El extracto de Cistanche Deserticola aumenta la formación de hueso en los osteoblastos--Parte I

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Resumen
Objetivos Investigamos el efecto deCistanchedeserticolaMamá. (CD) enhuesoformaciónpor cultivo de osteoblastos. Métodos El ensayo de formación de nódulos mineralizados se utilizó para examinar los efectos in vitro de la CD(Cistanchedeserticola)enhuesoformación. La expresión de ARNm de fosfatasa alcalina (ALP), proteínas morfogenéticas óseas (BMP)-2 y osteopontina (OPN) se analizó mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real. El mecanismo de acción de CD(Cistanchedeserticola)El extracto se investigó mediante transferencia de Western. El efecto antiosteoporótico in vivo de la EC(Cistanchedeserticola)extracto fue evaluado en ratones ovariectomizados.
Resultados clave

CD(Cistanchedeserticola)El extracto no tuvo ningún efecto sobre la proliferación, migración o cicatrización de heridas de osteoblastos cultivados, pero aumentó el ARNm de ALP, BMP-2 y OPN y la mineralización ósea. Los inhibidores de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) o del factor nuclear (NF)-kB redujeron la CD(Cistanchedeserticola)extracto inducidoformación óseay expresión ALP, BMP-2 y OPN. Sin embargo, CD(Cistanchedeserticola)extracto no afectó la osteoclastogénesis. Además, CD(Cistanchedeserticola)El extracto previno la pérdida ósea inducida por la ovariectomía in vivo.
Conclusiones

CD(Cistanchedeserticola)puede ser una novelaformación óseaagente para el tratamiento de la osteoporosis.

Palabras claveformación ósea; Cistanchedeserticola; hierba china; osteoblastos

Cistanche deserticaes bueno paraformación ósea

Introducción

El hueso es un tejido complejo compuesto por varios tipos de células que se someten a un proceso continuo de renovación y reparación denominado "remodelación ósea". Dos tipos principales de células responsables de la remodelación ósea son los osteoclastos, que reabsorben el hueso, y los osteoblastos, que forman hueso nuevo. La remodelación ósea está regulada por varias hormonas sistémicas (p. ej., hormona paratiroidea, 1, 25-dihidroxivitamina D3, hormonas sexuales y calcitonina) y factores locales (p. ej., óxido nítrico, prostaglandinas, factores de crecimiento y citocinas).[1] La osteoporosis se produce cuando la reabsorción y la formación de hueso no están coordinadas y el exceso de descomposición ósea supera la formación ósea.[2] Los tratamientos actuales para la osteoporosis incluyen bisfosfonatos, calcitonina y estrógeno, que son inhibidores de la resorción ósea que mantienen la masa ósea al inhibir la actividad de los osteoclastos.[3] Sin embargo, el efecto de estos medicamentos para aumentar o recuperar la masa ósea es relativamente pequeño, ciertamente no más del 2 % por año.[3] Por lo tanto, existe la necesidad de agentes para la formación de huesos, como la teriparatida, que estimulen nuevoshuesoformacióny corregir el cambio en la microarquitectura trabecular que es característico de la osteoporosis establecida.[4,5] Debido a que los nuevoshuesoformaciónes principalmente una función de los osteoblastos, los agentes que actúan aumentando la proliferación de células del linaje osteoblástico o induciendo la diferenciación de los osteoblastos pueden mejorar la formación ósea.[5,6]
Aunque los mecanismos de la osteoporosis aún no están claros, es probable que estén relacionados con la disponibilidad reducida o los efectos de los factores de crecimiento óseo, como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP).[7] Las BMP, que están estructuralmente relacionadas con la superfamilia del factor de crecimiento transformante-b, se identificaron originalmente por su capacidad para inducir ectópica.hueso formaciónen roedores.[8] Las BMP juegan un papel importante enhuesoformacióny la diferenciación de las células óseas al estimular la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), así como la síntesis de proteoglucanos, colágeno y osteopontina (OPN).[9] Un estudio reciente encontró una relación entre la osteoporosis y polimorfismos específicos en los genes BMP-2, ALP y OPN, lo que sugiere que están relacionados con el desarrollo de la osteoporosis.[10]

CistanchedeserticolaMamá. (Orobanchaceae; abreviado como CD)(Cistanchedeserticola)es una hierba nativa de China y se usa ampliamente en la medicina tradicional como agente terapéutico debido a sus propiedades sedantes, analgésicas e inmunoestimuladoras.[11] Estudios farmacológicos modernos han demostrado que la CD(Cistanchedeserticola)los extractos pueden estimular la inmunidad,[12] eliminar los radicales libres[13] y aumentar la actividad de la superóxido dismutasa.[14] Los agentes antiinflamatorios y antioxidantes tienen el potencial de tratar la osteoporosis al aumentarhueso formacióny/o la supresión de la resorción ósea.[15,16] Sin embargo, el efecto de la EC(Cistanchedeserticola)sobre la función de las células óseas aún no se ha determinado. Aquí informamos que el CD(Cistanchedeserticola)El extracto no afectó la proliferación, la migración o la actividad de curación de heridas de los osteoblastos cultivados, pero aumentó la expresión de ALP, BMP-2 y OPN y la mineralización ósea. Además, mostramos que las vías de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) y el factor nuclear (NF)-kB pueden estar involucradas en el aumento de la expresión génica y la mineralización ósea mediado por CD. En cambio, el CD(Cistanchedeserticola)extracto no suprimió la osteoclastogénesis in vitro. En particular, el tratamiento de ratones con CD(Cistanchedeserticola)El extracto previno la pérdida ósea inducida por la ovariectomía in vivo. Nuestros datos, por lo tanto, sugieren que CD(Cistanchedeserticola)puede usarse para estimularhuesoformaciónpara el tratamiento de la osteoporosis.

Cistanche deserticaaumentar la inmunidad

Materiales y métodos

Extracto y materiales de Cistanche deserticola

CD(Cistanchedeserticola)El extracto se adquirió de Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwán). Extracción y aislamiento de CD(Cistanchedeserticola)se siguieron como se describió anteriormente (sobre la base de los datos espectrales, identificaron la composición química que incluye beta-sitosterol, daucosterol, ácido succínico, triacontanol, acteósido, betaína y polisacárido).[17] Los anticuerpos policlonales de conejo específicos para las quinasas reguladas por señales extracelulares p (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminal quinasas (JNK), JNK, p-p65 y p65 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, Estados Unidos). El kit ELISA de osteocalcina se adquirió de Biosource Technology (Nivelles, Bélgica). Los telopéptidos C-terminales del kit ELISA de colágeno tipo I se obtuvieron de Cross Laps (Herlev, Dinamarca). El mutante p38 dominante negativo fue proporcionado por el Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, EE. UU.). El mutante negativo dominante de JNK fue proporcionado por el Dr. M. Karin (Universidad de California, San Diego, EE. UU.). El mutante negativo dominante de ERK2 fue proporcionado por el Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St Louis, EE. UU.).

Cultivo de células

La línea celular de osteoblastos murinos MC3T3-E1 se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, EE. UU.). Las células se cultivaron en un 95 % de aire, un 5 % de CO2 con a-MEM complementado con 20 mm de HEPES y un 10 % de suero de ternera fetal inactivado por calor, 2 mm de glutamina, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg /ml).

Medición de la formación de nódulos mineralizados

La formación de nódulos mineralizados se evaluó como se describe.[18] En resumen, los osteoblastos se cultivaron en un medio que contenía vitamina C (50 mg/ml) y b-glicerofosfato (10 mm) durante dos semanas y el medio se cambió cada tres días. Después de la incubación con CD(Cistanchedeserticola)extracto durante 12 días, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con Tris de 20 mm que contenía NaCl 0,15 m (pH 7,4), se fijaron en etanol al 75 por ciento (v/v) enfriado con hielo durante 30 min y se airearon. seco. La deposición de calcio se determinó mediante tinción con rojo de alizarina-S. Brevemente, las células y la matriz fijadas con etanol se tiñeron durante 1 h con rojo de alizarina-S de 40 mm (pH 4,2) y se enjuagaron abundantemente con agua. La tinción unida se eluyó con cloruro de cetilpiridinio al 10 por ciento (p/v) y se cuantificó el rojo de alizarina-S en las muestras midiendo la absorbancia a 550 nm y comparándola con una curva estándar. Un mol de rojo de alizarina-S se une selectivamente a aproximadamente dos moles de calcio.

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Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

El ARN total se extrajo de los osteoblastos utilizando un kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwán). La transcripción inversa se realizó con 2 mg de ARN total y un cebador oligo(dT).[19,20] La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) se llevó a cabo con TaqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, EE.UU). Se añadió ADNc total (100 ng por 25-ml de reacción) con cebadores específicos de secuencia y sondas Taqman®. Todos los cebadores y sondas de genes objetivo se compraron comercialmente, incluida la b-actina como control interno (Applied Biosystems). Los ensayos de qPCR se llevaron a cabo por triplicado en un sistema de detección de secuencias StepOnePlus (Applied Biosystems). Las condiciones de ciclo fueron 10- min de activación de la polimerasa a 95 grados seguida de 40 ciclos de 95 grados durante 15 sy 60 grados durante 60 s. El umbral se estableció por encima del fondo de control sin plantilla y dentro de la fase lineal de la amplificación del gen objetivo para calcular el número de ciclo en el que se detectó la transcripción (indicado como CT).

Análisis de Western Blot

Los lisados ​​celulares se prepararon como se describió anteriormente.[21,22] Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilo Immobilon (Millipore, Billerica, EE. UU.). Las transferencias se bloquearon con albúmina sérica bovina al 4 % durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se probaron con anticuerpos antihumanos de conejo contra p-65 o p-p65 (1: 1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con peroxidasa (1: 1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencias se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada utilizando una película X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, EE. UU.).

Osteoporosis inducida por ovariectomía

Para este estudio se usaron ratones ICR hembra, de cuatro semanas de edad, 22~28 g. Los ratones se ovariectomizaron bilateralmente bajo anestesia con tricloroacetaldehído (100 mg/kg) y los ratones de control se operaron de forma simulada (Sham) para comparar. Se midió la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo después de la administración oral de varias concentraciones de CD(Cistanchedeserticola)extraer cada dos días durante cuatro semanas. La densidad mineral ósea corporal total y el contenido mineral óseo se determinaron mediante un absorciómetro de rayos X de energía dual (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, EE. UU.) usando un modo para sujetos pequeños como se describió anteriormente.[18, 23] Todos los protocolos cumplieron con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad Médica de China.

análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el software Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, EE. UU.). Los valores dados son SEM medio. El análisis estadístico entre dos muestras se realizó utilizando la prueba t de Student. Las comparaciones estadísticas de más de dos grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza unidireccional con la prueba posthoc de Bonferroni. En todos los casos se consideró significativo P <>

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Resultados

Cistanche deserticolaextracto aumenta la mineralización ósea por osteoblastos Adición de la CD(Cistanchedeserticola)El extracto durante 24 o 48 h no afectó la proliferación de células MC3T3-E1 de osteoblastos de ratón en un ensayo MTT (datos no mostrados). Debido a que la diferenciación de osteoblastos es un proceso complejo que involucra la proliferación y migración celular, también probamos la capacidad migratoria de las células MC3T3-E1 después del tratamiento con CD(Cistanchedeserticola)extracto. Usando ensayos Transwell y de cicatrización de heridas, encontramos que CD(Cistanchedeserticola)el extracto no afectó la migración de osteoblastos (datos no mostrados). La formación de nódulos mineralizados es uno de los marcadores de la maduración de los osteoblastos. La tinción con rojo de alizarina S mostró que se formaron nódulos mineralizados cuando los osteoblastos se cultivaron durante dos semanas en un medio que contenía vitamina C (50 ug/ml) y -glicerofosfato (10 mm), la forma dependiente de la concentración por la adición de CD(Cistanchedeserticola)(Figura 1a). Por lo tanto, CD(Cistanchedeserticola)extraer la formación de nódulos óseos inducida por osteoblastos cultivados, pero no su proliferación o migración. También examinamos el papel de CD(Cistanchedeserticola)extracto en la osteoclastogénesis inducida por RANKL pero no encontró ningún efecto (datos no mostrados).

El extracto de Cistanche deserticola aumenta la fosfatasa alcalina, la proteína morfogenética ósea-2 y la expresión de osteopontina en osteoblastos cultivados

Los osteoblastos diferenciados exhiben una actividad ALP elevada, que se correlaciona con niveles altos de expresión enzimática.[18] Encontramos que el tratamiento con CD(Cistanchedeserticola)el extracto durante 72 h aumentó significativamente la actividad ALP de los osteoblastos (Figura 1b). Dado el papel crucial de BMP-2, ALP y OPN en la diferenciación de osteoblastos, probamos si CD(Cistanchedeserticola)El extracto ejerce su efecto sobre la diferenciación de osteoblastos al regular la expresión de BMP-2, ALP y OPN. Tratamiento de células con CD(Cistanchedeserticola)los extractos aumentaron la expresión de ARNm de ALP, BMP-2 y OPN de una manera dependiente de la concentración (Figura 1c), lo que demuestra que CD(Cistanchedeserticola)extraiga la diferenciación inducida de osteoblastos mediante la regulación positiva de la expresión de ALP, BMP-2 y OPN.

El extracto de Cistanche deserticola aumenta la formación de nódulos óseos a través de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno

Se ha informado que MAPK juega un papel importante enhuesoformación[24,25] por lo que a continuación examinamos si esta vía de señalización está involucrada en la EC(Cistanchedeserticola)mineralización ósea inducida por extractos. Pretratamiento de células con inhibidor de ERK U0126, inhibidor de p38 SB203580 o inhibidor de JNK SP600125 CD reducido(Cistanchedeserticola)extracción de mineralización ósea aumentada (Figuras 2a, 3a y 4a). Además, los inhibidores también bloquearon la CD(Cistanchedeserticola)Expresión de ALP, BMP-2 y OPN inducida por extracción (Figuras 2b–4c). Transfección de células con CD reducida mutante ERK2, p38 o JNK(Cistanchedeserticola)extracto-aumento en la expresión de ARNm de ALP, BMP-2 y OPN (Figuras 2c, 3c y 4c). A continuación, examinamos directamente la activación de ERK, p38 y JNK después de CD(Cistanchedeserticola)extracto de tratamiento. Incubación de células con CD(Cistanchedeserticola)extraiga la fosforilación de ERK, p38 y JNK inducida (Figuras 2d, 3d y 4d). Por lo tanto, ERK, p38 y JNK median el aumentohuesoformacióninducido por CD(Cistanchedeserticola)tratamiento de osteoblastos.

El extracto de Cistanche deserticola aumenta la formación de nódulos óseos a través de la vía del factor nuclear-kB

Como se mencionó anteriormente, la activación de NF-kB es necesaria parahuesoformación.[26,27] A continuación, tratamos los osteoblastos con los inhibidores de NF-kB pirrolidina ditiocarbamato (PDTC) y N-tosil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK) que se adquirieron de Calbiochem (Darmstadt, Alemania) para determinar si la activación de NF-kB es involucrado en CD(Cistanchedeserticola)mineralización ósea inducida por extractos. La Figura 5a muestra que el pretratamiento de los osteoblastos con PDTC o TPCK inhibió la CD(Cistanchedeserticola)la formación de nódulos óseos inducida por el extracto, y también redujo el aumento de la expresión de ALP, BMP-2 y OPN (Figura 5b y 5c). La fosforilación de la subunidad p65 de NF-kB es un indicador de la activación de NF-kB;[28] de acuerdo con esto, encontramos que CD(Cistanchedeserticola)extracto aumentó la fosforilación de p65 en los osteoblastos (Figura 5d). Estos resultados indicaron que la activación de NF-kB es importante para la expresión de ALP, BMP-2 y OPN inducida por extracto de CD y la formación de nódulos óseos.

Figura 4 Participación de c-Jun N-terminal quinasas (JNK) enCistanchedeserticola(CD) mineralización ósea inducida por extracto en osteoblastos. (a) Las células se sembraron en 24-placas de pocillos y se cultivaron en un medio que contenía vitamina C (50 mg/ml) y b-glicerofosfato (10 mM) durante dos semanas. Las células se trataron concomitantemente con CD(Cistanchedeserticola)extracto (26 mg/ml) más SP600125 (3 mM). La formación de nódulos mineralizados se evaluó mediante tinción con rojo de alizarina-S (n=5). (b, c) Las células se pretrataron con SP600125 durante 30 min o se transfectaron con mutante JNK o 24 h seguido de estimulación con extracto de CD y actividad de fosfatasa alcalina (ALP) y ALP, proteína morfogenética ósea (BMP) -2 y La expresión de ARNm de osteopontina (OPN) se midió mediante el kit ALP y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real. ( d ) Las células se trataron con extracto de CD durante los intervalos de tiempo indicados, y la expresión de p-JNK se examinó mediante transferencia de Western. *PAGS< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)grupo tratado con extracto.

Inhibición de la pérdida ósea por extracto de Cistanche deserticola en ratones ovariectomizados

Para examinar el efecto de CD(Cistanchedeserticola)extracto sobre la pérdida ósea, se indujo osteoporosis en ratones hembra mediante ovariectomía. Como era de esperar, los ratones ovariectomizados mostraron una disminución de la densidad mineral ósea corporal total y del contenido mineral óseo (Figura 6a y 6b). Tratamiento con CD(Cistanchedeserticola)El extracto durante cuatro semanas inhibió la pérdida de densidad mineral ósea y contenido mineral óseo de manera dependiente de la dosis (Figura 6a y 6b). Las concentraciones sanguíneas de ALP pueden reflejar la actividad osteoblástica.[29] Como se muestra en la Figura 6c, CD(Cistanchedeserticola)El extracto inhibió la disminución de la actividad de la ALP sérica inducida por la ovariectomía. Además, CD(Cistanchedeserticola)extracto también aumentó el nivel de osteocalcina, un marcador dehuesoformación, y redujo el nivel de telopéptidos C-terminales de colágeno tipo I, un marcador de resorción ósea (Figura 6d y 6e). Por lo tanto, estos hallazgos respaldan la potencia y la eficacia de CD(Cistanchedeserticola)extracto en la prevención de la pérdida ósea in vivo.

Figura 6 Inhibición de la ovariectomía inducida por la disminución de la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo porCistanchedeserticola(CD) extracto. A los ratones hembra ICR se les realizó una operación simulada o se les ovariectomizó. Los ratones ovariectomizados fueron tratados con las concentraciones indicadas de CD(Cistanchedeserticola)extracto por alimentación oral. La densidad mineral ósea corporal total (a), el contenido mineral óseo (b), la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) sérica (c), la osteocalcina sérica (d) y los telopéptidos séricos C-terminales de colágeno tipo I (e), se determinaron cuatro semanas después de la cirugía. Los datos se presentan como SE medio, n=8–10 ratones/grupo. *P < 0.05,="" en="" comparación="" con="" el="" simulacro;="" #p="">< 0,05,="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="">

DISCUSIÓN

Haga clic aquí para obtener información sobre la Parte II (Discusión y conclusión) de este artículo.

De: 'Cistanchedeserticolaextracto aumentahuesoformaciónen osteoblastos' porTe Mao Li^ay otros

---© 2012 Los autores. JPP © 2012 Real Sociedad Farmacéutica 2012Revista de Farmacia y Farmacología, 64, págs. 897–907