Clonación, identificación funcional y análisis de expresión de la chalcona sintasa de Cistanche tubulosa

Resumen: Objetivo

Estudiar la función decalcona sintasa de Cistanche tubulosay el patrón de expresión del gen CtCHS en flores blancas, rojas y moradas.

MétodosEl gen CtCHS se clonó mediante RT-PCR y se realizó análisis bioinformático. El plásmido pET-28a-CtCHS se transfirió a Escherichia coli para inducir la expresión de proteínas mediante IPTG. La proteína recombinante CtCHS se incubó con los sustratos p-cumaroil CoA y malonil CoA, y los productos se detectaron mediante HPLC y MS. El plásmido pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS se transfirió al protoplasto de Arabidopsis thaliana para observar la localización subcelular de la proteína CtCHS. Mediante qRT-PCR se detectó el patrón de expresión del gen CtCHS en las flores de C. tubulosa con tres colores.

ResultadosSe clonó un gen CtCHS. La longitud del marco de lectura abierto (ORF) fue de 1173 pb, codificaba 390 aminoácidos, y el peso molecular de la proteína fue 42 8000.

EXTRACTO DE CISTANCHE ORGÁNICO CON 30% EQUINACOSIDO Y 12% ACTEÓSIDO

CtCHS contenía los residuos catalíticos Cys164, His303, Asn336, que se conservaban en la chalcona sintasa. La proteína CtCHS se expresó en E. coli y se purificó para obtener la proteína recombinante. La proteína CtCHS podría catalizar p-cumaroil CoA y malonil CoA para producir naringenina chalcona. La proteína CtCHS se localizó principalmente en el citoplasma. El gen CtCHS se expresó altamente en flores moradas y rojas, y los niveles de expresión relativos fueron 8,44 y 3,21 veces mayores que en las flores blancas, respectivamente.

Conclusión Se clonó un gen CtCHS de la flor de C. tubulosa y se expresó la proteína. La proteína CtCHS tiene función calcona sintasa y la expresión del gen CtCHS es mayor en las flores más oscuras, lo que indica que el gen CtCHS puede regular el color de la flor de C. tubulosa, lo que sienta las bases para futuras investigaciones sobre el mecanismo de regulación del color de la flor de C. tubulosa.

Palabras clave: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; calcona sintasa; análisis de actividad enzimática; localización subcelular; análisis de expresión

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT es una planta del género Pyreal, que se distribuye naturalmente en el sur de Xinjiang [1] en el área de Hetian de Xinjiang [2]. Las flores de pipa tienen un alto valor medicinal. Sus tallos cárnicos son una de las fuentes de la versión 2020 de "Farmacopea china". [3] La investigación sobre los tallos de carne de cordonus de las flores de pipa ha aumentado, pero hay relativamente pocas investigaciones biológicas sobre sus flores. El período de floración de las flores de pipa es de abril a mayo [4], principalmente Hay tres colores de blanco , rojo y morado Las flores de pipa son ricas en color, pero no se ha informado que sus clases de mecanismo de regulación del color estén relacionadas con el tipo, contenido, contenido y distribución de la estructura del tejido de los pétalos, el pigmento y la regulación de los factores ambientales. y factores genéticos [5]. El pigmento en las flores de las plantas incluye principalmente tres categorías: flavonoides, caroteno y beetina. Color, la gran gama de colores [7]. como las tres variedades de Paeonia Lactiflora Pall.

Aparece como blanco, y el color principal del color contiene el color rojo y la hermosa competencia hace que las flores se presenten como rojo púrpura [8]. El color floral es una característica importante de muchas plantas ornamentales y también es el factor clave que atrae a los insectos rosados ​​[9]. Los estudios han demostrado que se transmite de generación en generación. La mayor frecuencia de visitas de insectos es la planta cistanche de color púrpura oscuro [10]. Para la investigación biológica sobre la investigación genética sintética de cistanoides en las flores de cistanosaurio de la flor tubular, es propicio para aclarar el mecanismo de control de coloración del cordón de la flor tubular, proporcionando una base teórica para mejorar el color de la tecnología de ingeniería genética, promoviendo sus colores más ricos, aumentando la visualización, ampliando el alcance de las aplicaciones.

La ruta biosintética deflavonoidescomienza con elvía fenilpropanoide. La fenilalanina se convierte primero en ácido cinámico bajo la acción de la fenilalanina amonialiasa (PAL), y el ácido cinámico se 4-hidroxila mediante ácido cinámico. La enzima (ácido cinámico-4-hidroxilasa, C4H) y la 4-cumarato coenzima A ligasa (4-cumarato coenzima A ligasa, 4CL) catalizan la reacción para generar 4-cumaroil-CoA. [11]. Una molécula de 4-cumaroil-CoA y tres moléculas de malonil-CoA son catalizadas por la calcona sintasa (CHS) para generar naringenina chalcona, que tienecompuestos flavonoides.El esqueleto básico de la calcona isomerasa, flavanona-3-hidroxilasa, dihidroflavonol 4-reductasa, etc. genera una variedad de flavonoides como isoflavonas, flavonoles, antocianinas, etc. [12]. Como enzima clave en la ruta biosintética de los flavonoides, el CHS regula el contenido de flavonoides en las plantas y también juega un papel importante en la regulación del color de las flores de las plantas [13]. Por ejemplo, el silenciamiento génico postranscripcional de Gentiana scabra Bunge CHS puede inhibir la biosíntesis de antocianinas y provocar un blanqueamiento específico de los lóbulos de la corola [14]. Silenciamiento del gen CHS de Actinidia eriantha Benth. CHS reduce el contenido de antocianinas en los pétalos y hace que el color de los pétalos rojos se vuelva más claro [15]. Por lo tanto, en este estudio, se clonó un gen CtCHS de flores de Cistanche deserticola y se realizaron análisis bioinformáticos, expresión y purificación procariótica, análisis de actividad enzimática, análisis de localización subcelular y análisis de expresión en tres colores de flores para explorar la función de CtCHS. La proteína y el patrón de expresión del gen CtCHS se utilizaron para explorar preliminarmente la relación entre CtCHS y el color de la flor de Cistanche deserticola, lo que sentó las bases para el estudio del mecanismo regulador del color de la flor de Cistanche deserticola.

1 Materiales e instrumentos

1.1 Materiales

Se recolectaron flores de Cistanche tuberosa del condado de Yutian, prefectura de Hotan, Xinjiang, en mayo de 2018. Se siguió el principio aleatorio durante el muestreo y se seleccionaron flores de Cistanche tuberosa con buen estado fisiológico y altura constante de la planta. El profesor Tu Pengfei de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Pekín tomó e identificó tres cepas de Cistanche deserticola con tres colores de flores: blanco, rojo y morado como Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Fueron rápidamente congelados en nitrógeno líquido, almacenados en hielo seco y transportados a Beijing. Se adquirieron células químicamente competentes de E. coli DH5 de Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., y células químicamente competentes de E. coli BL21 (DE3) de Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP El vector se adquirió de Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. La malonil-CoA se adquirió de Sigma Company, 4-cumaroil-CoA, naringenina -chalcona se adquirió de Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., y naringenina se adquirió de Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumentos

espectrofotómetro Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, EE. UU.); instrumento de PCR en gradiente (Eppendorf Company, Alemania); Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia CFX 96, generador de imágenes de gel UVP, instrumento de electroforesis en gel, instrumento de electroforesis de proteínas (BioRad Company, EE. UU.); EnSpire

Lector de microplacas (PerkinElmer Company, EE.UU.); incubadora de temperatura constante (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Oscilador de temperatura total de gran capacidad DHZ-D (Fábrica de equipos experimentales de Taicang); THZ-82Un oscilador de temperatura constante en baño de agua (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); banco de trabajo ultralimpio AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); esterilizador de vapor de alta presión (TOMY Company, Japón); instrumento de agua pura Milli Q (Millipore, Estados Unidos); LC-20Un cromatógrafo de fase líquida de alta eficiencia (Shimadzu Company, Japón); espectrometría de masas de alta resolución UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, EE. UU.); Microscopio confocal láser FV1200 (Olympus Company, Japón).

2 métodos experimentales

2.1 Extracción de ARN y síntesis de ADNc. Las flores de Cistanche deserticola se molieron en nitrógeno líquido y luego se sometieron a un ensayo de extracción de ARN.

El ARN total se extrajo utilizando un kit (Norgen, Cat 17200), la concentración y la calidad del ARN se detectaron mediante NanoDrop 2000C y se seleccionaron muestras de ARN con una proporción A260/A280 entre 1,8 y 2,1 para la síntesis de transcripción inversa de ADNc. Se utilizó la transcriptasa inversa M-MLV (Promega, M170B) para transcribir inversamente el ARN total calificado en ADNc. Las operaciones experimentales se realizaron según las instrucciones.

2.2 Clonación del gen CtCHS

Con base en los datos del transcriptoma de la flor de Cistanche deserticola de nuestro grupo de investigación [16], se seleccionó un CtCHS con un marco de lectura abierto completo y se utilizó el software SnapGene para diseñar cebadores específicos basados ​​en la secuencia del gen (Tabla 1). La amplificación por PCR se realizó utilizando el ADNc de la flor de Cistanche deserticola como plantilla. El sistema de amplificación fue 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, cebadores ascendentes y descendentes (10 μmol/L) 2 μL cada uno, ADNc 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

ADN polimerasa 1 μl, ddH2O 17 μl. Las condiciones de reacción fueron: predesnaturalización a 95 grados durante 3 min; 25 ciclos de desnaturalización a 95 grados durante 15 s, recocido a 55 grados durante 15 s y extensión a 72 grados durante 1 min; y extensión de la reacción a 72 grados durante 5 min. El producto de la PCR se detectó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y se usó el kit de purificación de ADN (Novizan, Cat DC301-01) para la recuperación del gel, y luego el ADN recuperado se purificó mediante un kit de clonación rápida (Novizan, Cat C601-01). El fragmento de ADN se ligó con el vector pCE2 TA/Blunt-Zero, se transformó en células competentes de Escherichia coli DH5 y, después de cultivar durante la noche a 37 grados, se seleccionaron cepas de clones únicos y se enviaron a la empresa para su secuenciación.

Tabla 1 Secuencias de cebadores

2.3 Análisis bioinformático

Utilice el software en línea ProtParam para analizar las propiedades físicas y químicas de las proteínas; utilizar la herramienta en línea Prot Scale para analizar la hidrofilicidad/hidrofobicidad de las proteínas; utilice la herramienta en línea SOPMA para predecir la estructura secundaria de proteínas; utilice el software de análisis en línea SWISS-MODEL para predecir la estructura terciaria de las proteínas; utilizar el software en línea TMHMM Predecir la estructura transmembrana de la proteína; utilizar el software DNAMAN para comparar la homología de CtCHS con las secuencias de aminoácidos de CHS de otras especies; utilice el software MEGA-X para construir un árbol filogenético, utilizando la unión de vecinos (NJ) y la corrección de Poisson. La distancia evolutiva se calcula utilizando el método Bootstrap y el número de repeticiones de Bootstrap es 1000 veces.

Se utilizó UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS para una mayor detección. Las condiciones de la fase líquida fueron columna Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), temperatura de la columna 40 grados, naringenina. , chalcona y naringenina. El volumen de carga de la sustancia de control es de 4 µL y el volumen de carga del producto de reacción enzimática es de 7 µL. Como fase móvil se utiliza agua (A)-acetonitrilo (B). El gradiente de elución es: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 min. , 30%~60% B; 15~20 minutos, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. El caudal volumétrico es 0,3 ml/min. Las condiciones de espectrometría de masas son fuente de iones de electropulverización, nitrógeno como gas portador, presión del gas envolvente de 3,5 MPa, presión del gas auxiliar de 1,0 MPa, presión de pulverización de 3500 V, temperatura capilar de 350 grados, temperatura de calentamiento del gas auxiliar de 200 grados, modos de iones positivos y negativos, escaneo. El rango de iones m/z es 100-1500, la resolución MS completa es 35 000, la resolución dd-MS2 es 17 500, (N)

CE/escalonado nce establecido en 35, 60.

2.6 Localización subcelular de la proteína CtCHS.

Basado en la secuencia CtCHS y el principio de clonación perfecta, se diseñaron cebadores con sitios de corte de enzimas Kpn Ⅰ y BamH Ⅰ, y los fragmentos diana correspondientes se amplificaron mediante PCR. El plásmido pCAMBIA1300-35S-GFP se digirió con endonucleasas de restricción Kpn Ⅰ y BamH Ⅰ, y el fragmento objetivo y el vector se conectaron a través del kit de clonación sin fisuras (Novizan, Cat C115-01) y luego se transfirieron. en células competentes de E. coli DH5. , seleccione cepas de clones únicos para la secuenciación y extraiga plásmidos de las cepas correctas. Los plásmidos pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS y pCAMBIA 1300-35S-GFP se transformaron en protoplastos de Arabidopsis thaliana utilizando PEG4000 y se cultivaron con poca luz durante 8 a 10 h. La localización subcelular de la proteína CtCHS se observó bajo un microscopio láser confocal.

2.7 Análisis del patrón de expresión de CtCHS

Basado en la secuencia CtCHS, se utilizó DNAMAN para diseñar cebadores cuantitativos de fluorescencia en tiempo real, con F-box como gen de referencia interno. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1. La expresión relativa de CtCHS en flores de Cistanche deserticola de diferentes colores se detectó mediante PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real. Utilice TransStart Green qPCR SuperMix (oro completo, AQ101-02) para medir con el método de tinte fluorescente SYBR Green, sistema de reacción: 2 × TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, cebadores ascendentes y descendentes (10

μmol/L) {{0}}.2 μL cada uno, plantilla de ADNc 0,5 μL, agua libre de nucleotidasa 4,1 μL, se usó un método de dos pasos para la reacción y el procedimiento de reacción se basó en el método de Dong Xianjuan et al. [18]. Cada muestra contenía 3 réplicas biológicas y el experimento se repitió tres veces. Los datos experimentales se analizaron utilizando Excel para 2

La expresión relativa de CtCHS se calculó utilizando el método −ΔΔCt y se utilizó GraphPad Prism 8 para realizar análisis de significancia y dibujar histogramas.