muestra y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, se eliminó el suero de cabra normal y se añadió un anticuerpo primario diluido 1:400 en PBS a cada muestra y se incubó a 4 grados durante la noche. Las células del grupo de control negativo se incubaron con PBS a 4 grados durante la noche. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con biotina en la cámara de humedad a 37 grados durante 20 min. A continuación, cada muestra se lavó en PBS y se marcó con conjugados de peroxidasa de rábano picante-estreptavidina (solución de trabajo C) a 37 grados durante 20 min. Después de lavarlas con PBS, las células se tiñeron con el reactivo DAB en la oscuridad durante aproximadamente 1 a 10 minutos y se controló el desarrollo de un color marrón bajo un microscopio óptico.
Luego, cada muestra se lavó dos veces en agua destilada durante 1 a 2 min y los núcleos se contrastaron con solución de hematoxilina durante 0, 5 a 1 min. Después de enjuagar a fondo cada muestra en agua, las células se sumergieron en alcohol ácido clorhídrico al 1 por ciento para la diferenciación y amoníaco acuoso al 1 por ciento, seguido de un lavado a fondo de las células en agua. A continuación, las células de cada muestra se deshidrataron en etanol al 70 % durante 2 min, etanol al 80 % durante 2 min, etanol al 90 % durante 2 min dos veces, etanol al 95 % durante 2 min dos veces y etanol al 100 % durante 2 min dos veces. Luego, las células se sumergieron en solución de xileno durante 2 min dos veces y se montaron en un portaobjetos de vidrio con resinas neutras. Bajo microscopía óptica, cada muestra se sometió a captura de imágenes y selección aleatoria de 5 a 10 campos visuales efectivos para determinar la expresión de proteínas seleccionadas en neuronas dopaminérgicas indicadas por la intensidad de las partículas marrones y para semicuantificar el contenido de proteínas por su valor gris promedio .
Tasa de apoptosis de células MES23.5 medida por citometría de flujo
Las células adherentes se lavaron una vez con PBS. Para el aislamiento celular, se añadió una cantidad apropiada de solución de tripsina sin EDTA a temperatura ambiente y la solución se pipeteó suavemente para permitir que las células adherentes se despegaran. Luego se agregó un medio de cultivo celular para detener la tripsinización. La mezcla se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga y luego se centrifugó durante 5 min a 1500 rpm para recolectar las células aisladas. Después de descartar el sobrenadante, el sedimento celular se resuspendió suavemente usando PBS y se contaron las células. Se centrifugaron aproximadamente de 1 × 105 a 5 × 105 células resuspendidas durante 5 min a 1500 rpm y se descartó el sobrenadante. Se añadieron cinco microlitros de solución de unión de Anexina V-FITC al sedimento celular para resuspender suavemente las células. Se añadieron otros 5 μL de Anexina V-FITC y se mezclaron completamente. Se usaron cinco microlitros de solución de yoduro de propidio para teñir las células incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos poco antes de la citometría de flujo.
Análisis de Western Blot para in vitro
Las células se dividieron en un grupo normal, MPP más grupo de tratamiento, dosis bajacistanchetubulosa grupo de tratamiento, dosis moderadacistanchetubulosa grupo de tratamiento, y dosis altacistanchegrupo de tratamiento de tubulosa. En cada uno se midió la expresión de Bcl2 y Bax. Se utilizó un total de 1 × 105 células por pocillo en la placa de 6-pocillos para el modelado y tratamiento en cada grupo antes de la recolección de células. Se añadió un lisado mixto que contenía tampón RIPA, inhibidor de proteasa e inhibidor de fosfatasa para lisar las células durante 30 min en hielo. Después de la centrifugación, el sobrenadante se usó para el análisis de proteínas. La proteína total se cuantificó utilizando un ensayo BCA y se separó mediante SDS-PAGE al 10 por ciento. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana y se incubaron con un tampón de bloqueo de leche descremada al 5 por ciento a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación, la membrana se incubó en anticuerpo primario (Bcl-2 0, 34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, dilución 1:200) a 4 grados durante la noche. Después de un paso de lavado, la membrana se incubó en un anticuerpo secundario (0,5 mg/ml, dilución 1:5000) a 4 grados durante 1 hora y luego en revelador ECL durante 2 minutos para el desarrollo convencional. Se utilizó el software Cantidad Uno para el análisis semicuantitativo de la expresión de proteínas.
Modelado de animales experimentales y administración de fármacos
Cincuenta ratones macho de 8-semanas libres de patógenos específicos se dividieron al azar en cinco grupos: un grupo normal, un grupo de tratamiento con MPTP (Vehículo), una dosis bajacistanchetubulosa grupo de tratamiento, dosis moderadacistanchetubulosa grupo de tratamiento, y dosis altacistanchegrupo de tratamiento de tubulosa. Los animales se alojaron a 20-22 grados con libre acceso a comida y agua. A los ratones del grupo normal se les inyectó por vía intraperitoneal un volumen igual de solución salina normal durante siete días consecutivos. A los ratones de los otros grupos de tratamiento se les inyectó por vía intraperitoneal MPTP (30 mg/kg/d) durante siete días consecutivos para establecer los vehículos.
Durante el modelado de la enfermedad de Parkinson, los ratones en dosis baja, dosis moderada y dosis altacistanchetubulosa a los grupos de tratamiento se les administró por vía intragástrica volúmenes clínicos equivalentes de 4 g/kg/d, 8 g/kg/d y 16 g/kg/dcistanchetubulosa nanopolvo, respectivamente, durante 14 días consecutivos. A los ratones de los grupos control y vehículo se les administraron por vía intragástrica volúmenes equivalentes de solución salina normal durante 14 días consecutivos. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de MTC de Fujian y se realizaron de acuerdo con los principios internacionalmente aceptados para el uso y cuidado de animales de laboratorio. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales en este estudio.
Pruebas de comportamiento
Prueba de natación (Zhu et al., 2014)
La coordinación del movimiento corporal en ratones se midió mediante la prueba de natación. Los ratones se colocaron individualmente en un tanque de agua (25 cm de altura y 10 cm de diámetro) que contenía 10 cm de agua y se probaron en un entorno tranquilo para registrar su duración estacionaria durante 5 min.
Prueba de campo abierto (Kawai et al., 1998)
La actividad locomotora se midió utilizando la prueba de campo abierto. Los ratones se probaron en un ambiente silencioso y con poca luz y se colocaron individualmente en un recipiente acrílico transparente de 30 cm × 30 cm × 15 cm con una rejilla de separación de 6 cm × 6 cm en la parte inferior. A los ratones se les dio 10 minutos para adaptarse al entorno y luego se midió la deambulación del número de cuadrícula y la frecuencia de cría de los ratones individuales cinco veces consecutivas para obtener los valores medios.
Muestreo de tejido cerebral
Antes del muestreo de tejido, los ratones fueron alimentados adlibitum con libre acceso al agua y recibieron intervención farmacológica durante 14 días consecutivos. Se seleccionaron cuatro ratones de cada grupo y se decapitaron rápidamente. El SN (Bregma: −2,75 mm −2,92 mm) de cada animal se aisló y se colocó en hielo. Los tejidos cerebrales se enjuagaron con 0.9 por ciento de solución de cloruro de sodio helada para eliminar la sangre y se secaron en papel de filtro antes de almacenarlos a -80 grados. Se anestesiaron cuatro ratones de cada grupo por vía intraperitoneal y se les abrió el pecho. A continuación, se insertó una aguja de infusión en el ventrículo izquierdo de cada animal. Para eliminar la sangre del sistema circulatorio, se cortó el apéndice auricular derecho y se infundió al animal una solución salina normal de 4 grados hasta que el hígado palideció para asegurar la perfusión sucesiva. Una vez que el efluente de la aurícula derecha se volvió claro, cada animal se perfundió con fijador de paraformaldehído al 4 por ciento. Después de la perfusión, el tejido cerebral de cada animal se diseccionó cuidadosamente y se fijó posteriormente en paraformaldehído al 4 por ciento durante 24 h. Luego, los tejidos cerebrales fijados se enjuagaron con agua corriente, se deshidrataron en una serie graduada de soluciones de etanol y se aclararon en una solución de xileno. A esto le siguió la inmersión en parafina y la inclusión.
Cambios en la cantidad de DA medidos por HPLC
El nanopolvo de SN de cada grupo se colocó en un baño de hielo que contenía 0,9 por ciento de solución de cloruro de sodio (proporción 1:9). El tejido cerebral se homogeneizó usando un disruptor celular ultrasónico y se centrifugó a 1200 rpm durante 20 min a 4 grados para obtener el sobrenadante. Para HPLC, se utilizó una columna Hypersil AA-ODS (2,1 mm × 200 mm, 5 μm) a una temperatura de columna de 30 grados. La detección de fluorescencia se realizó a 280 nm λex y 340 nm λem. El volumen de inyección fue de 10 μL.
Expresión de TH, GDNF, GFR 1 y Ret detectada por inmunohistoquímica
Se aislaron secciones de parafina (5 μm de espesor) de tejido cerebral individual de cada animal y se colocaron en un baño de agua tibia a 40 grados para aplanarlos y adherirlos a portaobjetos de vidrio. Todos los portaobjetos de tejido se incubaron en un horno a 60 grados durante 3 a 6 h, seguido de desparafinado con xileno, deshidratación con etanol en gradiente y recuperación de antígeno mediante incubación en un tampón de ácido cítrico y calentamiento en un microondas durante 20 min. Luego, los portaobjetos de tejido se incubaron en una solución de H2O2 al 3 por ciento a temperatura ambiente durante 10 min. Después de lavarse tres veces en PBS, los portaobjetos de tejido se incubaron con suero normal en una cámara cerrada a temperatura ambiente durante 20 min. La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó un analizador de imágenes Motic Med 6.0 para calcular el valor de la densidad óptica integrada en las células teñidas positivamente.
Análisis de Western Blot en tejidos cerebrales de ratones
Este estudio evaluó la expresión proteica de tirosina hidroxilasa (TH), GDNF, GFR 1, Ret, Bcl2 y Bax. El lisado cerebral de cada grupo se homogeneizó durante 3{{10}} min en hielo, seguido de centrifugación a baja temperatura, 20,000 rpm, a 4 grados durante 5 min para recoger el sobrenadante. Las muestras de proteínas se separaron a presión constante usando un gel SDS-PAGE al 10 por ciento como se describe anteriormente. La concentración de anticuerpos primarios: TH 0,15 mg/ml, GDNF 0,5 mg/ml, GFR 1 0,8 mg/ml, Ret 0,63 mg/ml, Bcl-2 0,34 mg/ml y Bax 0,11 mg/ml. El procedimiento fue el mismo que el anterior.
Análisis estadístico
Este estudio utilizó el software estadístico SPSS 20.0 para el procesamiento y análisis de datos. Los valores de los parámetros se expresaron como media ± desviación estándar (x¯
±S). Se utilizó ANOVA para el análisis de datos de un solo factor. Se utilizó LSD o la prueba de Games-Howell para comparar los grupos. P < 0.05 (o P < 0,01) se consideró una diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
Los componentes activos decistanchenanopolvo tubulosa
En el rango de exploración de 200 a 400 nm, ECH encistanchetubulosa y VER en 330 nm tuvieron el pico máximo de absorción, que apareció dentro de los 20 min. ICA tuvo picos máximos de absorción a 270 nm y apareció después de 20 min (Figura 1A). Los resultados mostraron que las muestras negativas no interfirieron con la detección (Figura 1B). Las muestras y el control tenían los mismos picos cromatográficos y la muestra negativa no tenía ninguno. Esto mostró que los demás ingredientes de la muestra no interferían con el componente que se estaba midiendo. Además, los tres componentes y los picos adyacentes pueden alcanzar la línea base de separación y el grado de separación fue superior a 1,5.
cistanchetubulosa Nanopolvo MPP reducido más citotoxicidad inducida en células MES23.5
La viabilidad de las células MES23.5 se redujo significativamente con concentraciones crecientes de MPP plus. La Figura 2F muestra la citotoxicidad significativa de diferentes concentraciones de MPP plus.
cistanchetubulosa nanopolvo redujo la citotoxicidad inducida por MPP plus y mejoró la viabilidad de las células MES23.5. La figura 2G muestra quecistancheLas dosis de nanopolvo de tubulosa de 10 a 250 ug/mL ejercieron efectos protectores dependientes de la dosis en las células MES23.5 tratadas con MPP plus.
Efecto citomorfológico decistanchenanopolvo tubulosa
Las células MES23.5 normales tenían una buena adhesión celular y tenían forma de huso con límites celulares y sinapsis claros. Las células MES23.5 dañadas por MPP plus mostraron una mala adhesión y contracción celular, y muchas estaban suspendidas en el medio con sinapsis contraídas. Estas células estaban agregadas, encogidas y redondas con vacuolas en el interior, y los núcleos estaban desintegrados o colapsados.cistanchetubulosa nanopolvo en diferentes dosis mejoró la citomorfología de las células MES23.5 en diferentes grados al mejorar la adhesión celular y la limpieza sináptica del grupo vehículo. Células MES23.5 en la dosis altacistanchetubulosa grupo de tratamiento mostró una morfología que era similar al grupo de control normal (Figuras 2A-E).
Efecto decistanchetubulosa Nanopolvo sobre la expresión de TH y la apoptosis en las células
La figura 3 muestra una reducción significativa en la expresión de la proteína TH en el grupo vehículo. La expresión de la proteína TH aumentó de manera diferente en los grupos tratados con diferentes dosis decistanchetubulosa. Sin embargo, la prueba de LSD mostró que no hubo diferencia significativa entre los tres grupos tratados.
La figura 4 muestra los resultados de la evaluación de la apoptosis mediante citometría de flujo. La tasa de apoptosis en el grupo del vehículo fue significativamente mayor que en los otros grupos. Células tratadas con diferentes dosis decistanchetubulosa nanopolvo mostró diferentes grados de disminución en la tasa de apoptosis en comparación con el grupo del vehículo. Células en dosis media y altacistanchetubulosa grupo de tratamiento tuvo la mejora más significativa en la tasa de apoptosis en comparación con el otrocistanchegrupos de tratamiento tubulosa. La prueba de LSD mostró que no había una diferencia significativa entre los dos grupos tratados, pero sí una diferencia significativa entre el grupo de dosis baja.
Efecto decistanchetubulosa Nanopolvo sobre la expresión de la proteína Bcl2/Bax en las células
La figura 5 muestra que la expresión de la proteína Bcl2 en las células del grupo vehículo fue significativamente menor en comparación con el grupo de control normal. Por el contrario, la expresión de la proteína Bax en las células del grupo vehículo fue significativamente mayor que en el grupo de control normal.cistanchetubulosa los grupos de tratamiento mostraron un aumento de la expresión de la proteína Bcl2 y una disminución de la expresión de la proteína Bax en las células MES23.5 tratadas con MPP plus. Entre los tres grupos tratados, hubo diferencias significativas en la prueba de LSD. Estos efectos fueron dependientes de la dosis.
Pruebas de comportamiento
Los resultados de la prueba de natación sugirieron que los ratones en el grupo del vehículo tenían duraciones estacionarias relativamente largas, que aumentaron con el tiempo. En el día 14, los ratones del grupo del vehículo tenían una duración estacionaria significativamente mayor que los ratones del grupo de control normal. La duración estacionaria de los ratones en la dosis bajacistanchetubulosa grupo de tratamiento no fue significativamente diferente de la de los ratones en el grupo de vehículo. Sin embargo, la duración estacionaria de los ratones en la dosis altacistanchetubulosa grupo de tratamiento fue significativamente menor que la de los ratones en el grupo de vehículo.
Los resultados de la prueba de campo abierto sugieren que después del daño inducido por MPTP en los ratones, los ratones en el grupo del vehículo demostraron una disminución significativa en su capacidad para la actividad espontánea, como lo muestra la frecuencia de crianza. Después de una administración de 14-días decistanchetubulosa nanopolvo, los ratones en los grupos de tratamiento de dosis moderada y alta tenían frecuencias de crianza significativamente más altas en comparación con los ratones en el grupo del vehículo (Figuras 6A, B).
Efecto decistanchetubulosa Nanopolvo sobre el contenido de DA en ratones
Los cambios en el contenido de DA de la SN se determinaron por HPLC. Se encontró que el contenido de DA en el cerebro del grupo del vehículo se redujo significativamente. El contenido de DA en el cerebro de los ratones con EP en la dosis bajacistanchetubulosa grupo de tratamiento no difirió significativamente de los ratones en el grupo de vehículo. Sin embargo,cistanchetubulosa el tratamiento aumentó los niveles de DA en el cerebro de ratones PD de una manera dependiente de la dosis. Los cerebros de ratones PD tratados con dosis altascistanchetubulosa tenía un contenido de DA significativamente más alto que los cerebros de los ratones en el grupo del vehículo (Figura 6C).
Efecto decistanchetubulosa Nanopolvo sobre la expresión de TH en ratones
El número de células TH-positivas y el nivel de expresión de la proteína TH en el SN de los ratones PD inducidos por MPTP fueron menores en comparación con los ratones del grupo de control. Después de lacistanchetubulosa, aumentó el número de células TH positivas y el nivel de expresión de la proteína TH en el SN de los ratones con EP inducida por MPTP, con una diferencia significativa entre la dosis altacistanchetubulosa grupo de tratamiento y el grupo de vehículo por prueba de LSD; y hubo diferencias significativas entre los tres grupos tratados (Figura 7).
Efecto decistanchenanopolvo tubulosa sobre la expresión proteica de GDNF y sus receptores, GFR 1 y Ret en ratones
La expresión proteica de GDNF y sus receptores, GFR 1 y Ret, en las células teñidas positivamente, se evaluó usando inmunohistoquímica. Se utilizó el análisis de transferencia Western para evaluar los niveles de expresión de proteínas en el SN de los diferentes grupos de ratones. Los hallazgos para los diferentes grupos fueron similares usando los dos métodos de detección. La expresión de GDNF y sus proteínas receptoras, GFR 1 y Ret, en células teñidas positivamente en el SN de los ratones del grupo vehículo fue significativamente menor que en los ratones del grupo control normal. Diferentes dosis decistanchetubulosa aumentó el número de células GDNF-, GFR 1- y Ret-positivas (Figuras 8A-S).
La expresión proteica de GDNF, GFR 1 y Ret en el SN de los ratones del grupo vehículo fue significativamente menor que en los ratones del grupo control. El aumento de las concentraciones de tratamiento decistanchetubulosa nanopolvo mejoró significativamente la expresión de estas proteínas. La expresión proteica de GDNF, GFR 1 y Ret en el SN de los ratones en la dosis altacistanchetubulosa fue significativamente mayor que en los ratones del grupo de vehículo (P < 0.01; Figuras 8T, U).
Efecto decistanchetubulosa Nanopolvo sobre la expresión de proteínas de Bcl2/Bax en ratones
La expresión de la proteína Bcl2 se redujo significativamente y la expresión de la proteína Bax aumentó significativamente en el SN de los ratones del grupo del vehículo (P < 0.01) en comparación con los ratones del grupo de control normal. Alta dosiscistanchetubulosa aumentó significativamente la expresión de la proteína Bcl2 y redujo significativamente la expresión de la proteína Bax en los cerebros de los ratones vehículo (P < 0.01; Figura 9). La prueba de LSD mostró que no había una diferencia significativa entre los grupos de dosis media y alta, pero sí una diferencia significativa entre el grupo de dosis baja.
Discusión
EP y Apoptosis
La EP es un trastorno neurodegenerativo. Según Zhang et al. (2005), la prevalencia es del 10,7 % en la población china mayor de 55 años y del 1,67 % en los mayores de 65 años. El número de pacientes con EP ha aumentado anualmente con la aceleración del envejecimiento global, lo que representa una pesada carga financiera para las familias de los pacientes. y la sociedad en general.
En el cerebro, las neuronas dopaminérgicas están involucradas principalmente en la síntesis y secreción de DA. Están ampliamente distribuidos en el sistema nervioso central y localizados principalmente en el SN (80 por ciento). TH es la enzima limitante de la velocidad clave para la síntesis de DA.
Así, la inhibición de la actividad de TH reduce la síntesis de DA (Huot y Parent, 2007). Los principales cambios patológicos y bioquímicos de la EP son la apoptosis de las neuronas dopaminérgicas en el SN, una reducción significativa de la DA nigroestriatal y la formación de cuerpos de Lewy en las neuronas dopaminérgicas (Dexter y Jenner, 2013). La etiología de la EP involucra factores genéticos asociados, factores ambientales y el envejecimiento del sistema nervioso (Allam et al., 2005). La patogenia de la EP sigue sin estar clara en la medicina moderna. Desde finales de la década de 1960, la terapia de reemplazo con levodopa se ha utilizado con éxito para tratar la EP y se ha reconocido como un importante punto de inflexión en el tratamiento de la EP. Sin embargo, la aplicación a largo plazo de esta terapia provoca efectos secundarios y la terapia no trata las causas subyacentes de la EP (Del Sorbo y Albanese, 2008). Por lo tanto, la investigación activa de nuevos fármacos o métodos de tratamiento dirigidos a la protección de las neuronas dopaminérgicas es crucial para el tratamiento de la EP.
En estudios anteriores, la aplicación de marcaje de extremos de muescas de dUTP mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal indicó que 0.6 por ciento -4.8 por ciento de las neuronas dopaminérgicas en el SN de pacientes con EP mostraron apoptosis (Mochizuki et al., 1996). La microscopía electrónica mostró características apoptóticas, incluyendo condensación cromática y cuerpos apoptóticos en células dopaminérgicas (Anglade et al., 1997). Tomkins et al. (1997) realizaron un análisis ultraestructural de autopsias de tejido cerebral de pacientes con EP, EA y enfermedad difusa de cuerpos de Lewy (DLBD). Encontraron cuerpos apoptóticos en la capa densa del SN en pacientes con EP y DLBD, lo que proporciona evidencia concluyente de apoptosis neuronal en la EP y enfermedades relacionadas. Por tanto, la reducción o supresión de la apoptosis en las neuronas dopaminérgicas es fundamental para el tratamiento de la EP.
Estudios previos mostraron que MPTP inducía síntomas similares a los de la EP. MPTP cruza la barrera hematoencefálica y es metabolizado por monoaminooxidasas tipo B en los astrocitos. Posteriormente se convierte en MPP plus tóxico, que se acumula en las mitocondrias de las neuronas dopaminérgicas a través de la ingesta de proteínas del transportador DA. Genera así un exceso de radicales libres de oxígeno que inhiben la actividad del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial y la síntesis de ATP. Estos eventos promueven aún más la formación de radicales libres y las reacciones de estrés oxidativo y eventualmente conducen a la degeneración y muerte de las neuronas dopaminérgicas.
Por lo tanto, este estudio utilizó MPP plus para establecer un vehículo in vitro en las neuronas dopaminérgicas MES23.5 y MPTP para inducir un vehículo de ratón para la verificación mutua. Según los resultados del ensayo MTT, MPP plus redujo significativamente la viabilidad de las células MES23.5, lo que sugiere que MPP plus era citotóxico para las neuronas dopaminérgicas. Los resultados también demostraron quecistanchetubulosa mejoró efectivamente la expresión de proteínas antiapoptóticas e inhibió el aumento de la apoptosis inducida por MPP plus.
D y GDNF
El GDNF es un factor neurotrófico, que fue aislado por primera vez por Lin et al. (1993). Lin et al. (1993) también demostraron que el GDNF tenía efectos nutricionales específicos sobre las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio de ratas. GDNF, neurturina (NTN), percepción (PSP) y artemina (ART) constituyen la familia GDNF. Son proteínas secretoras estructuralmente similares y funcionalmente relacionadas (Kotzbauer et al., 1996; Baloh et al., 1998; Milbrandt et al., 1998; Woodbury et al., 1998).
El receptor de GDNF consta de dos componentes. El primer componente, GFR, se fija a la membrana externa de glicosilfosfatidilinositol (GPI) y se ancla a la superficie de conexina. El segundo componente es la proteína Ret. La investigación ha demostrado que hay cuatro tipos diferentes de GFR: GFR 1, GFR 2, GFR 3 y GFR 4. GFR 1 es un receptor de alta afinidad de GDNF (Onochie et al., 2000; Chen et al., 2001; Lindahl et al., 2001). La proteína Ret es un receptor funcional de GDNF. La molécula de homodímero de GDNF se une directamente a GFR 1 para formar complejos e interactúa con Ret, lo que da como resultado la dimerización y activación de Ret. Debido a la autofosforilación de Ret, Ret activa varias vías de señalización comunes de TH. En ausencia de proteína Ret, GDNF provoca la fosforilación de proteínas de MAPK, PI-3 y PLC-, además de la expresión de ARNm y la actividad funcional de C-fos a través de su proteína receptora, GFR 1 (He et al., 2008).
Los estudios han demostrado que el GDNF tiene el efecto protector más potente sobre las neuronas dopaminérgicas (Rangasamy et al., 2010; Campos et al., 2012). En vehículos que usan MPTP e 6-hidroxidopamina (6-OHDA) para inducir daño en las neuronas dopaminérgicas, el GDNF protege las neuronas dopaminérgicas al reducir la apoptosis y promover el crecimiento axonal para inducir la diferenciación de células madre (Lucas et al., 2012; Littrell et al., 2013). Lin et al. (1993) demostraron que el GDNF promovía específicamente la viabilidad, la diferenciación y el crecimiento axonal de las neuronas dopaminérgicas para promover la captación de DA en las neuronas. El estudio también mostró que el GDNF no solo previno la toxicidad aguda, sino que también alivió la toxicidad a largo plazo de MPP más o 6-OHDA en las neuronas dopaminérgicas, además de prevenir la muerte celular en células estresadas o dañadas (Yu et al., 2010). Además, GDNF promovió la proliferación y diferenciación de células madre neurales hacia las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo (Lindsay, 1995) para rescatar a las neuronas dopaminérgicas de la degeneración retrógrada (Hong-Juan et al., 2011).
Los estudios han demostrado que la expresión de GDNF en el SN se redujo significativamente en vehículos animales (Yang et al., 2010). Esto sugiere que puede ser uno de los mecanismos de patogénesis en ratas PD. La inyección de 5 a 15 ug/día de GDNF en el ventrículo lateral o cuerpo estriado de un animal vehículo inducido por MPTP durante tres meses consecutivos promovió la reparación nigroestriatal del sistema dopaminérgico en el animal vehículo (Grondin et al., 2002). Los estudios del tratamiento con GDNF para la EP en vehículos animales han demostrado que la inyección intracerebral de GDNF en diferentes regiones del cerebro, como el SN, el núcleo caudado y el ventrículo lateral, mejora los trastornos del movimiento asociados con los modelos animales de la EP, incluida la disminución de la actividad motora, la rigidez muscular y la temblor (Grondin et al., 2002).
Sin embargo, el GDNF no puede atravesar directamente la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, la inyección cerebral local de GDNF implica riesgos sustanciales y dificultades en la aplicación clínica. Aún se están estudiando aplicaciones para introducir GDNF exógeno a través de microesferas de liberación controlada, cápsulas de liberación sostenida y genes virales (Liang et al., 2010; Yang et al., 2010; Qiao et al., 2012). Dadas las limitaciones de varias técnicas para introducir GDNF exógeno en el cerebro, los agentes neuroprotectores que promueven la liberación de GDNF endógeno son significativos para la aplicación clínica.
PD ycistanchenanopolvo tubulosa
La EP es más común en adultos de mediana edad y ancianos. La teoría de la MTC considera que la EP se localiza principalmente en el cerebro y se debe principalmente a deficiencias hepáticas y renales, además de insuficiencia de energía vital y sangre. De acuerdo con esta teoría, el tratamiento de la EP debería centrarse en vigorizar el riñón y la médula ósea. Yang et al. (2010) usaron ensayos clínicos aleatorizados, doble ciego y controlados con placebo y encontraron que la terapia combinada con Madopar y recetas para tonificar los riñones aliviaba las disfunciones motoras de los pacientes con EP. El resultado del tratamiento fue mejor que una sola terapia con Madopar. La eficacia del tratamiento de la monoterapia o la prescripción de compuestos de la MTC en la EP se ha confirmado en modelos animales de la EP y en aplicaciones clínicas. Las aplicaciones de la MTC para tonificar los riñones y promover la circulación sanguínea redujeron la dosis de monoterapia para la EP con Madopar. Algunos estudios han sugerido que la MTC mejoró los síntomas de la EP y protegió las neuronas dopaminérgicas, lo que podría estar estrechamente relacionado con la promoción de la expresión endógena de GDNF (Hong-Juan et al., 2011; Qiao et al., 2012).
El compuesto tonificante renal utilizado en este estudio,cistanchetubulosa nanopolvo, contenía Cistanche, epimedium y Rhizoma poligonal. La investigación moderna sugiere que la composición química de Cistanche es ECH, que protege las neuronas dopaminérgicas en el SN en los ratones con EP inducida por MPTP e inhibe la reducción de DA y el transportador de DA (Zhao et al., 2010). Además, previene la reducción de DA inducida por 6-OHDA y protege las neuronas dopaminérgicas del cuerpo estriado (Chen et al., 2007). Epimedium inhibe la activación de caspasa-3 y ejerce funciones neuroprotectoras (Liu et al., 2011). Los flavonoides de Epimedium promueven eficazmente la proliferación y diferenciación de células madre neurales (Yao et al., 2010).
En este estudio,cistanchetubulosa nanopowder antagonizó el aumento de la apoptosis inducida por MPP plus de una manera dependiente de la dosis. Mejoró significativamente la expresión de TH en el vehículo in vitro y tuvo efectos antiapoptóticos significativos en las neuronas dopaminérgicas. Los ratones con vehículo inducido por MPTP mostraron trastornos del comportamiento y una expresión significativamente reducida de TH en los tejidos del cerebro medio y los niveles de DA, que son características patológicas típicas de la EP. Diferentes dosis decistanchetubulosa nanopowder acortó la duración estacionaria, mejoró las actividades autónomas, mejoró los trastornos del comportamiento, elevó los niveles de DA en el cerebro y aumentó la expresión de TH en los vehículos. Estos resultados sugirieron quecistanchetubulosa nanopolvo ejerció efectos protectores sobre las neuronas dopaminérgicas, mejorando así los trastornos de comportamiento de los vehículos. Diferentes dosis decistanchetubulosa nanopowder aumentó la expresión de la proteína GDNF y sus proteínas receptoras en el cerebro de ratones vehículos. El tratamiento con dosis altas de cistanche tubulosa aumentó significativamente la expresión de Bcl2 y redujo la expresión de Bax, lo que sugirió que el nanopolvo de cistanche tubulosa podría promover la expresión y secreción de GDNF en el cerebro de ratón dañado por MPTP. Además, podría ejercer efectos neuroprotectores en las neuronas dopaminérgicas y minimizar la apoptosis neuronal a través de las funciones de soporte neurotrófico del GDNF.
Este estudio demostró quecistanchetubulosa nanopolvo ejerció efectos protectores en las neuronas dopaminérgicas tanto in vitro como in vivo y aumentó la expresión de TH para mejorar el contenido de DA. También mejoró los trastornos del comportamiento en ratones con vehículo inducido por MPTP, reguló la expresión proteica de GDNF y sus proteínas receptoras en el SN y tuvo efectos antiapoptóticos en los ratones PD. El mecanismo subyacente a los efectos clínicos decistanchetubulosa nanopolvo en la EP puede implicar el aumento del contenido de GDNF endógeno en el cerebro y, por lo tanto, la reducción del daño a las neuronas dopaminérgicas.
Contribuciones de autor
QX y WF son los primeros coautores del trabajo, S-FY, Y-BC, WQ y S-YC participaron en el trabajo experimental, y JC diseñó y guió el trabajo.
Declaracion de conflicto de interes
Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de interés.
Expresiones de gratitud
El trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian Grants (proyecto 2015J01686), el Fondo de Investigación Científica de la Comisión Nacional de Salud y Planificación Familiar de la República Popular China (proyecto WKJ-FJ-38), Chen Keji fondo para el desarrollo de la Medicina Integrativa (proyecto CKJ2014012), y la asignatura clave de la Universidad de Fujian de Medicina Tradicional China (tema del proyecto X2014010-).
For more information:1950477648nn@gmail.com
